組織制片技術(shù),病理組織制片技術(shù) 定義,要實現(xiàn)對病變組織的顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查，需要將獲得的病變組織制片。我們將切片制作所采用的一系列技術(shù)。,組織制作基礎(chǔ)制作流程,封片 染色 烤片 貼片 展片 切片 包埋 浸蠟 透明 脫水 洗滌 固定 取材,一、取材 定義,按照病理檢查的目的和要求，切取適當(dāng)大小和數(shù)量的組織塊，用于制作組織切片的過程。,切片刀,取材 要求,(1)材料新鮮：取材組織愈新鮮愈好，人體組織一般在離體后，動物組織在處死后迅速固定，以保證原有的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。 (2)組織塊的大?。核〗M織塊較理想的體積為2.0cm2.0cm0.3cm，以使固定液能迅速而均勻地滲入組織內(nèi)部，但根據(jù)制片材料和目的不同，組織塊的較理想體積也不同，如制作病理外檢、科研切片，其組織塊可以薄取0.10.2cm即可，這樣可以縮短固定脫水透明的時間，若制作教學(xué)切片厚取0.3 0.5cm，這樣可以同一蠟塊制作出較多的教學(xué)切片。 (3)勿擠壓組織塊: 切取組織塊用的刀剪 要鋒利，切割時不可來回銼動。夾取組織時切勿過緊，以免因擠壓而使組織、細(xì)胞變形。,4)規(guī)范取材部位: 要準(zhǔn)確地按解剖部位取材，病理標(biāo)本取材按照各病變部位、性質(zhì)的不同，根據(jù)要求規(guī)范化取材。 (5)選好組織塊的切面:根據(jù)各器官的組織結(jié)構(gòu)，決定其切面的走向?？v切或橫切往往是顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，如長管狀器官以橫切為好。 (6)保持材料的清潔:組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用水沖洗干凈后再放入固定液中。 (7)保持組織的原有形態(tài):新鮮組織固定后，或多或少會產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，有時甚至完全變形。為此可將組織展平，以盡可能維持原形。,取材臺,二、固定 定義,將組織浸入某些化學(xué)試劑。使組織細(xì)胞內(nèi)所含物質(zhì)盡量保持在生活狀態(tài)時形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置的過程。,固定 目的,防止自溶和腐敗 凝固或沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì) 硬化組織 增加組織的折光率,固定 方法,(1)小塊組織固定法：這是最常用的方法，從人體或動物體取下的小塊組織，須立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，通常，標(biāo)本與固定液的比例為1:420，但組織塊不宜過大過厚，否則固定液不能迅速滲透。故取組織塊的大小一般為2.0cm2.0cm0.3cm。 (2)注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部，或需要對整個臟器或整個動物體進(jìn)行固定。這時宜采用注射固定或灌注固定法。將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個組織和全身，從而得到充分的固定。 (3)蒸汽固定法：比較小而厚的標(biāo)本，可采用鋨酸或甲醛蒸汽固定法。如血液涂片，則應(yīng)在血片未干燥前采用鋨酸或甲醛蒸汽接觸固定。,常用固定液 特性,滲透力強(qiáng)，能迅速滲入組織內(nèi)部 不會使組織過度收縮或膨脹 能硬化、固定組織，使細(xì)胞成分的形態(tài)和位置與生活狀態(tài)時相似。 使組織對染料產(chǎn)生較強(qiáng)的親和力，并產(chǎn)生較佳的折光率。,常用的固定液,單純固定液 10%甲醛（福爾馬林）：甲醛濃度為40%，指10ml甲醛加入90ml的水配成的。 乙醇（80%90%最好） 乙酸（醋酸、冰醋酸） 紅色字體為常用固定液,固定液,中性甲醇液： 甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g配制而成，PH值達(dá)到。此固定液是人體組織和動物組織常用之固定液，特別是作免疫組織化學(xué)染色固定時效果較好。 乙醇-醋酸-甲醇液 乙醇-甲醇液（AF液）： 95%或無水乙醇90ml，40%甲醛10ml配制而成 Bouin液 Zenker液,混合固定液,紅色字體為常用固定液,固定的注意事項,及時固定（夏天超過4h，冬天超過24h組織會干涸、自溶、腐敗。） 固定容器宜大 固定液應(yīng)足量（為被固定組織體積的1020倍） 防止組織變形 確定恰當(dāng)?shù)墓潭〞r間（1224h）,固定液,組織固定的常見問題,固定液使用時間較長，有效濃度降低 固定時間正常， 但固定時間效果差 固定液的量不足 標(biāo)本過薄 標(biāo)本扭曲變形，過脆過硬 固定液濃度過高，過程過強(qiáng) 固定時間長 標(biāo)本之間重疊或與容器壁、底部緊貼 標(biāo)本局部固定不良 標(biāo)本過多，容器太少 標(biāo)本輕，漂浮于固定液面 標(biāo)本過大，過厚 標(biāo)本中心固定不透 固定液滲透力強(qiáng)，濃度高使組織表層迅速硬化 固定時間短 固定液失效,固定不充分 固定充分,三、洗滌、脫水、透明,洗滌 定義,用水或乙醇等組織經(jīng)過固定處理后， 未與組織結(jié)合的固定液及沉淀物清洗掉 的過程。,洗滌 目的,去掉未與組織結(jié)合的固定液及沉淀物 避免組織中留有較多的固定液而妨礙脫水 組織中生成的沉淀物或結(jié)晶而影響染色和觀察 可減少甲醛色素,洗滌的方法,含水固定液的洗滌方法（常用的是甲醛，用自來水沖洗即可） 含乙醇固定液的洗滌方法（用乙醇或乙醇混合液固定的組織，一般不需要清洗） 特殊固定液的洗滌方法（使用的固定液不同，洗滌的方法也不一樣）,脫水 定義,標(biāo)本經(jīng)過固定和沖洗后，組織中含有較多的水分，必須將組織塊內(nèi)的水分置換出來，這一過程。,無論是用石蠟切片，還是用火棉膠切片，都必須除去組織中所含水分，因含水組織與石蠟、火棉膠等包埋材料不相容，常用的脫水劑為一系列不同濃度的乙醇。,及時的進(jìn)行核對,脫水 目的,組織塊經(jīng)鞏固定和水洗后，含有大量水分，而水與苯、二甲苯等透明劑不混溶,故在組織前必須用能與透明劑相混合的脫水劑(如乙醇等),把組織內(nèi)的水分置出來,為下一步做準(zhǔn)備。,常用的脫水劑,乙醇（最常用的脫水劑） 沸點78.4，脫水能力強(qiáng)，能硬化組織，可較好地與二甲苯混合。 脫水的步驟是：80%、90%、95%、100%各種濃度乙醇2小時，此過程可用脫水機(jī)自控完成。 柔嫩組織的脫水應(yīng)從50%或30%乙醇開始 組織在高濃度乙醇（無水乙醇）中留置時間不宜過長。,丙酮 沸點56，可用于染色前后的脫水，對組織的脫水作用，收縮作用均比乙醇強(qiáng)，價格較高，一般很少單純使用。,丙酮也是一種脫水能力很強(qiáng)的脫水劑，但因其脫水能力很強(qiáng)，對組織有劇烈收縮作用，在制作科研、教學(xué)切片時一般不用該試劑。因乙醇、丙酮等不溶于石蠟，還要經(jīng)過一個能溶于石蠟的溶劑替代過程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、三氯甲烷、水楊酸甲酯等,異丙醇 是乙醇的良好的代用品，不含水，可代替無水乙醇。,脫水的方法,自低到高溶度依次進(jìn)行，使組織中所含水分逐漸減少直至被脫水劑代替。,脫水機(jī),透明 定義,用某些化學(xué)試劑將組織中的脫水劑置換出來，以利于浸蠟和包埋，因組織塊浸入這此試劑后常呈半透明狀,透明 目的,透明是制片過程中很重要的環(huán)節(jié)。大多數(shù)脫水劑不能和包埋劑（如石蠟）混溶，而透明劑即可與脫水劑混溶，又能和包埋劑（如石蠟）混溶，能起到橋梁作用。,常用的透明劑,苯 甲苯 二甲苯（最常用的透明劑） 三氯甲烷 汽油 香柏油 冬青油 松油醇,常用的透明 方法,將脫水后的組織塊先用乙醇-二甲苯混合液處理或直接浸入透明劑中，置換透明劑23次即能達(dá)到目的。 透明的時間的長短取決于標(biāo)本的種類和組織塊的厚薄，一般活檢標(biāo)本透明1520min即可。,四、浸蠟、包埋,浸蠟 定義,經(jīng)過透明的組織塊在溶化的石蠟中浸漬，使組織中的透明劑被完全置換出來的過程,浸蠟的 目的,使石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑 。,浸蠟的 種類,石蠟 明膠 火棉膠 樹脂 碳蠟,又是包埋劑。 既是透明劑，,浸蠟的方法,熔點：5658 溫度：5860（高于石蠟熔點23）,浸蠟的 注意事項,首先，應(yīng)保證所用石蠟的質(zhì)量，盡量不含雜質(zhì)，否則易造成切片刀刀口受損或切片破碎、劃痕增多。 其次，浸蠟用的石蠟熔點應(yīng)控制在5558。蠟溫過低，浸蠟不良；蠟溫過高回燙傷組織，是組織收縮、變硬、切片時易脫片、卷片。 再次，要控制好浸蠟時間。時間過短，蠟沒有完全滲入組織、組織過軟；時間過長，造成組織硬脆。兩者均可造成切片困難。另外，應(yīng)盡量去除沾在組織上的二甲苯，在浸蠟。,浸蠟機(jī),包埋 定義,將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯螅M織即被包在其中稱蠟塊，此過程稱為包埋。,包埋的目的,有利于組織塊的妥善保存 有利于切成薄片 可使組織具有一定硬度和韌性,包埋方法,石蠟包埋法（最常用） 火棉膠包埋法 碳蠟包埋法 明膠包埋法,包埋的注意事項,包埋時，框要比組織塊大，保證蠟塊 組織周圍都有蠟邊，對管、腔、壁組織要垂直包埋，而胃、腸、膽囊等組織，應(yīng)將能看到的組織學(xué)各層面作為切面，其他組織則將切面朝下，小塊多顆組織盡量放在一起并保持在同一水平面；包埋的蠟質(zhì)不能含有雜質(zhì)、紙絮、縫線等異物，最好是經(jīng)過多次溶化、沉淀過的蠟。以利于切片。,包埋機(jī),組織包埋盒,四、切片,常用的切片方法,石蠟切片 冰凍切片 火棉膠切片,切片前準(zhǔn)備,(1)修整蠟塊 可視其組織的大小，在組織邊緣約0.10.2cm處，切去余蠟部分。,否則易造成組織皺縮不平。,(2)準(zhǔn)備好切片用具,切片刀 毛筆 眼科鑷子（彎） 漂烘溫控儀,(3)安裝蠟塊,將修好的蠟塊安裝在金屬或木制持蠟器上,(4)安裝切片刀,將切片刀安裝在切片機(jī)的刀臺上，把刀臺上的緊固螺絲旋緊，使切片時不產(chǎn)生振動，能保持一定的切片厚度,組織切片刀,(5)切片的厚度,切片機(jī)的厚度調(diào)節(jié)器上刻有050m或025m，可任意選擇其厚度，石蠟切片的厚度一般在46m,切片制作過程,將切片刀安裝于刀架上（調(diào)整好刀的角度，一般為2030左右） 將蠟塊固定在切片組織塊夾具上 調(diào)整組織塊夾具的調(diào)節(jié)蠟旋，使蠟塊切面與刀口平行。 先粗修（ 3050um ） 細(xì)修（ 10um ）,切片的注意事項,切片前蠟塊要冷凍，但不能把剛包埋好的熱蠟塊冷凍，否則蠟塊會產(chǎn)生裂痕，一夾就碎。 蠟塊裝機(jī)時，應(yīng)注意組織包埋的方向，組織的層次、纖維、肌肉等走向應(yīng)與切片刀平行。 蠟塊在切片機(jī)固定加緊后要修塊，組織塊上下留邊各2mm,蠟片厚度一般在3-5um 同一把切片刀每次要固定角度 切片有縱紋,可能與切片刀有小缺口或修塊時未把雜物去除,以及石蠟不潔有關(guān),切片機(jī),五、展片,展片 定義,連續(xù)轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)輪，切片的蠟片相連成狀，需要將其展平整才能貼在載玻片上，此過程為展片。,展片,撈片,展片困難時，可先將蠟帶放入30%乙醇處展，在用載玻片撈起蠟帶放入溫水中。待蠟帶中的組織完全展平后，即可將其撈出，稱為撈片。,撈片,六、貼片、烤片,貼片、烘片,待切片在恒溫水面上充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中段處傾去載玻片上的余水，置入6065恒溫箱內(nèi)或切片漂烘溫控儀的烘箱內(nèi)烤片1530分鐘，脫去溶化組織間隙的石蠟。,烤片機(jī),七、染色,染色 定義,用染液對組織切片進(jìn)行處理，使組織中的不同成分被染上相應(yīng)的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，以利于顯微鏡觀察和分析的方法。,常用的染色方法,蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin）染色法 簡稱H.E染色法。 這種方法對任何固定液固定的組織和應(yīng)用各種包埋法的切片均可使用。,蘇木素是一種堿性染料,可使組織中的嗜堿性物質(zhì)染成藍(lán)色，如細(xì)胞核中的染色質(zhì)等；伊紅是一種酸性染料，可使組織中的嗜酸性物質(zhì)染成紅色，如多數(shù)細(xì)胞的胞質(zhì)、核仁等在H.E染色的切片中均呈紅色。,H.E染色程序如下,脫蠟 脫苯 復(fù)水 染色 脫水 透明 封固,切片脫水透明要徹底,染色后，要徹底脫水透明，才能進(jìn)行樹膠封蓋，成為永久標(biāo)本。如果脫水透明不徹底，封片后呈白色霧狀，鏡下模糊不清，過一段時間染片就褪色。脫水要經(jīng)過多次無水乙醇，也可使用石炭酸二甲苯進(jìn)行脫水。如采用后者，染片要經(jīng)過多次二甲苯以除去石炭酸。,注意,切片在染色前必須脫蠟干凈：未完全脫蠟的組織切片，染色后組織和細(xì)胞模糊不清。脫蠟要用兩級或三級脫蠟劑如二甲苯，時間為1020分鐘，應(yīng)視所用二甲苯的新舊以及室溫情況而定。脫蠟時間寧可長些，不應(yīng)過短,一張高質(zhì)量的HE切片要求,1. 切片完整、貼片恰當(dāng) 2. 切片較薄而均勻 3. 無皺折 4. 無刀痕 5. 染色清晰、核漿分明、透明度好 6. 無固縮、龜裂、污染 7. 封膠適當(dāng)、玻片清潔 8. 字體端正、號碼清楚,切片完全干涸，會使組織收縮、割裂，形成所謂”龜裂”現(xiàn)象。也會使部分細(xì)胞核透明不良，看起來像黑色的細(xì)胞核。 完成染色后，每張片子要在顯微鏡下觀察，檢查制片過程中有沒有發(fā)生差錯。,八、封片,封片注意事項,所用樹膠濃度要適中 樹膠用量多少應(yīng)根據(jù)組織大小、厚薄而定 應(yīng)迅速敏捷滴膠 封片時，切片上應(yīng)保留適當(dāng)?shù)亩妆?，以防干封，產(chǎn)生氣泡。 為防止氣泡，封片時，樹膠不宜攪動。 如遇有小泡時可用鑷子輕壓蓋玻片，排除氣泡。,謝謝！,