實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 提綱： n實(shí)時熒光定量PCR原理 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理 n實(shí)時熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對定量 相對定量 n定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素 n平臺定量PCR儀器介紹 實(shí)時熒光定量PCR定義： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用 熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR 進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法 。 與普通PCR的區(qū)別 n普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。 n實(shí)時定量PCR技術(shù)： 實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起 始模板進(jìn)行定量。 n熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個 值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意 位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景） 熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 n每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所 經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 定量PCR的數(shù)學(xué)原理 斜率與擴(kuò)增效率 熒光定量PCR化學(xué)原理 非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 1、SYBR Green 法 SYBR Green 熔解曲線分析 SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn) n優(yōu)點(diǎn): n對DNA模板沒有選擇性 n適用于任何DNA n使用方便-不必設(shè)計復(fù)雜探針 n非常靈敏 n便宜 2、TaqMan探針法 TaqMan作用機(jī)理 TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn) Real-time PCR 方法應(yīng)用 n絕對定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達(dá)研究 n相對定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究 絕對定量與相對定量的定義 絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量 n絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。 標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類： n含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒 n含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA nPCR的產(chǎn)物 絕對定量：從熒光到拷貝數(shù) 相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量 n內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是-actin 、GAPDH基因等看家基因 n在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定 ，受環(huán)境因素影響小 n內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組 數(shù)量 相對定量：參照因子Calibrator 相對定量分析方法1 -Ct 前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏 差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗(yàn)樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計算表達(dá)水平比率： 2 CT=表達(dá)量的比值 相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同 待測樣品目的基因濃度 待測樣品內(nèi)參基因濃度 F= 對照樣品目的基因濃度 對照樣品內(nèi)參基因濃度 定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素 樣品 DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取 1 uL 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法 復(fù)管測試 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù) 重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計學(xué)要求 平臺PCR儀介紹 ABI 7500 fast Rotor gene 6500HRM MJ Opticon 2 謝謝！