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1、氣單胞菌檢驗(yàn)及研究進(jìn)展,概述 流行病學(xué) 微生物特性 嗜水氣單胞菌的鑒定要點(diǎn),概 述,氣單胞菌在自然界分布廣泛 ,普遍存在于淡水、 污水、 淤泥、土壤和人類糞便中 ,有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病菌株可感染魚類、 兩棲類、 爬行類、 鳥類和哺乳類等動(dòng)物 。臨床上以急性出血性敗血癥為主要特征。,氣單胞菌可引起人腸道感染和腸道外感染 ,如敗血癥、 傷口、 眼、 骨關(guān)節(jié)、 腹腔感染和其它感染 ,其中嗜水氣單胞菌是一種典型的人 -畜 -魚共患病原菌 ,人類可因致病性嗜水氣單胞菌感染而發(fā)生腹瀉、 食物中毒、 繼發(fā)感染等等。,分類與地位,1984年第 8版伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè) 中列為弧菌科 ,氣單胞菌

2、屬。 嗜水氣單胞菌：嗜水氣單胞菌嗜水亞種、 嗜水氣單胞菌無(wú)色亞種和嗜水氣單胞菌解朊亞種 豚鼠氣單胞菌 溫和氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌：殺鮭亞種、不產(chǎn)色亞種、殺日本鮭亞種 維隆氣單胞菌：溫和生物亞種和維氏生物亞種,至今，發(fā)展到l4個(gè)氣單胞菌表型種和 16個(gè)基 因種 ,把以往被歸類為弧菌科的氣單胞菌屬劃 為一個(gè)獨(dú)立的科 ,即氣單胞菌科。,流 行 病 學(xué),自然棲息地,主要存在于水生環(huán)境包括食品、 地面水、 海水、 河水、 湖泊、 蓄水池和供水系統(tǒng)中 ,其生長(zhǎng)密度較低 ,可小于 11 000個(gè)細(xì)胞 /mL; 在廢水、 處理過或未處理的污水、 家庭污水泥漿中密度很高 ,可高達(dá) 1億個(gè)細(xì)胞 /mL以上。 許多

3、氣單胞菌可在新鮮或儲(chǔ)存食品中廣泛存在 ,并且數(shù)量很高。 在瓶裝天然礦泉水中 ,甚至手術(shù)使用的醫(yī)療用品中也能檢出氣單胞菌。,致病因素,在溫血和冷血脊椎動(dòng)物 (包括青蛙、 魚、 爬蟲、蛇、 鳥和人 )中 ,氣單胞菌與許多種類的疾病有關(guān) ,對(duì)人感染主要有兩類: 腸道感染和腸道外感染 (敗血癥、 傷口、 眼、 骨關(guān)節(jié)、 腹腔感染和其他感染 )。 毒力因子：外毒素、胞外蛋白酶、s蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等 外毒素包括腸毒素、溶血素和細(xì)胞毒素,文獻(xiàn)報(bào)道,食物及環(huán)境中分離到的氣單胞菌 29 . 4%產(chǎn)生腸毒素 , 43 . 1%產(chǎn)生溶血素 , 89 . 0%產(chǎn)生細(xì)胞毒素 , 從食物中分離到的氣單胞菌 1

4、8 . 2%產(chǎn)生腸毒素 , 17 . 1%產(chǎn)生溶血素 , 72 .7%產(chǎn)生細(xì)胞毒素 。 溫和氣單胞菌和維隆氣單胞菌比其他菌種產(chǎn)生更多的腸毒素和溶血素 ,維隆氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌可產(chǎn)生細(xì)胞游離性溶血素。,嗜水氣單胞菌致病因子,嗜水氣單胞菌可以通過飲水、 皮膚創(chuàng)傷等途徑感染動(dòng)物機(jī)體， 并在體內(nèi)經(jīng)過不同途徑對(duì)機(jī)體的不同器官進(jìn)行破壞。 嗜水氣單胞菌可產(chǎn)生多種致病因子 氣溶素(aerolysin) 、 溶血素(hemolysin)、 溶血毒素(hemolytic toxin ) 、 細(xì)胞毒性腸毒素( cytolyti- centerotoxin ) 、 胞外蛋白酶 、型菌毛、 s層蛋白及載鐵體等。,嗜

5、水氣單胞菌致病因子,外毒素( exotoxin) 由于嗜水氣單胞菌基因型的多樣性， 其外毒素的基因差異也很大， 包括氣溶素、 溶血素、 溶血毒素和細(xì)胞毒性腸毒素等。雖然外毒素名稱各異，但這些毒素在結(jié)構(gòu)和功能上都極為相似：它們都是單一多肽分子，并且其生物學(xué)活性相同，都具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性， 因此外毒素屬于同一基因家族。 國(guó)際上將外毒素統(tǒng)一命名為氣溶素( Aer ) 。在國(guó)內(nèi)， 涂小林、 陸承平等將毒素命名為 HEC毒素。,嗜水氣單胞菌致病因子,胞外酶 是嗜水氣單胞菌重要的致病因子之 一， 研究得較多的是金屬蛋白酶和絲氨酸蛋 白酶。 G o b i u s、A n g u i t a等分別

6、克隆得 到了嗜水氣單胞菌的胞外淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶及磷脂酶。,嗜水氣單胞菌致病因子,胞外蛋白酶有的具有直接致病性，有的則不具有直接致病性 ， 但可以活化其他致病因子，外毒素是以無(wú)活性的前體形式存在的， 必須經(jīng)過蛋白酶將其前體 C末端的蛋白降解后才具有生物學(xué)活性。 總之， 嗜水氣單胞菌的致病因子繁多復(fù)雜，它們對(duì)機(jī)體發(fā)揮毒性作用時(shí)也不是單個(gè)因子獨(dú)立作用， 而是相互協(xié)同作用于機(jī)體的 。,胃腸道感染,腹瀉病是氣單胞菌感染最常見的臨床表現(xiàn) 好發(fā)人群主要是 5歲以下兒童 ,成人也有報(bào)道 ,但很少引起旅游者腹瀉。 夏季發(fā)病率最高 主要由嗜水氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和溫和氣單胞菌引起氣單胞菌相關(guān)性胃腸道

7、感染 。 傾向于輕度的、自限性的水樣腹瀉。但也有出現(xiàn)血便和糞便白細(xì)胞的嚴(yán)重病例 ,與志賀菌所致的痢疾非常相似。 少數(shù)情況下還可引起霍亂樣腹瀉。,腸道外感染,菌血癥 傷口感染 通常繼發(fā)于胃腸炎或外傷性損害以及接觸 污染水體后發(fā)生。 主要是嗜水氣單胞菌和維隆氣單胞菌引起,氣單胞菌有致病性菌株和非致病性菌株之分。 從腸道外來(lái)源分離的氣單胞菌特別是以純培養(yǎng)物 的形式分離時(shí)比較有臨床意義。 在沒有分離到其他腸道病原 (包括兒童輪狀病 毒 )的情況下 , 從10歲以下患者分離的大多數(shù)菌 株比較有意義。而成人只有嗜水氣單胞菌和維 隆氣單胞菌比較有意義。,藥物敏感性,多數(shù)菌株產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶 ，大多數(shù)氣單胞菌對(duì)青

8、霉素、 氨芐青霉素、 替卡西林耐藥 ，對(duì)廣譜抗生素先鋒霉素、 氨基糖苷類、 碳青霉烯、 氯霉素、 四環(huán)素、 復(fù)方新諾明和喹諾酮類敏感。 我國(guó)氣單胞菌對(duì)抗生素的耐藥比較普遍 , 氣單胞菌主要 3個(gè)種的耐藥率比較 ,對(duì)頭孢噻肟和頭孢美唑的敏感率溫和氣單胞菌明顯高于嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌,對(duì)其他抗生素的耐藥率各種之間無(wú)明顯差異。 我中心的食品中氣單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，氣單胞菌對(duì)利福平、氨芐青霉素的耐藥率較高，對(duì)丁胺卡那、慶大霉素、氟哌酸的敏感性高。,微生物特性,形態(tài)和染色特征,革蘭陰性、 直桿狀或略彎、球形、 末端鈍圓的菌體 無(wú)莢膜 ,無(wú)芽孢 ,有時(shí)也可呈雙球狀或絲狀。 單極鞭毛 ,固體培養(yǎng)基

9、上的幼齡培養(yǎng)物可形成周鞭毛。 殺蛙氣單胞菌和中間氣單胞菌幼菌株無(wú)運(yùn)動(dòng)性。,培養(yǎng)與鑒定,觸酶和氧化酶均為陽(yáng)性 還原硝酸鹽為亞硝酸鹽 發(fā)酵葡萄糖以及其他許多糖類產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣 生長(zhǎng)溫度范圍廣 (045) ,人分離菌株 (嗜常溫菌株 )在 1042 間生長(zhǎng) ,而無(wú)運(yùn)動(dòng)性的嗜冷菌種生長(zhǎng)的最高溫度為 37(如中間氣單胞菌 )或更低一些 (如殺蛙氣單胞菌 )。在腦心浸液培養(yǎng)基 28培養(yǎng)條件下 ,可在 pH 4 . 59 . 0和 0% 4%的NaCl濃度生長(zhǎng)。 氣單胞菌可在許多普通常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng) ,如血、巧克力平板及許多腸道鑒別培養(yǎng)基。,培養(yǎng)與鑒定,28培養(yǎng) 24小時(shí) 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 菌落為光滑、 凸

10、起、 圓整、 無(wú)色或淡黃色 ,有特殊芳香氣味。菌落大小因培養(yǎng)時(shí)間溫度而異 ,小如針尖 ,大的直徑可達(dá) 23mm,不產(chǎn)生色素。 血瓊脂 某些菌株即使在 10也可產(chǎn)生清晰的-溶血環(huán)。,培養(yǎng)與鑒定,注：許多氣單胞菌 ,如豚鼠氣單胞菌蔗糖或乳糖利用 陽(yáng)性 ,在選擇性培養(yǎng)基上發(fā)酵乳糖 ,與腸道的常居菌群 不易鑒別。因此使用麥康凱等腸道選擇性培養(yǎng)基來(lái)分 離氣單胞菌時(shí) ,一些菌株很容易被漏檢。 堿性蛋白胨水是氣單胞菌最有效的增菌培養(yǎng)基。,血清分型,氣單胞菌血清學(xué)分型主要用于流行病學(xué)調(diào)查。 多年來(lái)的研究表明 ,嗜水氣單胞菌、 溫和氣單胞菌 和豚鼠氣單胞菌的分離頻率在所有氣單胞菌中占有 絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位 ,其中尤以

11、嗜水氣單胞菌為最 ,而其他 種類則極少?gòu)沫h(huán)境和腹瀉患者中分離出 ,難以形成 種群優(yōu)勢(shì)。,國(guó)際上對(duì)氣單胞菌的血清學(xué)分型研究比較系統(tǒng)的是 日本國(guó)立康復(fù)研究院 (N I H)和荷蘭國(guó)立公共健康和 環(huán)境衛(wèi)生研究院 (N IPHEH)對(duì)嗜溫群氣單胞菌的血 清學(xué)分型 ,前者共分 44個(gè) O抗原血清型 ,后者分 30 個(gè) O抗原血清型。,血清分型,英國(guó)學(xué)者 Thomas等將 N I H系統(tǒng)在原有 44個(gè) O型血清基礎(chǔ)上擴(kuò)大到 96個(gè)。Thomas的分型結(jié)果顯示 03、 016、 017和034是優(yōu)勢(shì)血清型 ,其中 011、 016和 034毒力強(qiáng)大 ,被認(rèn)為是引起人類腹瀉的重要病原 。 魚源氣單胞菌的優(yōu)勢(shì)血

12、清型主要為011、 019和034引起。國(guó)內(nèi)則多認(rèn)為 05和 09是引起家養(yǎng)魚類暴發(fā)性流行病的優(yōu)勢(shì)血清型,而人源主要也是 011、 016、 034。,檢驗(yàn)程序,標(biāo)本,增菌,分離培養(yǎng) （血平板、Mac）,全面生化反應(yīng),可疑菌落,腸毒素測(cè)定,初步生化反應(yīng),涂片 染色鏡檢,血標(biāo)本,氧化酶 TCBS生長(zhǎng) O/129 耐鹽試驗(yàn),鑒定試驗(yàn),與腸道桿菌、非發(fā)酵菌鑒別 與鄰單胞菌屬和弧菌屬鑒別 氣單胞菌屬種間鑒別,。,致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法 GB/ T 1 8 6 5 2 -2 0 0 2,本標(biāo)準(zhǔn)在嗜水氣單胞菌的鑒定中， 參考了 伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè) (第九版， 1 9 9 4 ) 中有關(guān)嗜水氣單胞菌的

13、內(nèi)容。 在嗜水氣單胞菌的分離鑒定中， 除采用選擇培養(yǎng)基R S培養(yǎng)基及鑒別培養(yǎng)基嗜水氣單胞菌( A H M)培養(yǎng)基外，還應(yīng)借助一些生化反應(yīng)將其與假單胞菌、鄰單胞菌、腸桿菌、弧菌及其他氣單胞菌進(jìn)行區(qū)分。 蛋白酶是嗜水氣單胞菌重要的毒力決定因子，與該菌的致病性密切相關(guān)，凡蛋白酶陽(yáng)性的嗜水氣單胞菌均具致病性。蛋白酶的檢測(cè)除采用脫脂奶平板法外，還可采用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)。,本標(biāo)準(zhǔn)可用于嗜水氣單胞菌的分離鑒定， 而且可區(qū)分致病性菌株和非致病性菌株，有助于致病性嗜水氣單胞菌感染的確切診斷。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。,致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)程序,嗜水氣單胞菌

14、的鑒定,檢樣： 水樣的分離用孔徑為0.2 m的硝酸纖維素微孔濾膜過濾水樣,取出濾膜，置含有滅菌堿性蛋白胨水的試管中。,菌落形態(tài) 嗜水氣單胞菌在普通瓊脂平板上，2 8 培養(yǎng)2 4 h后的菌落為光滑、微凸、圓整 、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味。 革蘭氏染色 嗜水氣單胞菌應(yīng)為革蘭氏陰性短桿菌。 氧化酶試驗(yàn) 陽(yáng)性,嗜水氣單胞菌革蘭染色,嗜水氣單胞菌菌落特征（血平板）,嗜水氣單胞菌菌落特征（MAC）,返回,嗜水氣單胞菌電鏡圖,返回,AHM鑒別培養(yǎng),用鉑金耳挑取普通瓊脂平板上氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性的單個(gè)菌落少許， 穿刺接種AHM鑒別培養(yǎng)基。 3 7 培養(yǎng)2 4 h 結(jié)果：頂部仍為紫色，底部為淡黃色; 細(xì)菌沿穿刺

15、線呈刷狀生長(zhǎng)，即動(dòng)力陽(yáng)性; 部分菌株頂部呈黑 色。,AHM,吲哚試驗(yàn),在長(zhǎng)有細(xì)菌的A H M鑒別培養(yǎng)基頂部， 滴加3 -4 滴K o v a c s 試劑，若沿試管內(nèi)壁出現(xiàn)紅色環(huán)者，表明產(chǎn)生吲哚，判為陽(yáng)性。 嗜水氣單胞菌應(yīng)為陽(yáng)性,糖發(fā)酵試驗(yàn),分別接種葡萄糖、 蔗糖、 阿拉伯搪、 七葉苷及水楊苷等5 種糖發(fā)酵試驗(yàn)管, 嗜水氣單胞菌可發(fā)酵以上5 種糖類。,嗜水氣單胞菌致病性鑒定,脫脂奶平板試驗(yàn),用鉑金耳取A H M鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許,接種劃線于1 %脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板。 2 8 培養(yǎng)2 4 h 若菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明的溶蛋白圈，判為陽(yáng)性。,脫 脂 奶 平 板 試 驗(yàn),脫 脂 奶 平 板

16、試 驗(yàn),斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn),用鉑金耳取A H M鑒別培養(yǎng)基表面菌落少許。接種蔗糖胰蛋白胨肉湯, 2 8 搖床( 3 0 r / mi n ) 培養(yǎng)4 8 h。1 0 0 0 0 r / mi n離心 1 0 mi n ， 取上清。 用微量加樣器取5 L點(diǎn)樣于硝酸纖微素膜光面，3 7 烘干。 置2 0 %脫脂奶中， 3 7 封閉1 h 。 用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5次，每次 2 min。 置1：5 0 兔抗嗜水氣單胞菌蛋白酶抗血清中， 3 7 作用 1 h。,斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn),用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5 次，每次2min ，置1：1 0 酶標(biāo)羊抗兔抗血清中， 3 7 作用 1

17、h 。 用含吐溫- 2 0的磷酸鹽緩沖液洗5 次，每次2 mi n 。 加 3 , 3 -二氨基聯(lián)苯胺-過氧化氫中顯色。 待斑點(diǎn)明顯后，用去離子水終止顯色。 設(shè)無(wú)菌肉湯作陰性對(duì)照。 以出現(xiàn)明顯棕色斑點(diǎn)者判為陽(yáng)性。,試驗(yàn)結(jié)果分析判定,符合以下特性者應(yīng)判為致病性嗜水氣單胞菌: 在普通瓊脂平板上， 2 8 培養(yǎng)2 4 h后的菌落為光滑、 微凸、圓整、無(wú)色或淡黃色，有特殊芳香氣味; 在A H M鑒別培養(yǎng)基中，頂部仍為紫色，底部為淡黃色; 細(xì)菌沿穿刺線呈刷狀生長(zhǎng)，即運(yùn)動(dòng)力陽(yáng)性; 部分菌株頂部呈黑色; 氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，革蘭氏染色為陰性短桿菌; 吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷等5 種糖類; 脫脂奶平板試驗(yàn)陽(yáng)性或斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)陽(yáng)性。,謝謝！,