第三章 消毒與滅菌,1滅菌：應(yīng)用物理或化學(xué)方法殺滅物體中所有的病原微生物、非病原微生物以及芽胞和霉菌孢子的方法。 2消毒：應(yīng)用物理或化學(xué)方法殺滅物體中的病原微生物，而對非病原微生物及芽胞，孢子不要求全部殺死。 3防腐：應(yīng)用物理或化學(xué)方法阻止和抑制微生物的生長繁殖的方法。 4無菌操作法：防止或杜絕一切細菌進入動物體或其他物體的方法。 5濾過除菌：液體或氣體通過濾過作用除去其中所存在的細菌。一般用0.22微米濾膜，但不能除去病毒，霉形體及L型細菌。,介紹幾個基本概念,第一節(jié) 物理因素,溫度 干燥 滲透壓 輻射 過濾 其他物理因素,一、溫度 （一）高溫對微生物的影響,高溫對微生物有明顯的致死作用，其主要原因是高溫能使菌體蛋白質(zhì)變性或凝固，酶失去活性，核酸結(jié)構(gòu)遭到破壞等，從而導(dǎo)致其死亡。 多數(shù)細菌，酵母菌和霉菌的營養(yǎng)細胞和病毒在50-65 10 min可以致死。 細菌芽孢，在121 下20min才能致死， 同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。,干熱滅菌(dry heat sterilization ) 焚燒滅菌法：常用于廢棄物動物尸體等處理。 燒灼滅菌法：是直接火焰滅菌，如接種環(huán)滅菌。 烘烤滅菌法；實驗室用干燥箱烘。一般是1602小時即可達到滅菌目的。,濕熱滅菌(mosist heatsterilization) 在同溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好；因為： a比干熱更易使菌體蛋白凝固。 b濕熱穿透力強； c濕熱可以釋放大量潛熱。,濕熱滅菌法 高壓蒸汽滅菌法 煮沸消毒法 流通蒸汽消毒法 間歇蒸汽滅菌法 巴氏消毒法,高壓蒸汽滅菌法 是濕熱滅菌中最好的方法， 通常1.05kg/cm2,的壓力下面 （此時溫度121）處理15 30min。要排冷空氣，否則 會形成假壓力，雖然壓力達 到要求，溫度卻達不到相應(yīng) 溫度，而影響滅菌效果。,B、煮沸消毒法 物品在水中煮沸 15min，可殺死所有營養(yǎng)細胞和一部分芽孢。 在水中加入的a2CO3 或的石碳酸效果更好。此法適合注射器和解剖用具的消毒。,C、間歇滅菌法(fractional sterilization） 是用常壓蒸汽反復(fù)幾次進行滅菌的方法。 主要用于不宜高壓滅菌的培養(yǎng)基，不耐熱的藥物和營養(yǎng)物等 方法是將待滅菌物品置于蒸鍋內(nèi)加熱到沸騰維持15-30min殺死營養(yǎng)細胞，取出冷卻后在37恒溫培養(yǎng)24小時，使芽孢萌發(fā)，再用此法滅菌，反復(fù)三次，即可達到滅菌目的。,D、巴氏消毒法(pasteurization) 是食品（牛奶）釀造（啤酒）工業(yè)中常用的方法。 具體做法是6365處理30min或7172度處理15 s,速冷卻至10下。 這樣即可殺死病原微生物。又不致?lián)p壞營養(yǎng)，可保留食品飲料原有風(fēng)味。 d) 為節(jié)省時間，又達到巴氏消毒的效果，現(xiàn)多用高溫瞬時滅菌132下1-2 s。,（二）低溫對微生物的影響,常溫冰箱保存細菌和病毒：（細菌40；病毒2070）。 低溫保存食品應(yīng)迅速冷凍，否則擾亂細胞膠體狀態(tài)，使水分形成結(jié)晶，冰結(jié)晶還能機械地刺傷菌體胞膜，胞壁。 冷凍真空干燥法：采取迅速冷凍和抽真空除水原理；如凍干疫苗和凍干菌種。,二 、干燥,水分是微生物的正常生命活動必不可少的。干燥會導(dǎo)致細胞失水而造成代謝停止以致死亡。 微生物的種類，環(huán)境條件，干燥的程度等均影響對微生物殺滅的效果。休眠孢子抗干燥能力也很強，在干燥條件下可長期不死，這一特性已用于菌種保藏，如用砂土管來保藏有孢子的菌種。 在日常生活中也常用烘干、曬干和熏干等方法來保存食物。,三、滲透壓,細菌處于低滲液中，細胞會吸水膨脹乃至破裂，稱胞漿壓出。 細胞處于高滲液中會脫水，引起細胞質(zhì)和細胞壁分離，稱質(zhì)壁分離，導(dǎo)致死亡。 等滲溶液對微生物生長有利,四、輻射,輻射是能量通過空間傳遞的一種物理現(xiàn)象。 可見光線 肉眼可見的光線是在紅外線和紫外線之間，波長為400800nm。 日光 利用日光暴曬是常用的簡易消毒方法，許多細菌繁殖體在日光直射下2h很易死亡。,紫外線：,殺菌機理：,波長200300m的紫外線具有殺菌作用,干擾DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄,紫外線穿透力較弱,不耐熱物品的表面消毒,應(yīng)用范圍：,特點：,殺菌機理：,應(yīng)用范圍：,電離輻射：,包括高速電子、x射線和 射線。,產(chǎn)生游離基,破壞DNA。,一次性醫(yī)用塑料制品的消毒，,食品的消毒不破壞其營養(yǎng)成分。,五、濾過除菌法,濾菌器:用物理阻留的方法，將液體或空氣中的細菌除去,以達到除菌目的。含有微細小孔0.22微米,只允許液體或氣體通過，而大于孔徑的細菌等顆粒不能通過。 適用范圍：血清、毒素、抗生素以及空氣等的除菌。,濾菌器,六 、其他物理因素,超聲波 超聲波是由超聲波發(fā)生器產(chǎn)生的，對細胞有破壞作用，能使大多數(shù)細胞裂解死亡。 微波 微波是一種波長短而頻率較高的電磁波。微波對微生物的殺菌作用，主要是由于微生物在微波電磁場作用下，吸收微波的能量而產(chǎn)生熱效應(yīng)所致。,第二節(jié) 化學(xué)因素,各種消毒劑可按其作用水平分為3類： （1）高效消毒劑：可以殺滅一切微生物，包括細菌繁殖體、細菌芽孢、結(jié)核桿菌、真菌和病毒等。這類消毒劑又稱為滅菌劑。 如甲醛、戊二醛、過氧乙酸和環(huán)氧乙烷等。 （2）中效消毒劑 除細菌芽孢外，可殺滅各種微生物。如乙醇、酚、含氯消毒劑和碘消毒劑等。 （3）低效消毒劑 可殺滅細菌繁殖體、真菌和有囊膜病毒，但不能殺滅細菌芽孢、結(jié)核桿菌和無囊膜病毒。如新潔爾滅、洗必太等。,一、常用消毒劑的實用性能 見下表,二、影響消毒劑作用的因素,消毒劑的性質(zhì) 消毒劑的濃度與作用時間 微生物的類型及數(shù)量 環(huán)境中有機物的存在,三、選擇適當?shù)南緞?殺菌譜廣、有效濃度低、作用快。 性質(zhì)穩(wěn)定、易溶于水、不易受酸堿影響。 無腐蝕性、無毒；不易殘留。 價格低、便于運輸，可長期保存。,第三節(jié) 生物因素,共生：兩種或多種生物生活在一起時，彼此并不損害而相互有利，稱為共生。 寄生：一種生物從另一種生物獲得所需的營養(yǎng)，賴以為生，并對后者呈現(xiàn)傷害作用者，稱為寄生。 拮抗：當兩種微生物生活在一起時，一種微生物能抑制或殺死另一種微生物，此現(xiàn)象稱為拮抗。 協(xié)同：兩種或多種生物在同一環(huán)境中，互相協(xié)助，共同完成某種作用，而為其任何一種所不能單獨達到。,一、抗生素與細菌素,（一）抗生素 是某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的能抑制或殺滅其他微生物的一種化學(xué)物質(zhì)。它主要來源于放線菌、某些真菌和細菌等。 抗生素的作用機理： a.干擾細菌細胞壁的合成 b.影響細胞膜的通透性 c.阻礙菌體蛋白質(zhì)的合成 d.改變核酸代謝,（二）細菌素 大腸桿菌產(chǎn)生的細菌素稱大腸菌素；葡萄球菌產(chǎn)生的稱葡萄球菌素；霍亂弧菌產(chǎn)生的稱弧菌素等，每類細菌素又可分為不同的型別；細菌素僅對近緣細菌有作用。,1928年A.Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素,澳大利亞病理學(xué)家霍華德.弗羅里與弗萊明1940提純出青霉素。 共同獲得1945年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎.,三、 噬菌體,病毒種類很多，根據(jù)病毒寄生的對象來分，有植物病毒、動物病毒和微生物病毒。 噬菌體：是病毒中的一種，一般把侵染細菌、放線菌的病毒叫噬菌體。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌體） 噬菌體在自然界廣泛存在，在1995年發(fā)表的ICTV的病毒分類與命名第六次報告中共報道了4000余種，分別劃歸為49個病毒科. 據(jù)Bradley(1967)歸納，噬菌體共有六類形態(tài)。,1、組成：主要由蛋白質(zhì)和核酸組成。 2、基本形態(tài)：蝌蚪形、微球形和纖絲形。,（一）噬菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與組成,以大腸桿菌T4噬菌體為例 頭部：廿面體對稱結(jié)構(gòu)，由蛋白質(zhì)衣殼構(gòu)成，內(nèi)含一條DNA。 頸部：薄盤狀，附頸須。 尾鞘：長95nm, 衣殼粒螺旋對稱；可伸縮。 尾髓:中空，DNA可由此進入細胞。 基板: 六角形盤狀物，其上有刺突、尾絲。 刺突: 有吸附功能。 尾絲: 有識別吸附功能。,大腸桿菌T4噬菌體構(gòu)造,3、蝌蚪形噬菌體的構(gòu)造,（二）、噬菌體(phage)的繁殖,噬菌體并沒有個體的生長過程，而只有其基本成分的合成和裝配，即首先將各個部件合成出來，然后裝配，所以一般將噬菌體的繁殖稱做復(fù)制。 根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系： 烈性噬菌體：指感染宿主細胞后，能夠使宿主細胞裂解的噬菌體. 溫和噬菌體（或溶源性噬菌體）：噬菌體感染細胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細胞裂解的噬菌體。,烈性噬菌體的繁殖過程一般分為五個階段： 即吸附、侵入、復(fù)制、裝配和釋放。,1、烈性噬菌體的繁殖,吸附：噬菌體和宿主細胞上的特異性吸附部位進行特異性結(jié)合，噬菌體以尾絲牢固吸附在受體上后，靠刺突“釘”在細胞表面上。 侵入：核酸注入細胞的過程。噬菌體尾部所含酶類物質(zhì)可使細胞壁產(chǎn)生一些小孔，然后尾鞘收縮，尾髓刺入細胞壁，并將核酸注入細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼留在細胞外。 復(fù)制 ：包括核酸的復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。噬菌體核酸進入宿主細胞后，會控制宿主細胞的合成系統(tǒng)，然后以噬菌體核酸中的指令合成噬菌體所需的核酸和蛋白質(zhì)。,裝配： 主要步驟有： DNA分子的縮合通過衣殼包裹DNA而形成頭部尾絲及尾部的其它部件獨立裝配完成頭部與尾部相結(jié)合最后裝上尾絲，至此，一個個成熟的形狀、大小相同的噬菌體裝配完成。,釋放： 方式： 裂解：多以裂解細胞的方式釋放。 分泌：噬菌體穿出細胞，細胞并不裂解。 通常情況下，一個噬菌體通過上述五個過程能合成100300個噬菌體。烈性噬菌體的這種生長繁殖方式也稱為一步生長，,一步生長曲線,實驗設(shè)計依據(jù)：1個菌體被1個噬菌體感染,避免二次吸附；細菌群體被噬菌體同步感染。 實驗過程: 敏感菌10ml Phage 1ml 混勻，5min,使之吸附 離心或用抗phage血清處理, 去除過量phage 高倍稀釋,吸附phage的菌懸液(避免多次吸附) 37培養(yǎng),定時取樣,取樣人為裂解處理（每5min） 樣品中加入氯仿裂解細胞,24-48h,裂解液加入敏感菌液中,適當稀釋混合液,涂布于瓊脂培養(yǎng)基上,計數(shù)噬菌斑,噬菌斑: 概念：將少量噬菌體與大量敏感菌混合培養(yǎng)在營養(yǎng)瓊脂中，在平板表面布滿宿主細胞的菌苔上,可以用肉眼看到一個個透明的不長菌的小圓斑，稱為噬菌斑。(每個噬菌斑一般是由一個噬菌體粒子形成的。) 應(yīng)用: 噬菌斑可用于檢出、分離、純化噬菌體和進行噬菌體的計數(shù)。,噬菌斑,以培養(yǎng)時間為橫坐標,以噬菌斑數(shù)為縱坐標,繪制成的曲線為一步生長曲線。 可分以下階段： 潛伏期 裂解期 穩(wěn)定期,一步生長曲線,潛伏期：從噬菌體吸附細菌到細菌細胞釋放 新的噬菌體之前的這段時期.曲線平行于橫軸，噬菌體數(shù)無變化.樣品中無游離的噬菌體。(潛伏期前的噬菌斑數(shù)是噬菌體數(shù),也就是感染噬菌體的細菌數(shù)). 裂解期：曲線直線上升,子代噬菌體不斷釋放到培養(yǎng)基中,直到達到一個極限. 穩(wěn)定期:感染細胞后復(fù)制的子代噬菌體全部釋放，噬菌斑數(shù)穩(wěn)定，一次感染結(jié)束。,裂解量:每一受感染細胞所釋放的新的噬菌體的 平均數(shù)。 穩(wěn)定期噬菌斑數(shù) 裂解量 = 潛伏期噬菌斑數(shù) 不同的噬菌體或同種噬菌體感染敏感菌后所釋放的噬菌體數(shù)不同,與噬菌體種類、宿主細胞菌齡以及環(huán)境因數(shù)有關(guān)。,2、溫和噬菌體與溶源性細菌,溫和噬菌體：噬菌體感染細胞后，將其核酸整合（附著）到宿主的核DNA上，并且可以隨宿主DNA的復(fù)制而進行同步復(fù)制，在一般情況下，不引起寄主細胞裂解的噬菌體。 原噬菌體（或前噬菌體）： 即整合在宿主核DNA上的噬菌體的核酸。 溶原性細菌：指在核染色體上整合有原噬菌體的細菌?？蛇M行正常生長繁殖,而不被裂解。,溶原性細菌的特點： 可穩(wěn)定遺傳：子代細菌都含有原噬菌體，均具有溶原性。 可自發(fā)裂解：溫和噬菌體的核酸也可從宿主DNA上脫落下來，恢復(fù)原來的狀態(tài)，進行大量的復(fù)制，變成烈性噬菌體，自發(fā)裂解幾率10-210-5 。 可誘導(dǎo)裂解：用化學(xué)、物理方法誘導(dǎo) 具有“免疫性”：溶原菌對其本身產(chǎn)生的噬菌體或外來的同源的噬菌體不敏感，對同源噬菌體具免疫性，對非同源噬菌體沒有免疫性。 可復(fù)愈：自然遺失前噬菌體，但不發(fā)生自發(fā)裂解和誘導(dǎo)裂解 溶源轉(zhuǎn)變：由于溶原菌整合了溫和噬菌體的核酸而使自己產(chǎn)生一些新的生理特征。,（三）、噬菌體的危害和應(yīng)用,噬菌體的危害： 主要是引起發(fā)酵中的噬菌體污染 例：丙酮、丁醇發(fā)酵中的噬菌體污染 抗生素發(fā)酵中的噬菌體污染 食品工業(yè)上的噬菌體污染 防治： 控制活菌排放 選育抗性生產(chǎn)菌株 生產(chǎn)中輪換使用菌種 藥物防治例如用金霉素、四環(huán)素等。,噬菌體的應(yīng)用： 1.作為分子生物學(xué)研究的工具 2.用于鑒定未知菌，可到型。 3.用于臨床治療傳染病 4.檢驗植物病原菌 5.測定輻射劑量,