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1.2 基因工程的基本操作程序,專題一 基因工程,1,基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取,基因表達(dá)載體的構(gòu)建,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因的檢測與鑒定,2,為什么要有“目的基因的獲取”這一步？,有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。,一、目的基因的獲取,3,真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),什么是“目的基因” ？,原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu),4,目的基因主要是______________________，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、種子貯藏蛋白基因及人胰島素基因等。,5,3）人工合成,1）從基因文庫中獲取目的基因,獲得目的基因的方法,2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,未知目的基因的核苷酸序列,已知目的基因的核苷酸序列,且基因比較小,且基因比較大,6,將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。,1.基因文庫概念,7,2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類,種類,,部分基因文庫：只包含了一種生物的部 分基因，如：cDNA文庫,基因組DNA文庫：含有一種生物的全部 基因,8,3、基因文庫的構(gòu)建,（1）基因組文庫的構(gòu)建,提取某生物 全部DNA,,用適當(dāng) 限制酶切割,許 多 DNA片段,,與載體連接 導(dǎo)入受體菌群,該生物基 因組文庫,（每個受體菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文庫的構(gòu)建——mRNA反轉(zhuǎn)錄形成,與載體連接 導(dǎo)入受體菌群,,mRNA,,逆轉(zhuǎn)錄酶,,,雜交雙鏈,,核酸酶H,,單鏈DNA,,DNA聚合酶,,,雙鏈DNA (cDNA),,該生物 cDNA文庫,9,基因組DNA文庫,cDNA文庫,10,真核生物轉(zhuǎn)錄過程,11,基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較,某種生物部分基因,某種生物全部基因,小,大,無,有,無,有,可以,部分基因可以,12,村長, 為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物中提取不行嗎？？？,當(dāng)然行啊。構(gòu)建基因文庫只是獲取目的基因的方法之一。但是，有時我們完全不知道目的基因序列，或者想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道幾種生物之間有哪些基因不同，或者想知道一種生物在不同的發(fā)育階段都表達(dá)哪些基因，或者想得到一種生物的全部基因序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。,4.基因文庫的目的,13,1、 概念：PCR全稱為_______________，是一項 在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù) 通過這項技術(shù)可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因 因為整個過程是在體外進(jìn)行，所以又叫做體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,2、原理：,DNA復(fù)制,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,14,四種脫氧核苷酸(dNTP),一對引物：,熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),4、條件：,一小段單鏈DNA或RNA，一般20～30個堿基，能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對。,已知目的基因的核苷酸序列,3、前提：,溫度控制,15,以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）,PCR擴(kuò)增儀,5、方式：,指數(shù),2n,6、結(jié)果：,使目的基因的片段在短時間內(nèi)大量地擴(kuò)增,16,擴(kuò)增過程,a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板 在熱作用下， 斷裂，形成_______,b、復(fù)性（55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物 與DNA模板結(jié)合，形成局部________。,c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從 引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,17,PCR儀,微量離心管,18,一 次 性 吸液槍頭,,調(diào)節(jié)輪,,卸槍頭按鈕,,推動按鈕,,卸槍頭器,,微量移液器,19,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,20,堿基互補(bǔ)配對,四種脫氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高溫下變性解旋,解旋酶催化,體外復(fù)制,細(xì)胞核內(nèi),熱穩(wěn)定的DNA聚合酶,細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整個DNA分子,21,通過DNA合成儀用化學(xué)方法人工合成,DNA合成儀,蛋白質(zhì)的氨基酸順序,mRNA 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,,,,推測,推測,合成,當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測得或核苷酸序列已知時，可采用此種方法。,DNA合成儀,22,為什么要有“表達(dá)載體的構(gòu)建”這一步？,單獨的DNA片段─目的基因是不能穩(wěn)定遺傳的。,構(gòu)建表達(dá)載體的目的是為了使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用。,23,,1.用一定的_______切割載體，使其出現(xiàn)一個切口，露出_______ 。 2.用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生 。,—— 核心,3.將切下的目的基因片段插入載體的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子,限制酶,黏性末端,同一種限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA連接酶,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,,,,24,基因表達(dá)載體的組成：,c、目的基因,b、啟動子,d、終止子,e、標(biāo)記基因,a、復(fù)制原點,25,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。,終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。,26,27,28,,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,常用的受體細(xì)胞：,動植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理：,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。,轉(zhuǎn)化——,目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在 受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程,受體細(xì)胞,穩(wěn)定,表達(dá),29,方法,,導(dǎo)入植物細(xì)胞,導(dǎo)入動物細(xì)胞,導(dǎo)入微生物細(xì)胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,——顯微注射法,——感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,30,農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的染色體上,31,基因槍法,基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體-DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。,32,花粉管通道法,植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加表達(dá)載體-DNA ，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。,33,顯微注射法,提純含目的基因表達(dá)載體,取受精卵,顯微注射,移植到子宮,,受精卵發(fā)育,,新性狀動物,34,2.微生物作受體細(xì)胞原因：,將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,3.轉(zhuǎn)化方法：,大腸桿菌,繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少,1.常用菌：,感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞,Ca2+處理大腸桿菌,,感受態(tài)細(xì)胞,,表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合,,感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA,35,不能，受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)。,DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？,例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。,36,,(四)目的基因的檢測與鑒定,——檢查是否成功,分子 檢測,個體 鑒定：,,①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交,抗原-抗體雜交,37,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA,附著在膜上,硝化纖維素,,加探針,,含熒光素分子,變性,DNA雜交 （如檢測SARS病毒等）,a,b,c,d,38,如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品含有目的基因或目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。,39,細(xì)菌的檢測，將每個受體細(xì)胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。,40,41,基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學(xué)方法人工合成 構(gòu)建基因表達(dá)載體 目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、顯微注射法 目的基因的檢測與鑒定 檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯、個體水平鑒定,42,思考：1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因為目的基因在表達(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)； （2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；,43,（3）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （4）為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （5）有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。,44,2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?,①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物； ②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,酚類化合物,45,3.利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系前面有關(guān)細(xì)胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？,有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,46,（1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。 （2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個表達(dá)載體。 （3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 （4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。,4.β-珠蛋白是動物血紅蛋白的重要組成成分。當(dāng)它的成分異常時，動物有可能患某種疾病，如鐮刀形細(xì)胞貧血癥。假如讓你用基因工程的方法，使大腸桿菌生產(chǎn)出鼠的β-珠蛋白，想一想，應(yīng)如何進(jìn)行設(shè)計？,47,1.下表關(guān)于基因工程中有關(guān)基因操作的名詞及對應(yīng)的內(nèi)容，正確的組合是,2、下列屬于獲取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提取 ③從受體細(xì)胞中提取 ④利用PCR技術(shù) ⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥,48,3.細(xì)菌的質(zhì)粒分子帶有一個抗菌素抗性基因，該抗性基因在基因工程中的主要作用是 A．提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性 B．有利于對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測 C．增加質(zhì)粒分子的分子量 D．便于與外源基因連接 4. 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A．限制酶只在獲得目的基因時才用 B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的 C．質(zhì)粒都可作為運載體 D．蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,49,5.哪項不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A.啟動子 B.終止密碼 C.標(biāo)記基因 D.目的基因 6.下列哪項不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法( ) A．基因槍法 B．顯微注射法 C.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D．花粉管通道法,50,(多選)采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 A.將毒素蛋白直接注射到棉受精卵中 B. 將編碼毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉受精卵中 C.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入農(nóng)桿菌，用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng) D.將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉子房并進(jìn)入受精卵,C D,51,運用現(xiàn)代生物技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因整合到棉花細(xì)胞中，為檢測實驗是否成功，最方便的方法是檢測棉花植株是否有 A抗蟲基因 B.抗蟲基因的產(chǎn)物 C 新的細(xì)胞核 D. 相應(yīng)性狀,D,,52,