《基因工程-5-重組DNA構建與篩.ppt》由會員分享，可在線閱讀，更多相關《基因工程-5-重組DNA構建與篩.ppt（45頁珍藏版）》請在裝配圖網上搜索。

三重組DNA分子構建與篩選,一、粘末端DNA片段的連接,（一）具有相同粘末端的連接,,,,（二）具有不同粘性末端的連接用兩種不同的限制性內切酶對載體和外源DNA進行切割后，在它們兩端會產生非互補的突出端，經DNA連接酶連接后即產生定向重組體。,HindIII,二、平末端DNA片段的連接,（一）直接用T4連接酶連接,（二）同聚物加尾法,優(yōu)點：接“尾”后的載體不能自身環(huán)化，提高了轉化效率。缺點：①可能改變目的基因或載體的閱讀框，影響外源DNA表達②外源DNA無法收回,（三）銜接物連接法,銜接物是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成，具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段。,（四）DNA接頭連接法接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內切酶的粘性末端,（五）PCR引入酶切位點,防止載體自身環(huán)化的措施1、堿性磷酸酶脫磷酸基法2、雙酶切法3、過量法：基因片段：載體（5:1or10:1),,三、重組DNA連接注意事項,第三節(jié)基因轉移,一、重組DNA導入大腸桿菌轉化、電激法二、重組DNA導入植物細胞的方法載體介導、基因槍法三、重組DNA導入動物細胞的方法轉染,一、重組DNA導入大腸桿菌,（一）轉化,將外源DNA分子導入某一宿主細菌細胞的過程都叫轉化。,為了有效地使細菌吸收外源的DNA分子，我們通常要對它們進行一些物理或化學的處理，處理后的細胞吸收外源DNA的能力大大提高，被稱為感受態(tài)細胞。,1、轉化過程E.coli：感受態(tài)細胞＋重組DNA分子加入LB擴增涂布選擇性平板,,,,,,2、DNA分子轉化受體細胞過程①吸收：DNA分子吸附于受體菌表面②轉入：雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進入，另一條鏈降解③自穩(wěn)：進入細胞內的單鏈又復制成雙鏈環(huán)狀DNA④表達：目的基因隨載體同時被復制，轉錄，翻譯,3、質粒DNA的大小及構型對轉化效率的影響,（1）大?。?0Kb，轉化效率很低（2）構型超螺旋＞環(huán)形＞線狀,熱激法（HeatShockMethod）,（三）電激法(electroperation),電激法是利用高壓電脈沖的作用對原生質體或細胞擊出微孔而使基因轉移的一種新方法。,可逆擊穿：擊穿小孔可在一定時間內復原。,不可逆擊穿：擊穿小孔不可修復，處理細胞成活率低。,1.電轉化流程,（1）電轉化感受態(tài)細胞的制備,（2）電轉化操作程序電擊復蘇涂布,（3）電擊杯清洗,二、重組DNA導入植物細胞的方法,（一）載體介導的轉化方法,1、共培養(yǎng)法(cocultivation),（1）原生質體共培養(yǎng)法,取含重組Ti質粒的農桿菌同剛剛長出細胞壁的原生質體作短暫的共培養(yǎng)，促使農桿菌和植物細胞之間發(fā)生遺傳物質的轉化。,,,（2）葉盤共培養(yǎng)法,優(yōu)點：適用性廣，對于那些能被農桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。,2、活體接種(inoculationinvivo),（1）基因槍法,80年代末期，由康奈爾大學的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉化技術的局限。,該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊孔，使目的基因進入受體。,,,基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經濟實惠，也可以得到較好的轉化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。,（2）將DNA包被到微載體上所用的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。,（3）所用動力系統(tǒng)：火藥爆炸力電弧放電高壓氣體,基因槍法的特點：（1）轉化效率高。,（2）受體廣泛。,（3）操作簡單。,（2）微注射法（micro-injection）,微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭—道進入。,顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質或細胞核的基因轉化方法。,,常用的細胞固定方法有3種：一、瓊脂糖包埋法二、多聚賴氨酸粘連法三、吸管支持法,（2）DEAE-葡萄糖轉染技術,（3）電穿孔轉染技術,（4）脂質體載體法,（5）細胞核的顯微注射法,三、重組DNA導入動物細胞的方法,（1）磷酸鈣轉染技術,（6）活體電穿孔技術,（6）活體電穿孔技術,活體電穿孔法(invivoelectroporation)是將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。,活體電穿孔法的特點：靶器官的選擇面廣對導入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB或十幾KB的表達載體,到100～200KB的YAC、BAC基因組,都有成功導入并獲得表達的報道?；铙w電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。,活體電穿孔法在基因治療方面的應用,腦瘤的治療人單核細胞趨化物蛋白基因到大鼠腦瘤治療機體的內分泌系統(tǒng)疾病骨骼肌導入促紅細胞生成素基因,第四節(jié)重組DNA分子的篩選,外源基因與載體連接后轉化大腸桿菌可能的三種情況：,,,,,,,,,,（1）,（2）,（3）,,,,,,,,,,,,轉化,E.coli,一、重組體的篩選,遺傳檢測方法抗藥性標記插入失活β-半乳糖苷酶顯色反應免疫化學方法放射性抗體檢測核酸雜交方法轉譯篩選法,（一）遺傳檢測方法原理：根據載體DNA分子上的篩選標記賦予受體細胞在篩選平板上表型的變化。如抗藥性引起生長與不長；顏色變化等。方法：①插入失活抗生素平板篩選法（pBR322系統(tǒng)）由于外源DNA的插入引起抗藥性失活——插入失活,插入失活-環(huán)絲氨酸篩選法,,,,,,四環(huán)素+環(huán)絲氨酸,氨芐青霉素,②放射免疫篩選法1.放射免疫篩選過程A、制備抗原：培養(yǎng)菌落（噬菌斑）B、制備抗體：免疫動物C、抗原抗體反應D、檢測：放射自顯影E、選出重組體,,,2.放射免疫篩選法優(yōu)點：①可以選出無表型特征的克隆3.放射免疫篩選法缺點：①必須是表達載體②需要放射性物質——同位素：污染昂貴,,,,(三)核酸雜交方法,探針（probe）：用來探知被測物存在的小分子DNA或RNA。,標記物：探針上結合的易被檢測的化合物。,分子雜交（molecularhybridization）：探針DNA或RNA與被測物的互補結合叫分子雜交。,一、基本概念,二、核酸探針類型,雙鏈DNA探針DNA探針核酸探針單鏈DNA探針RNA探針單鏈RNA探針放射性標記探針探針標記非放射性標記探針,,,,核酸探針的類型和稱謂常有以下幾種：,非放射性標記原理,,三、菌落原位雜交,菌落生長轉移到NC膜上DNA釋放和變性固定雜交洗膜放射自顯影查找陽性克隆,四、斑點雜交（Dotblot）,模板制備點膜固定雜交洗膜放射自顯影查找陽性克隆,四、斑點雜交（Dotblot）,五、轉譯篩選法,無細胞翻譯系統(tǒng),1、雜交阻斷轉譯,要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA。,原理：,,2、雜交釋放轉譯,