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1、*rRNArRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）真核生物真核生物 5S rRNA 28S rRNA5.8S rRNA 18S rRNA 原核生物原核生物 5S rRNA23S rRNA16S rRNArRNArRNA的甲基化多發(fā)生在核糖上。的甲基化多發(fā)生在核糖上。原核生物原核生物核糖體（核糖體（S)S)亞基（亞基（S)S)rRNA(S)rRNA(S)真核生物真核生物806040285.851850703023516（以大腸桿菌為例）（以大腸桿菌為例）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)2121種種3131種種4949種種3333種種（以小鼠肝為例）（以小鼠肝為例）核蛋白體的組成核蛋白體的組成(二二)RN

2、A)RNA的高級結(jié)構(gòu)特點的高級結(jié)構(gòu)特點 RNARNA是單鏈分子，因此，在是單鏈分子，因此，在RNARNA分子中，并不分子中，并不遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基的總數(shù)。嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基的總數(shù)。RNARNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu)（類似類似A-DNAA-DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)），不能形成雙螺），不能形成雙螺旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象旋的部分，則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為地稱為“發(fā)夾型發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)或或莖環(huán)結(jié)構(gòu)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在在RNARNA的雙螺

3、旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對情況的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對情況不象不象DNADNA中嚴格。中嚴格。G G 除了可以和除了可以和C C 配對外，配對外，也可以和也可以和U U 配對。配對。G-U G-U 配對形成的氫鍵配對形成的氫鍵較弱。不同類型的較弱。不同類型的RNA,RNA,其二級結(jié)構(gòu)有明其二級結(jié)構(gòu)有明顯的差異。顯的差異。tRNAtRNA中中除了常見的堿基外，還存在一些除了常見的堿基外，還存在一些稀有堿基稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部，這類堿基大部分位于突環(huán)部分分.tRNAtRNA的高級結(jié)構(gòu)的高級結(jié)構(gòu)1 1、tRNAtRNA的二級結(jié)構(gòu)的二級結(jié)構(gòu) tRNAtRNA的二級結(jié)構(gòu)大都呈的二級結(jié)構(gòu)大都呈“

4、三葉草三葉草”形狀，在結(jié)形狀，在結(jié)構(gòu)上具有某些共同之處，構(gòu)上具有某些共同之處，一般可將其分為四臂四環(huán)一般可將其分為四臂四環(huán)：包括氨基酸接受臂、反密包括氨基酸接受臂、反密碼（環(huán)）臂、二氫尿嘧啶碼（環(huán)）臂、二氫尿嘧啶（環(huán)）臂、（環(huán)）臂、T T C C（環(huán)）臂和（環(huán)）臂和可變環(huán)。除了氨基酸接受可變環(huán)。除了氨基酸接受區(qū)外，其余每個區(qū)均含有區(qū)外，其余每個區(qū)均含有一個突環(huán)和一個臂。一個突環(huán)和一個臂。(1)(1)氨基酸接受區(qū)氨基酸接受區(qū)包含有包含有tRNAtRNA的的3 3 -末端和末端和5 5-末端，末端，3 3-末端的最后末端的最后3 3個個核苷酸殘基都是核苷酸殘基都是CCACCA，A A為腺為腺苷酸。

5、苷酸。氨基酸可與其成酯，氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起攜帶氨基酸的作用。氨基酸的作用。(2)(2)反密碼區(qū)反密碼區(qū)與氨基酸接受區(qū)相對，一般與氨基酸接受區(qū)相對，一般環(huán)中含有環(huán)中含有7 7個核苷酸殘基，個核苷酸殘基，臂中含有臂中含有5 5對堿基。其中環(huán)對堿基。其中環(huán)正中的正中的3 3個核苷酸殘基稱為個核苷酸殘基稱為反密碼子反密碼子。（3)3)二氫尿嘧啶區(qū)二氫尿嘧啶區(qū) 該區(qū)含有二氫尿嘧啶。環(huán)該區(qū)含有二氫尿嘧啶。環(huán)由由8-128-12個核苷酸組成，臂由個核苷酸組成，臂由3-43-4對堿基組成。對堿基組成。(4)T(4)T C C區(qū)區(qū) 該區(qū)與二氫尿嘧啶區(qū)相對，該區(qū)與二氫尿

6、嘧啶區(qū)相對，假尿嘧啶核苷酸假尿嘧啶核苷酸胸腺嘧啶胸腺嘧啶核糖核苷酸環(huán)核糖核苷酸環(huán)(T(T C)C)由由7 7個核個核苷酸組成，通過由苷酸組成，通過由5 5對堿基對堿基組成的雙螺旋區(qū)組成的雙螺旋區(qū)(T(T C C臂臂)與與tRNAtRNA的其余部分相連。除個的其余部分相連。除個別例外，幾乎所有別例外，幾乎所有tBNAtBNA在此在此環(huán)中都含有環(huán)中都含有T T C C 。(5)(5)可變區(qū)可變區(qū) 位于反密碼區(qū)與位于反密碼區(qū)與T T C C區(qū)之間，區(qū)之間，不同的不同的tRNAtRNA該區(qū)變化較大，該區(qū)變化較大，一般有一般有3-183-18個核苷酸組成。個核苷酸組成。假尿苷假尿苷 胸腺嘧啶核糖核苷胸腺

7、嘧啶核糖核苷稀有核苷（稀有核苷（tRNA）2 2、tRNAtRNA的三級結(jié)構(gòu)的三級結(jié)構(gòu) 在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的成對，目前已知的tRNAtRNA的三級結(jié)構(gòu)均為的三級結(jié)構(gòu)均為倒倒L L形。形。穩(wěn)定因素：穩(wěn)定因素：堿基堆積力和氫鍵堿基堆積力和氫鍵siRNAsiRNA和和miRNAmiRNA介紹：介紹：小的干涉小的干涉RNARNA（small interfering RNA;small interfering RNA;siRNAsiRNA）和微小和微小RNARNA（micr

8、oRNAmicroRNA；miRNAmiRNA）是兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)是兩種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達的調(diào)節(jié)因子，是小節(jié)因子，是小RNARNA的最主要組成部分，它們的最主要組成部分，它們的相關(guān)性密切，既具有相似性，又具有差的相關(guān)性密切，既具有相似性，又具有差異性。異性。小的干涉小的干涉RNARNA（siRNAsiRNA）是在）是在RNARNA干涉過程中干涉過程中人工體外合成的小片段人工體外合成的小片段RNARNA，由約，由約2020個堿基個堿基對組成。對組成。SiRNASiRNA在在RNARNA沉默通道中起中心作沉默通道中起中心作用，是對特定用，是對特定（特異性強）（特異性強）信

9、使信使RNARNA（mRNAmRNA）進行進行降解降解的指導要素。的指導要素。RNARNA干涉（干涉（RNAiRNAi）在實驗室中是一種強大的）在實驗室中是一種強大的實驗工具，通過這種方式，利用具有同源性實驗工具，通過這種方式，利用具有同源性的的雙鏈雙鏈RNARNA（dsRNAdsRNA）誘導序列特異的目標基）誘導序列特異的目標基因的沉默，迅速阻斷基因活性。因的沉默，迅速阻斷基因活性。(在在2002年度年度Science評選的評選的10大科學成就中大科學成就中RNAi名列榜首名列榜首,06年獲諾年獲諾貝爾生理學和醫(yī)學獎貝爾生理學和醫(yī)學獎)可以簡化可以簡化/替代基因敲除替代基因敲除 miRNAs

10、miRNAs是一種是一種212125nt25nt長的長的單鏈單鏈小分子小分子RNARNA，其，其結(jié)構(gòu)特征如下：廣泛存在于真核生物中，是一組結(jié)構(gòu)特征如下：廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNARNA，它本身不具有開放，它本身不具有開放閱讀框（閱讀框（ORFORF）；成熟的）；成熟的miRNAmiRNA，55端有一個磷端有一個磷酸基團，酸基團，33端為羥基，端為羥基，這也這也是它與相同長度的功是它與相同長度的功能能RNARNA降解片段的區(qū)分標志。降解片段的區(qū)分標志。是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-9070-90個堿基大小的單鏈個堿基大小的單鏈RNA

11、RNA前體經(jīng)過前體經(jīng)過DicerDicer酶加酶加工后生成，不同于工后生成，不同于siRNAsiRNA（雙鏈）（雙鏈）但是和但是和siRNAsiRNA密密切相關(guān)。切相關(guān)。miRNAmiRNA表達的表達的時序性時序性和和組織特異性組織特異性提示人們提示人們miRNAmiRNA的分布的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。核酸與蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu)核酸與蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu) 生物體內(nèi)的核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，生物體內(nèi)的核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物，以核蛋白的形

12、式存在。以核蛋白的形式存在。DNA分子十分巨大，將它組裝在有限的空間內(nèi)，分子十分巨大，將它組裝在有限的空間內(nèi)，需要高度組織，用壓縮比來表示。即：需要高度組織，用壓縮比來表示。即：DNA分分子長度與組裝后特定結(jié)構(gòu)長度之比稱為壓縮比。子長度與組裝后特定結(jié)構(gòu)長度之比稱為壓縮比。1 1.病毒：病毒：病毒顆粒主要由蛋白質(zhì)和核酸及脂質(zhì)、糖病毒顆粒主要由蛋白質(zhì)和核酸及脂質(zhì)、糖類組成。類組成。動物病毒主要為動物病毒主要為DNA病毒，植物病毒病毒，植物病毒主要為主要為RNA病毒。核酸是遺傳物質(zhì)，而蛋白質(zhì)病毒。核酸是遺傳物質(zhì)，而蛋白質(zhì)與病毒宿主的專一性有關(guān)，同時可以保護核酸免與病毒宿主的專一性有關(guān)，同時可以保護核

13、酸免受損傷。受損傷。頭頭部部頸頸圈圈尾尾部部基基板板尾尾絲絲尖尖釘釘 核酸位于病毒粒子核酸位于病毒粒子的中心的中心,蛋白質(zhì)包圍蛋白質(zhì)包圍在核酸外面在核酸外面,形成衣形成衣殼殼,并決定病毒粒子并決定病毒粒子的外形。的外形。病毒的侵染性由核病毒的侵染性由核酸引起酸引起,蛋白質(zhì)無侵蛋白質(zhì)無侵染性染性,僅起保護作用僅起保護作用或識別宿主細胞表或識別宿主細胞表面位點。面位點。噬菌體噬菌體T T2 2結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)2.2.細菌的擬核細菌的擬核 細菌基因組為雙鏈環(huán)狀細菌基因組為雙鏈環(huán)狀DNADNA，與堿性蛋白和少，與堿性蛋白和少量量RNARNA結(jié)合，形成突環(huán)結(jié)構(gòu)。其結(jié)合，形成突環(huán)結(jié)構(gòu)。其DNADNA分子的長度分子

14、的長度大約是其菌體長度的大約是其菌體長度的10001000倍。所以倍。所以細菌細菌DNADNA在細在細胞內(nèi)緊密纏繞形成致密的小體，稱為擬核胞內(nèi)緊密纏繞形成致密的小體，稱為擬核（nucleoidnucleoid）.3.3.真核生物的染色體真核生物的染色體(核蛋白核蛋白)DNADNA雙鏈以左手螺旋纏繞在組蛋白形成的八聚體雙鏈以左手螺旋纏繞在組蛋白形成的八聚體核心上即核心上即核小體核小體 念珠狀結(jié)構(gòu)念珠狀結(jié)構(gòu) 核小體核小體鏈進一步盤繞、折疊形成染色質(zhì)絲鏈進一步盤繞、折疊形成染色質(zhì)絲 組成突組成突環(huán)環(huán) 玫瑰花結(jié)玫瑰花結(jié) 螺線圈螺線圈 由螺線由螺線圈組裝成染色單體。圈組裝成染色單體。真核生物的染色質(zhì)絲真

15、核生物的染色質(zhì)絲組蛋白八聚體：組蛋白八聚體：H2A H2B H3 H4H2A H2B H3 H4各各2 2個分子個分子從從DNADNA到染色質(zhì)絲，到染色質(zhì)絲，DNADNA壓縮壓縮了近了近100100倍，若從倍，若從DNADNA到最后到最后凝縮成染色體，凝縮成染色體，DNADNA壓縮了近壓縮了近萬倍。萬倍。一、核酸的一般物理性質(zhì)一、核酸的一般物理性質(zhì) DNADNA為白色纖維狀固體，為白色纖維狀固體，RNARNA為白色粉末狀固體，都微溶于水，其為白色粉末狀固體，都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機溶劑機溶劑

16、。（用乙醇從溶液中沉淀核酸）（用乙醇從溶液中沉淀核酸）DNADNA和和RNARNA在細胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中在細胞中常以核蛋白形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。的溶解度不同。DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白 0.14mol/LNaCl -+0.14mol/LNaCl -+1-2mol/LNaCl +-1-2mol/LNaCl +-DNADNA溶液的粘度很大，而溶液的粘度很大，而RNARNA溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或溶液的粘度小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低。降解后其粘度降低。核酸受到強大離心力的作用時，可從溶液中沉降下來，其沉降速核

17、酸受到強大離心力的作用時，可從溶液中沉降下來，其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。度與核酸的大小和密度有關(guān)。第五節(jié)、核酸的重要理化性質(zhì)與分析技術(shù)第五節(jié)、核酸的重要理化性質(zhì)與分析技術(shù)二、二、核酸的兩性性質(zhì)及等電點核酸的兩性性質(zhì)及等電點 與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）與蛋白質(zhì)相似，核酸分子中既含有酸性基團（磷酸基）也含有弱堿性基團堿基，因而核酸也具有兩性性質(zhì)。也含有弱堿性基團堿基，因而核酸也具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿基呈由于核酸分子中的磷酸是一個中等強度的酸，而堿基呈現(xiàn)弱堿性，所以核酸的等電點比較低?，F(xiàn)弱堿性，所以核酸的等電點比較低。（當核酸分子內(nèi)（

18、當核酸分子內(nèi)的酸性解離和堿性解離相等，本身所帶的正電荷與負電的酸性解離和堿性解離相等，本身所帶的正電荷與負電荷相等時，此時核酸溶液的荷相等時，此時核酸溶液的pHpH值即為核酸的等電點值即為核酸的等電點pIpI）如如DNADNA的等電點為的等電點為4 44.54.5，RNARNA的等電點為的等電點為2 22.52.5。核酸。核酸在其等電點時溶解度最小。在其等電點時溶解度最小。RNARNA的等電點比的等電點比DNADNA低的原因，是低的原因，是RNARNA分子中核糖基分子中核糖基2-OH2-OH通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離。通過氫鍵促進了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNADNA沒有這種作用。沒有這種作

19、用。三、核酸的水解三、核酸的水解1.1.核酸的酸解核酸的酸解 核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷（解切斷（降解降解）。）。酸對核酸的作用因酸的濃度、溫度和作用時間不酸對核酸的作用因酸的濃度、溫度和作用時間不同而不同。同而不同。嘌呤堿基比嘧啶堿基易被水解下來嘌呤堿基比嘧啶堿基易被水解下來。2 2、核酸的堿解、核酸的堿解 DNADNA和和RNARNA對對堿堿的耐受程度有很大差別。例如，的耐受程度有很大差別。例如，在在稀堿稀堿（0.3-1 mol/L NaOH0.3-1 mol/L NaOH）溶液中，在室溫）溶液中，在室溫至至37370 0C

20、C條件下條件下RNARNA幾乎可以完全水解，生成幾乎可以完全水解，生成2-2-或或3-3-磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在同樣條件下則不在同樣條件下則不受影響，若加溫至受影響，若加溫至1001000 0C C，4 4個小時也可得到小個小時也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。分子的寡聚脫氧核苷酸。在在RNARNA水解時，水解時，2-OH2-OH首先進攻磷酸基，在斷首先進攻磷酸基，在斷開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的開磷酯鍵的同時形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。作用形成水解產(chǎn)物。2 2、核酸的酶解、核酸的酶解 生物體內(nèi)存在多種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸生物體內(nèi)存在多

21、種核酸水解酶。這些酶可以催化水解多聚核苷酸鏈中的磷酸二酯鍵。鏈中的磷酸二酯鍵。以以DNADNA為底物的為底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases）和以）和以RNARNA為底物的為底物的RNARNA水解酶水解酶（RNasesRNases）。）。根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸根據(jù)作用方式又分作兩類：核酸外切酶外切酶和核酸和核酸內(nèi)切酶內(nèi)切酶。核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（核酸外切酶的作用方式是從多聚核苷酸鏈的一端（3-3-端或端或5-5-端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和端）開始，逐個水解切除核苷酸；核酸內(nèi)切酶的作用方式剛好和外切酶相反，它從多聚核

22、苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸外切酶相反，它從多聚核苷酸鏈中間開始，在某個位點切斷磷酸二酯鍵。（小球菌核酸酶即可外切又可內(nèi)切）二酯鍵。（小球菌核酸酶即可外切又可內(nèi)切）在分子生物學研究中最有應用價值的是在分子生物學研究中最有應用價值的是限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶。這種。這種酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。酶可以特異性的水解核酸中某些特定堿基順序部位。四、核酸的紫外吸收四、核酸的紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤在核酸分子中，由于嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵體系，因而具有獨特的紫體系，因而具有獨特的紫外線吸收光譜，一般在外線吸收光譜，一般在260nm260

23、nm左右有最大吸收峰，左右有最大吸收峰，可以作為核酸及其組分可以作為核酸及其組分定定性和定量性和定量測定的依據(jù)。測定的依據(jù)。純純DNA:ODDNA:OD260260/OD/OD280280=1.8=1.8 RNA:OD RNA:OD260260/OD/OD280280=2=2*樣品中若含有雜蛋白及苯酚，樣品中若含有雜蛋白及苯酚，則則A260/A280A260/A280明顯降低。明顯降低。應用：應用：純度鑒定純度鑒定 含量測定含量測定五核酸的變性、復性與雜交五核酸的變性、復性與雜交1 1、核酸的變性（、核酸的變性（denaturationdenaturation）與變性因素）與變性因素核酸的核酸

24、的變性變性是指核酸雙螺旋區(qū)的是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂氫鍵斷裂，變成單，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程。變性核酸將失去其部分或全部的生鏈結(jié)構(gòu)的過程。變性核酸將失去其部分或全部的生物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，物活性。核酸的變性并不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，所以它的所以它的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(堿基順序堿基順序)保持不變保持不變。能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度能夠引起核酸變性的因素很多。溫度升高、酸堿度改變、鹽酸胍和尿素等的存在均可引起核酸的變性。改變、鹽酸胍和尿素等的存在均可引起核酸的變性。RNARNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)

25、變化沒有所引起的性質(zhì)變化沒有DNADNA那樣明顯。那樣明顯。利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的利用紫外吸收的變化，可以檢測核酸變性的情況。情況。因為天然狀態(tài)的因為天然狀態(tài)的DNADNA在完全變性后，紫外吸收在完全變性后，紫外吸收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%40%。而。而RNARNA變性后，約變性后，約增加增加1.1%1.1%。增色效應增色效應：變性后：變性后DNADNA對對260nm260nm紫外光的吸收紫外光的吸收率（率（A A260260）比變性前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為）比變性前明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應增色效應.A A260260值增加值增加 粘度下

26、降粘度下降 浮力密度增加浮力密度增加 旋光性質(zhì)改變旋光性質(zhì)改變 分子量不變分子量不變2.DNA2.DNA變性后的表現(xiàn)變性后的表現(xiàn)3.DNA3.DNA的熱變性和解鏈溫度（的熱變性和解鏈溫度（TmTm）用加熱的方法使用加熱的方法使DNADNA變性叫做變性叫做熱變性熱變性 DNADNA的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)的變性過程是突變性的，它在很窄的溫度區(qū)間內(nèi)完成。因此，間內(nèi)完成。因此，通常將通常將DNADNA的變性達到的變性達到50%50%時，時，即增色效應達到一半時的溫度稱為即增色效應達到一半時的溫度稱為DNADNA的的解鏈溫解鏈溫度度（melting temperature,Tmmelti

27、ng temperature,Tm）,TmTm也稱熔解溫也稱熔解溫度或度或DNADNA的熔點。的熔點。一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在82-9582-95 C C之間之間RNA的T m值 G G和和C C的含量高，的含量高，T Tm m值高值高。因而測定。因而測定TmTm值，可反映值，可反映DNADNA分子中分子中G G、C C含量，可通過經(jīng)驗公式計算：含量，可通過經(jīng)驗公式計算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 TmTm大小可反映出大小可反映出DNADNA的均一性的均一性：均質(zhì)：均質(zhì)DNADNA的熔解過程發(fā)生在一個較的熔解過程發(fā)生在

28、一個較小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)小的溫度范圍內(nèi)；異質(zhì)DNADNA的熔解過程發(fā)生在一個較寬的溫度范的熔解過程發(fā)生在一個較寬的溫度范圍內(nèi)。圍內(nèi)。TmTm與介質(zhì)中離子強度有關(guān)：與介質(zhì)中離子強度有關(guān)：DNADNA的保存應在含鹽的緩沖液中的保存應在含鹽的緩沖液中溫度溫度/0 0C CA A2602600.020.10.11.01.0mol/LKCl與介質(zhì)中的離子強度有關(guān)與介質(zhì)中的離子強度有關(guān)鹽溶液中的陽離子與鹽溶液中的陽離子與DNADNA中的磷酸基團結(jié)合而中和負中的磷酸基團結(jié)合而中和負電荷，使雙螺旋穩(wěn)定，所以，離子濃度低，電荷，使雙螺旋穩(wěn)定，所以，離子濃度低，TmTm低，低，溶解溫度范圍也寬，反之亦然。溶解溫

29、度范圍也寬，反之亦然。4 4、核酸的復性、核酸的復性（renaturationrenaturation）變性變性DNADNA在適當?shù)臈l件下在適當?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復性復性。DNADNA復性復性后，一系列物理、化學性質(zhì)將得到恢復。后，一系列物理、化學性質(zhì)將得到恢復。DNADNA復性的程復性的程度、速率與復性過程的條件有關(guān)。度、速率與復性過程的條件有關(guān)。將熱變性的將熱變性的DNADNA驟然冷卻至低溫時，驟然冷卻至低溫時，DNADNA不可能復性。不可能復性。但但是將變性的是將變性的DNADN

30、A緩慢冷卻時，可以復性，這一過程也叫緩慢冷卻時，可以復性，這一過程也叫退火（退火（annealing)annealing)。分子量越大復性越難。濃度越大，分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。此外，復性越容易。此外，DNADNA的復性也與它本身的組成和結(jié)的復性也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)以及介質(zhì)的離子強度有關(guān)。構(gòu)以及介質(zhì)的離子強度有關(guān)。DNADNA復性復性變性的兩條呈單鏈狀態(tài)的變性的兩條呈單鏈狀態(tài)的DNADNA，經(jīng)復性又重新形成雙，經(jīng)復性又重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時，其溶液的螺旋結(jié)構(gòu)時，其溶液的A A260260值比復性前減小，這種現(xiàn)值比復性前減小，這種現(xiàn)象稱為象稱為減色效應。減色效應。5 5、核酸的

31、雜交、核酸的雜交（hybridizationhybridization）熱變性的熱變性的DNADNA單鏈，在復性時并不一單鏈，在復性時并不一定與同源定與同源DNADNA互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，互補鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補序列的它也可以與在某些區(qū)域有互補序列的異源異源DNADNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu),這樣形這樣形成的新分子稱為成的新分子稱為雜交雜交DNADNA分子。分子。DNADNA單鏈與互補的單鏈與互補的RNARNA鏈之間也可以發(fā)鏈之間也可以發(fā)生雜交。生雜交。核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。研究中具有重要意義

32、。DNA-DNA雜交雙鏈分子雜交雙鏈分子變性變性 復性復性 不同來源的不同來源的DNA分子分子制備特定的探針（制備特定的探針（probeprobe）通過雜交技術(shù)可進行基因）通過雜交技術(shù)可進行基因的檢測和定位研究。的檢測和定位研究。RNARNA的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu):mRNAmRNA的結(jié)構(gòu)特點的結(jié)構(gòu)特點(真核與原核比較真核與原核比較)tRNAtRNA的結(jié)構(gòu)特點的結(jié)構(gòu)特點(三葉草和倒三葉草和倒L)L)核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì):(:(溶解度溶解度;紫外吸收紫外吸收;變性變性:增色增色 減色效應減色效應;解鏈溫度解鏈溫度;退火退火;分子雜交分子雜交)六、六、核酸分析技術(shù)核酸分析技術(shù) 核酸的分離純化 序列分析

33、（略）破碎細胞（裂解）破碎細胞（裂解）去除蛋白質(zhì)（去除蛋白質(zhì)（SDS-SDS-苯酚抽提或用氯仿苯酚抽提或用氯仿異戊醇）。異戊醇）。振蕩振蕩冷凍離心冷凍離心 DNA DNA 或或RNARNA溶于上層水相，變性溶于上層水相，變性蛋白在中間界面（反復多次）蛋白在中間界面（反復多次）70%70%冷乙醇沉淀冷乙醇沉淀盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌抑制核酸酶抑制核酸酶(DEPC:焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)(一)、核酸的分離純化超螺旋超螺旋DNADNA或或不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)不同構(gòu)象的核酸（

34、線形、環(huán)形、超螺旋），浮力密度不同，形、超螺旋），浮力密度不同，用溴化乙錠用溴化乙錠-CsCl-CsCl密度梯度離密度梯度離心可以將不同構(gòu)象心可以將不同構(gòu)象DNADNA、RNARNA與與蛋白質(zhì)區(qū)分開來蛋白質(zhì)區(qū)分開來這一方法常用于質(zhì)粒這一方法常用于質(zhì)粒DNADNA的的純化純化溴化乙錠-CsCl密度梯度離心(Ethidium bromide,EB)1、Southern印跡法印跡法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上固定（固定（8080，4-6h4-6h）與放射性標記與放射性標記DNA探針雜交探針雜交（高鹽濃度，（高鹽濃度

35、，6868，幾小時），幾小時）放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片段的凝膠片段的凝膠變性（變性（NaOH 0.5mol/LNaOH 0.5mol/L）凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern BlottingSouthern Blotting可用于可用于DNADNA之間同源之間同源性分析性分析鑒定技術(shù)鑒定技術(shù)2、Northern Blotting 研究對象是研究對象是mRNAmRNA，探針一般是，探針一般是DNADNA?？偪俁NARNA或或mRNAmRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、Wester

36、n Blotting抗原與抗體的雜交抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。研究克隆基因表達產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。（二）核酸含量測定（二）核酸含量測定 定磷法、定糖法和紫外吸收法定磷法、定糖法和紫外吸收法（P79-80）（二）、序列分析 SangerSanger雙脫氧法雙脫氧法 化學測序法化學測序法測定測定1000bp以上的以上的DNA序列序列（三）、（三）、PCRPCR與與RT-PCRRT-PCR技術(shù)技術(shù)1 1、PCRPCR技術(shù)：技術(shù)：亦稱聚合酶鏈反應（亦稱聚合酶鏈反應（Polymerase chain Polymerase chain reaction,PCRre

37、action,PCR），是以），是以DNADNA聚合酶在體外擴增聚合酶在體外擴增DNADNA片段技片段技術(shù)，經(jīng)歷術(shù)，經(jīng)歷DNADNA變性、退火、聚合酶催化變性、退火、聚合酶催化DNADNA鏈的延伸等三鏈的延伸等三個步驟周而復始的過程個步驟周而復始的過程（經(jīng)過（經(jīng)過25-3525-35輪循環(huán)輪循環(huán)DNADNA可以擴增可以擴增10106 6-10107 7倍）。也用于倍）。也用于RNARNA的擴增。的擴增。2 2、RT-PCRRT-PCR：稱反轉(zhuǎn)錄：稱反轉(zhuǎn)錄PCRPCR（reverse transcription reverse transcription PCRPCR）即將即將RNARNA模板的

38、模板的反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄與與cDNAcDNA的聚合酶鏈反應的聚合酶鏈反應（PCRPCR擴增）相結(jié)合。擴增）相結(jié)合。基因：基因：Gene,Gene,DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列，其分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列，其編碼產(chǎn)物是編碼產(chǎn)物是RNA或多肽鏈。基因包括非編碼或多肽鏈。基因包括非編碼DNA調(diào)節(jié)序列、編調(diào)節(jié)序列、編碼碼DNA序列和間隔序列。序列和間隔序列。基因組：基因組：Genome,Genome,生物細胞中單套染色體的所含生物細胞中單套染色體的所含DNADNA序列的全部序列的全部組成。組成?；蚪M學：基因組學：genomicsgenomics,基因組學的概念是基因組學的概念是198

39、61986年由年由ThomasThomas和和Roderick Roderick 首先提出來的，它是一門涵蓋了對所有基因進行基因首先提出來的，它是一門涵蓋了對所有基因進行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜）、核苷酸序列分組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的科學，其研究內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)基因析、基因定位和基因功能分析的科學，其研究內(nèi)容包括結(jié)構(gòu)基因組學和功能基因組學。組學和功能基因組學。相異相異：試比較核酸、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的不同，寫出各自基本結(jié)構(gòu)單位的通式試比較核酸、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的不同，寫出各自基本結(jié)構(gòu)單位的通式 比較項目比較項目蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)

40、核酸核酸基本結(jié)構(gòu)單位基本結(jié)構(gòu)單位連接的鍵連接的鍵主鏈的組成主鏈的組成（不變成分）（不變成分）側(cè)鏈側(cè)鏈（可變成分）（可變成分）基本結(jié)構(gòu)單位通式基本結(jié)構(gòu)單位通式核苷酸核苷酸氨基酸氨基酸肽鍵肽鍵3，5-磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵由由-N-C-CO-反復循環(huán)組成反復循環(huán)組成由戊糖由戊糖+磷酸磷酸反復循環(huán)組成反復循環(huán)組成R側(cè)鏈側(cè)鏈堿基堿基H2N-CH-COOHRH2PO3-O-H2C(O)HHON 一般將水解時，能夠釋放一般將水解時，能夠釋放202092kj92kjmolmol能量的化合物都叫做高能化合物。能量的化合物都叫做高能化合物。ATPATP水水解時釋放的能量是解時釋放的能量是303054kj54kjm

41、olmol，所以，所以ATPATP叫做高能磷酸化合物。叫做高能磷酸化合物。3 3、環(huán)化核苷酸環(huán)化核苷酸cAMP cAMP 和和 cGMPcGMP cAMP(3,5-cAMP(3,5-環(huán)腺嘌環(huán)腺嘌呤 核 苷 一 磷 酸呤 核 苷 一 磷 酸)和和 cGMP(3,5-cGMP(3,5-環(huán)鳥嘌環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸呤核苷一磷酸)的主要的主要功能是作為細胞之間傳功能是作為細胞之間傳遞信息的信使。遞信息的信使。cAMP cAMP 和和 cGMP cGMP 的環(huán)狀的環(huán)狀磷酯鍵是一個高能鍵。磷酯鍵是一個高能鍵。在在 pH 7.4 pH 7.4 條件下條件下,cAMP cAMP 和和 cGMP cGMP 的水解的

42、水解能約為能約為43.9 kj/mol43.9 kj/mol，比比 ATP ATP 水解能高得多。水解能高得多。M M為遷移率（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電為遷移率（或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）場強度下的泳動速度）遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)。及溶液粘度有關(guān)。在一定在一定pHpH條件下，每一種蛋白質(zhì)都具有特定的條件下，每一種蛋白質(zhì)都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小，在一定時間內(nèi)它電荷（種類和數(shù)量）、大小，在一定時間內(nèi)它們根據(jù)各自的遷移率集中到特定的位置上而形們根據(jù)各自的遷移率集中到特定的位置上而形成緊密

43、的泳動帶。成緊密的泳動帶。EQEQ6 6r rV=m=V/E=Q/6r m=V/E=Q/6r 電電 泳泳電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動.測定蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)分子相對質(zhì)分子相對質(zhì)量的方法量的方法凝膠過濾法：凝膠過濾法：標準蛋白質(zhì)（已知標準蛋白質(zhì)（已知MrMr和斯托克和斯托克半徑）和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形半徑）和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測定。發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測定。SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：聚丙烯酰胺凝膠電泳法：加入加入SDS

44、SDS和少量巰基乙醇，和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與電荷和則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與電荷和分子形狀無關(guān)。分子形狀無關(guān)。毛細管電泳毛細管電泳質(zhì)譜法質(zhì)譜法離心沉降法離心沉降法:蛋白質(zhì)顆粒在超速離心場內(nèi)的沉降蛋白質(zhì)顆粒在超速離心場內(nèi)的沉降趨勢趨勢,不但與其分子大小有關(guān)且與之密度有關(guān)不但與其分子大小有關(guān)且與之密度有關(guān).沉降系數(shù)沉降系數(shù):沉降速率法：沉降速率法：單位離心場的沉降速度是個定值，稱沉降系數(shù)單位離心場的沉降速度是個定值，稱沉降系數(shù)s。沉降平衡法：沉降平衡法：沉降產(chǎn)生濃度梯度沉降產(chǎn)生濃度梯度沉降系數(shù)沉降系數(shù)（sedimentation coefficientsedimentation coefficient，s s）根據(jù)根據(jù)19241924年年SvedbergSvedberg對沉降系數(shù)下的對沉降系數(shù)下的定義定義：顆粒在單位離心力場中移動的速度。顆粒在單位離心力場中移動的速度。S S實際上時實際上時常在常在1010-13-13 秒左右，故把沉降系數(shù)秒左右，故把沉降系數(shù)1010-13-13秒稱為一秒稱為一個個SvedbergSvedberg單位，簡寫單位，簡寫S S，單位為秒，單位為秒.