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1、高效液相色譜法 (3)1第十八章高效液相色譜法第十八章高效液相色譜法經(jīng)典經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑，固定相粒徑100m 且且不均勻不均勻1.HPLC：分離和分析：分離和分析 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑25mm，固定相粒徑，固定相粒徑 流動相極性流動相極性 極性小的組分先出柱極性小的組分先出柱反相色譜法反相色譜法固定液極性固定液極性 流動相極性流動相極性 極性大的組分先出柱極性大的組分先出柱 固定液易被帶走流失，分析固定液易被帶走流失，分析重現(xiàn)性差已被化學鍵合相替代重現(xiàn)性差已被化學鍵合相替代2 2正、反相液液色譜法正、反相液液色譜法NPRP高效液相色譜法

2、 (3)10二、化學鍵合相色譜法二、化學鍵合相色譜法 v以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法鍵合相色譜法(bonded phase chromatography；BPC)v化學鍵合相：采用化學反應的方法將官化學鍵合相：采用化學反應的方法將官能團鍵合在載體表面所形成的固定相能團鍵合在載體表面所形成的固定相 .v化學鍵合相優(yōu)點化學鍵合相優(yōu)點高效液相色譜法 (3)11（一）正相鍵合相色譜法（一）正相鍵合相色譜法 1.1.固定相：極性鍵合相固定相：極性鍵合相如氰基（如氰基（CNCN）、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羥基）或二羥基鍵合硅膠。鍵合硅膠。2.

3、2.流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑整劑3.3.適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等適用范圍：溶于有機溶劑的極性至中等極性的分子型化合物極性的分子型化合物高效液相色譜法 (3)124.4.分離機制分離機制分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)分配：把有機鍵合層作為一個液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解在兩相的溶解吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和吸附：溶質(zhì)與鍵合極性基團間的誘導、氫鍵和定向作用定向作用5.5.分離選擇性：分離選擇性：極性強的組分極性強的組分k k大，后洗脫出柱大，后洗脫出柱, ,t tR R 增大。增大。流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組

4、分流動相的極性增強，洗脫能力增加，使組分k k減小，減小，t tR R 減小。減小。高效液相色譜法 (3)13（二）反相鍵合相色譜法（二）反相鍵合相色譜法1.1.固定相：非極性鍵合相固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C C1818，ODSODS）、辛烷基）、辛烷基（C C8 8）鍵合硅膠）鍵合硅膠 2.2.流動相：流動相：水水+ +與水混溶的極性調(diào)整劑與水混溶的極性調(diào)整劑常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等3.3.應用：最廣。非極性至中等極性的組分。應用：最廣。非極性至中等極性的組分。高效液相色譜法 (3)144.4.分離機制分離機制（多種模型）（多種模型）疏溶劑理論疏溶

5、劑理論（solvophobic theory）排斥排斥締合締合流動相流動相（極性）固定相固定相（非極性）組分組分締合締合解締合解締合締合締合解締合解締合.非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)非極性部分非極性溶質(zhì)或溶質(zhì)非極性部分極性部分極性部分極性部分極性部分非極性部分非極性部分解締合解締合締合締合高效液相色譜法 (3)15溶質(zhì)的保留主要是溶溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分質(zhì)分子與極性溶劑分子間的子間的排斥力排斥力，促使，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生烴基發(fā)生疏水締合疏水締合。不是溶質(zhì)分子與鍵合不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力，相間的色散力，高效液相色譜法 (3)165.5.保留行為的主要影響因

6、素保留行為的主要影響因素(1)(1)、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性越弱，疏水性越強，極性越弱，疏水性越強，k越大，越大，tR也越大也越大。同系物碳數(shù)越多，極性越弱，同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大；越大；引入極性取代基，降低疏水性，引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。值變小。(2)(2)、固定相、固定相鍵合烷基的疏水性隨鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的而增加，溶質(zhì)的k也增大。也增大。硅膠表面硅膠表面鍵合烷基的濃度越大鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的，則溶質(zhì)的k越大。越大。 高效液相色譜法 (3)17(3)(3)、流動相、流動相極性越強，洗脫能力越弱，使

7、溶質(zhì)的極性越強，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越越大大1)1)溶劑比例：水的比例增加，使溶劑比例：水的比例增加，使k增增大大2)pH：影響弱酸、弱堿的離解：影響弱酸、弱堿的離解流動相的流動相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱堿增大；弱堿k變小。變小。高效液相色譜法 (3)18離子抑制色譜法離子抑制色譜法（ion suppression ion suppression chromatographychromatography；ISC ISC ）v用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動相的的pHpH，抑制有機弱酸、弱堿的離解，增加疏，抑制有機弱酸、弱

8、堿的離解，增加疏水締合作用，使水締合作用，使k k變大。變大。v適用于適用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱堿的弱堿高效液相色譜法 (3)19對于弱酸：對于弱酸： 流動相流動相pHpH降低，降低，K K增大，增大，t tR R增大增大對于弱堿：對于弱堿： 流動相流動相pHpH增大，增大，K K增大，增大，t tR R增大增大 注：鍵合相允許使用的注：鍵合相允許使用的pHpH為為2 28 8高效液相色譜法 (3)201.固定相：固定相： ODS柱2. 流動相：水流動相：水+離子對試劑離子對試劑常用離子對試劑：常用離子對試劑： 分析堿類：烷基磺酸鹽分析堿類：烷基磺酸

9、鹽 分析酸類：四丁基季銨鹽等分析酸類：四丁基季銨鹽等（三）反相離子對色譜法（三）反相離子對色譜法 paired ionchromatography；PIC高效液相色譜法 (3)213.離子對模型離子對模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORSO)BH離子對離子對mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流動相流動相通式通式高效液相色譜法 (3)224.4.影響組分保留行為的因素影響組分保留行為的因素(1)(1)離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的溶質(zhì)的k

10、k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的高，溶質(zhì)的k k增大增大 (2)(2)流動相的流動相的pHpH：有利于組分和離子對試劑離：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的子化時（離子對的形成），組分的k k值最大值最大高效液相色譜法 (3)23第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇一、化學鍵合相色譜法的固定相一、化學鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類（一）鍵合相的種類 1.非極性鍵合相非極性鍵合相 ：高效液相色譜法 (3)241.1.非極性鍵合相非極性鍵合相 ：ClSi(R2)C18H37SiOH+Si(R2)C18H37SiOHCl(C

11、(C1818柱柱, ,用于反相色譜用于反相色譜) ) 高效液相色譜法 (3)252.2.弱極性鍵合相：弱極性鍵合相： 醚基和二羥基等鍵合相醚基和二羥基等鍵合相用于反相或正相色譜用于反相或正相色譜3.3.極性鍵合相：極性鍵合相：常用氨基氰基鍵合硅膠常用氨基氰基鍵合硅膠( (氨基柱、氰基氨基柱、氰基柱）柱）一般用于正相色譜一般用于正相色譜 高效液相色譜法 (3)26（1 1）使用過程中不流失；）使用過程中不流失；（2 2）化學穩(wěn)定性好；）化學穩(wěn)定性好；（3 3）適于梯度洗脫；）適于梯度洗脫；（3 3）載樣量大）載樣量大 （二）鍵合相的特點（二）鍵合相的特點高效液相色譜法 (3)27二、化學鍵合相色

12、譜法的流動相二、化學鍵合相色譜法的流動相 （自學）（自學）v對流動相的要求對流動相的要求：與固定相不發(fā)生化學反應。與固定相不發(fā)生化學反應。對試樣有適宜的溶解度。使對試樣有適宜的溶解度。使k在在110范圍范圍內(nèi)，內(nèi)，與檢測器相適應。與檢測器相適應。純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。 高效液相色譜法 (3)28三、分離條件的選擇三、分離條件的選擇 （一）（一）HPLCHPLC中的速率理論中的速率理論1.1.渦流擴散渦流擴散A A=2=2ddp p v球形、小粒度、均勻（球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定

13、相，勻漿）固定相，勻漿高壓填充，以降低高壓填充，以降低A。2.2.縱向擴散縱向擴散B B=2=2DDm m 可以忽略?？梢院雎浴因為因為D Dl l很小，室溫操作，且很小，室溫操作，且U大于大于U最佳最佳，高效液相色譜法 (3)29固定相傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略可以忽略 ，因，因df極小極小流動相傳質(zhì)阻抗流動相傳質(zhì)阻抗Cm 靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗系數(shù)靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm由于部分由于部分流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留忽略）（對于鍵合相sCsmmssmmCCCCCC3.3.傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗高效液相色譜法 (3)30（填充柱）：uCuBAHGC/項忽略）：BuC

14、AHHPLC(原因：化學鍵合相，液原因：化學鍵合相，液體流動相體流動相結(jié)果：結(jié)果：HPLC的實驗條件的實驗條件應該是：應該是：小粒度、均小粒度、均勻的球形化學鍵合相；勻的球形化學鍵合相；低粘度流動相，流速低粘度流動相，流速不宜過快；不宜過快；柱溫適當。柱溫適當。 高效液相色譜法 (3)31（二）影響分離的因素（二）影響分離的因素n由色譜柱（固定相）性能決定，由色譜柱（固定相）性能決定，主要受溶劑種類的影響，主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。受溶劑配比的影響。 2211-4nkkR高效液相色譜法 (3)32(三三)HPLC法分離條件的選擇法分離條件的選擇1. 固定相與裝柱方法的選擇：固定

15、相與裝柱方法的選擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp10m）2. 流動相及其流速的選擇：流動相及其流速的選擇： 選粘度小（降低柱壓）、對樣品有較選粘度小（降低柱壓）、對樣品有較好溶解能力好溶解能力 低流速（低流速（0.81.2ml/min ）高效液相色譜法 (3)333. 柱溫的選擇：柱溫的選擇： 選室溫選室溫25左右左右4洗脫方式洗脫方式 : 等度洗脫、梯度洗脫等度洗脫、梯度洗脫高效液相色譜法 (3)34第三節(jié)高效液相色譜儀v組成組成輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 高效液相色譜法 (

16、3)35一、輸液系統(tǒng)一、輸液系統(tǒng)1.1.高壓輸液泵高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復泵往復泵2.2.雙泵：為了克服流量的脈動。雙泵：為了克服流量的脈動。有串聯(lián)式和并聯(lián)式有串聯(lián)式和并聯(lián)式高效液相色譜法 (3)36( (二二) )輸液泵應具備的性能：輸液泵應具備的性能：1.1.流量精度高且穩(wěn)定流量精度高且穩(wěn)定2.2.流量范圍寬流量范圍寬3.3.能在高壓下連續(xù)工作能在高壓下連續(xù)工作3.3.液缸容積小液缸容積小4.4.密封性能好，耐腐蝕密封性能好，耐腐蝕 高效液相色譜法 (3)37(三三)輸液泵操作注意事項：輸液泵操作注意事項：1.防

17、止固體微粒進入泵體防止固體微粒進入泵體2.流動相不應含有腐蝕性物質(zhì)流動相不應含有腐蝕性物質(zhì)3.防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完4.不超過規(guī)定的最高壓力不超過規(guī)定的最高壓力5.流動相一般應該先脫氣流動相一般應該先脫氣高效液相色譜法 (3)38二、分離和進樣系統(tǒng)二、分離和進樣系統(tǒng) ( (一一) )進樣器進樣器進樣閥進樣閥（六通閥）（六通閥）自動進樣裝置自動進樣裝置高效液相色譜法 (3)39( (二二) )色譜柱（色譜柱（columncolumn） 1.組成組成:由柱管和固定相組由柱管和固定相組成成2.種類種類:分析柱、制備柱分析柱、制備柱 3.性能評價性能評價: H、n、fs、

18、k和和的重復性或的重復性或R。 高效液相色譜法 (3)40三、檢測系統(tǒng)三、檢測系統(tǒng)（一）檢測器（一）檢測器(detector)(detector)的主要性能的主要性能1.1.要求：要求：(1)(1)靈敏度（靈敏度（sensitivitysensitivity）高（檢測限低）高（檢測限低）(2)(2)噪音（噪音（noisenoise）低）低(3)(3)線性范圍（線性范圍（linear rangelinear range）寬）寬(4)(4)重復性（重復性（repeatabilityrepeatability）好）好(5)(5)適用范圍廣（通用型、專屬型）適用范圍廣（通用型、專屬型） 高效液相色譜法

19、 (3)41（二）紫外檢測器（二）紫外檢測器(ultraviolet detector) 1.1.檢測原理：檢測原理：朗伯比爾朗伯比爾 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，響應信定律，響應信號（吸光度）與濃度成正比號（吸光度）與濃度成正比A=Cl2.2.特點：特點：靈敏度較高（靈敏度較高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應用廣（分析、制備）。壞樣品，應用廣（分析、制備）。高效液相色譜法 (3)423.局限：局限： 只能檢測有紫外吸收的只能檢測

20、有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應小物質(zhì)，流動相的截止波長應小于檢測波長。于檢測波長。 4.專屬型、濃度型檢測器專屬型、濃度型檢測器高效液相色譜法 (3)435.紫外檢測器分類紫外檢測器分類(1)(1)固定波長檢測器固定波長檢測器 ：254nm254nm(2)(2)可變波長檢測器：可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），光源：氘燈（和鎢燈）， 200400200400（800800）nmnm，單色器，流通池（試樣），光電，單色器，流通池（試樣），光電管管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似 高效液相色譜法 (3)44(3)光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器 (phot

21、odiode array detector； PDAD)：一系列光電二極管，一個二極管對應一系列光電二極管，一個二極管對應接受光譜上約接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光譜帶寬的單色光 高效液相色譜法 (3)45紫外檢測器紫外檢測器高效液相色譜法 (3)46第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜分析方法高效液相色譜分析方法 v定性分析方法定性分析方法v定量分析方法：定量分析方法：外標法、內(nèi)標法外標法、內(nèi)標法同同GC（自己看）（自己看）高效液相色譜法 (3)47注：注：1) HPLC法中校正因子難從手冊中查到，需自行測定。 待測組分純品內(nèi)標物待測組分純品內(nèi)標物混合進樣混合進樣 fg=(Asmi) / (Aims ) 2) 內(nèi)加法 試樣試樣 準確進樣準確進樣 試樣試樣(含待測含待測)待測組分對照品待測組分對照品 準確進樣準確進樣iiiimAAm參考物質(zhì)參考物質(zhì)參考物質(zhì)參考物質(zhì)iriririimAAAAAAm高效液相色譜法 (3)48本章重點：v化學鍵合相色譜法的原理：（化學鍵合相色譜法的原理：（反相鍵合反相鍵合相色譜法）相色譜法）v化學鍵合相色譜法的固定相、流動相化學鍵合相色譜法的固定相、流動相v化學鍵合相色譜法的分離條件化學鍵合相色譜法的分離條件v高效液相色譜中的速率理論高效液相色譜中的速率理論v定量分析方法定量分析方法v紫外檢測器紫外檢測器