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第一章 基因工程,第一節(jié) 工具酶的發(fā)現(xiàn)和 基因工程的誕生,1,思考：,什么叫基因？ 基因、DNA、染色體之間是怎樣的關(guān)系？ 什么是遺傳信息？如何表達(dá)？,2,三文魚原是西餐和日本料理的主要原料，不僅味道鮮美，而且富含有益心血管健康的奧米伽-3脂肪酸。三文魚種類不少，在國內(nèi)市場上最常見的是大西洋鮭，野生的大西洋鮭因?yàn)檫^度捕撈，已瀕臨滅絕，市場上賣的大西洋鮭99％以上是人工養(yǎng)殖的。 大西洋鮭的生長速度緩慢，第一年體重只增加20～30克，一般要養(yǎng)三年才能上市。因此可以給大西洋鮭轉(zhuǎn)入體型最大的三文魚——大鱗大麻哈魚的生長激素基因。,轉(zhuǎn)基因魚,3,剪切,轉(zhuǎn)基因魚的構(gòu)建,,大麻哈魚生長激素基因,目的基因,,大西洋鮭受精卵,受體細(xì)胞,魚類因其產(chǎn)卵量大且體外受精而成為研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的最佳入選動(dòng)物 。,（外源基因）,運(yùn)載體DNA+目的基因,重組DNA分子,4,基因工程的概念,其核心是構(gòu)建重組DNA分子,（重組DNA技術(shù)）,廣義：把一種生物的基因轉(zhuǎn)入另一種生物體中，使其產(chǎn)生我們需要的基因產(chǎn)物，或者讓它獲得新的遺傳性狀。,5,生物體外,基因,分子水平,產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物,基因重組,操作環(huán)境：,操作對象：,操作水平：,基本原理：,工程結(jié)果：,讓目的基因在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定高效地表達(dá),操作目的：,基本過程：,從此大西洋鮭的身上得到了世界上從沒有過的基因？,（不產(chǎn)生新基因，產(chǎn)生新物種嗎？）,6,理論基礎(chǔ),DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立 遺傳信息傳遞方式(中心法則)的認(rèn)定,—使來自異種生物的DNA拼接成為可能,——使基因在異種生物 細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成為可能,基因工程的誕生,技術(shù)保障,,工具酶,7,思考：,如何將大馬哈魚細(xì)胞內(nèi)的生長素基因從它的DNA分子中切割下來？,如何將切下來的生長素基因與載體DNA連接起來？,如何將重組的DNA運(yùn)送到大西洋鮭細(xì)胞？,需要切割DNA的工具（分子手術(shù)刀）,需要連接DNA片斷的工具 （分子縫合針）,需要基因轉(zhuǎn)移的工具（分子運(yùn)輸車）,——限制性核酸內(nèi)切酶,——DNA連接酶,——基因載體,8,細(xì)菌,4000種，常用200多種。,一、限制性核酸內(nèi)切酶 — “分子手術(shù)刀”（簡稱限制酶）,對DNA特定的核苷酸序列進(jìn)行識(shí)別和切割,基因工程的基本工具,能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊核苷酸序列的酶 。,思考能否切割煙草花葉病毒上人們想要的目的基因？,9,,重播,EcoRI,識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開,,,限制酶在切斷DNA時(shí)，可在切口處帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間堿基正好互補(bǔ)配對，因此稱這些片斷為粘性末端。,5′,5′,3′,3′,,10,平末端：平切,粘性末端：錯(cuò)切,作用結(jié)果：,11,12,思考：,要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？,切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會(huì)怎樣呢？,會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端。,如果讓兩者的黏性末端通過氫鍵連接起來，是否 就可以形成重組的DNA分子了？,13,,,14,三、基因工程的基本工具,2、DNA連接酶,兩條鏈的骨架部分，形成磷酸二酯鍵,連接部位：,具有相同黏性末端的兩個(gè)DNA片段連接起來，形成重組DNA分子。,結(jié)果：,限制酶和DNA連接酶的作用部位都是磷酸二酯鍵， 只是一個(gè)是切開，一個(gè)是連接,注意：,,,思考,氫鍵的斷裂與形成與限制酶、DNA連接酶無關(guān)。,15,思考：,用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要形成幾 個(gè)磷酸二酯鍵？,2個(gè),用限制酶切一個(gè)特定基因要切斷幾個(gè)磷酸二酯鍵？,4個(gè),外源基因（如抗蟲基因）怎樣才能運(yùn)送到受體細(xì)胞（如棉花細(xì)胞）？,需要“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,16,三、基因工程的基本工具,3、基因載體（載體）,作為運(yùn)載工具，將外源基因送入受體細(xì)胞。,作用：,條件：,⑴能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存,⑵有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，可使外源基因插入 其中,⑶具有某些遺傳標(biāo)記基因，以便進(jìn)行篩選,⑷對受體細(xì)胞無害,質(zhì)粒（最常用）、噬菌體和某些動(dòng)植物病毒,種類：,,17,質(zhì) 粒,細(xì)菌及酵母菌等。最常用的是大腸桿菌的質(zhì)粒。,來源：,本質(zhì)：,特點(diǎn)：,染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子。,能自我復(fù)制； 常具有抗生素抗性基因(標(biāo)記基因)； 其存在對宿主細(xì)胞無影響。,可以檢測質(zhì)粒是否導(dǎo)入了受體細(xì)胞,要想將某個(gè)特定基因與質(zhì)粒相連，需要用幾種限制性核酸內(nèi)切酶處理？,1種,18,四、基因工程的誕生,時(shí)間：,1972年，斯坦福大學(xué) 合成第一個(gè)人工DNA重組產(chǎn)物 1973年，斯坦福大學(xué) 實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌之間的性狀轉(zhuǎn)移 ——標(biāo)志基因工程的誕生,20世紀(jì)70年代,不同生物的DNA能拼接在一起,基因工程的成功能說明哪些問題？,小結(jié),說明所有生物的DNA都具有相同的化學(xué)組成(四種脫氧核苷酸)和空間結(jié)構(gòu)(雙螺旋結(jié)構(gòu)),一種生物的基因能夠在另一種生物體內(nèi)表達(dá),說明基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段，具有一定的獨(dú)立性，同時(shí)也說明各種生物共用一套遺傳密碼,19,小結(jié)：,基因工程誕生于 。,基因工程誕生的理論基礎(chǔ)： 。,基因工程創(chuàng)建的技術(shù)保障： 。,其中限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 為 提供了必要的手段， 而載體 ，達(dá)到了基因 工程的目的。,練習(xí),20,練習(xí)：,1、科學(xué)家們經(jīng)過多年努力，創(chuàng)立了一種新興生物技術(shù)——基因工程，實(shí)施該工程的最終目的是 A. 定向提取生物體的DNA分子 B. 定向地對DNA分子進(jìn)行“剪切” C. 在生物體外對DNA分子進(jìn)行改造 D. 定向地改造生物的遺傳性狀,【答案：D】,2、以下說法正確的是 A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)， 以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來,【答案：C】,21,練習(xí)：,4、基因工程又叫重組DNA技術(shù)。假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為 基因載體，并以同一種限制性核酸內(nèi)切酶切割載體與目的基因，將切割后的載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有 種環(huán)狀DNA分子(假設(shè)兩兩結(jié)合)，它們分別是：,3,運(yùn)載體與運(yùn)載體相連、目的基因與目的基因相連、運(yùn)載體與目的基因相連,3、人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗菌素抗性基因，該抗性基因的主要作用是 A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B.有利于對目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行檢測 C.增加質(zhì)粒分子的分子量 D.便于與外源基因連接,【答案：B】,22,5、下圖是將人的生長激素基因?qū)隑細(xì)胞內(nèi)制造“工程菌”示意圖，所用載體為質(zhì)粒A。已知細(xì)菌B細(xì)胞內(nèi)不含質(zhì)粒A，也不含質(zhì)粒A上的基因，質(zhì)粒A導(dǎo)入細(xì)菌B后，其上的基因能得到表達(dá)。請回答下列問題：,(1)若把通過鑒定證明導(dǎo)入了普通質(zhì)粒A或重組質(zhì)粒的細(xì)菌放在含有氨芐青霉素的培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，會(huì)發(fā)生的現(xiàn)象是： 其原理是： (2)導(dǎo)入B細(xì)胞中的目的基因成功表達(dá)的標(biāo)志是：,有的能生長,有的不能生長,普通質(zhì)粒含氨芐青霉素基因；重組質(zhì)粒氨芐青霉素基因被 破壞。,能合成人的生長激素,23,6、限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。 ①請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。 ②請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。 ③在DNA連接酶的作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接起來？為什么？,能。因?yàn)橛蓛煞N限制性切割后所形成的黏性末端是相同的。,,,24,有關(guān)DNA酶,將兩個(gè)DNA片段通過磷酸二酯鍵連接。,DNA水解酶： DNA解旋酶： 限制性核酸內(nèi)切酶： DNA聚合酶： DNA連接酶：,將DNA水解成四種脫氧核苷酸，徹底水解時(shí)生成磷酸、脫氧核糖和含氮堿基。,使DNA解旋成單鏈，作用部位是堿基與堿基之間的氫鍵。（在適當(dāng)?shù)母邷?、重金屬鹽的作用下，也可使DNA解旋）,以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成互補(bǔ)DNA鏈。,將DNA切成片斷，作用部位是磷酸二酯鍵。,25,思考：,假如外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制會(huì)怎樣？ 作為載體如果沒有限制酶切割位點(diǎn)將怎樣？ 外源基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何去察覺？ 如果載體對受體細(xì)胞有害將怎樣？,會(huì)在細(xì)胞增殖中丟失,外源的基因不可能插入,如果載體上有遺傳標(biāo)記基因，就可通過標(biāo)記基因的表達(dá)來檢測。,將影響受體細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)而使轉(zhuǎn)入的外源基因也可能無法表達(dá)。,,26,