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1、第五章第五章 生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)v了解生物芯片的功能、作用、以及生物芯片技術(shù)的最新進展。v熟悉生物芯片的種類、作用以及基因芯片、蛋白芯片的原理及其制備方法。v掌握基因芯片的工作原理、制備方法及其在臨床診斷中的意義。第一節(jié)第一節(jié) 生物芯片概述生物芯片概述 早在八十年代初有人就曾設想利用計算機半導體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對人類基因組大量的遺傳信息進行分析和檢查，但直到光引導原位合成(light-directed in situ synthesis)高密度探針技術(shù)和激光共聚焦顯微掃描問世之后才使該設想逐步成為現(xiàn)實，并迅速應用到分子生物學的多個領域，得到了科學界的高度重視。生物生物芯芯片生物芯片技術(shù)

2、是一種高通量檢測技術(shù)。通常我們所說的生物芯片是將含不同生物信息的生物分子集成集成到一塊芯片上,用以同時分析多種生物分子的信息。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。DNA的一些基本概念的一些基本概念u絕大多數(shù)的生物是用DNA做為遺傳物質(zhì)。u生物的每個細胞都包含了完整的DNA信息。u每個人類細胞包含了30億個堿基（A，G，C，T）。u不同物種的DNA序列都不同，每個生物體之間也有差異。因此，我們可以用DNA檢測來鑒定和檢測物種和個體。人有多少基因?Fruit fly:13,000 genesHuman:28,000 genes.The s

3、urprisingly small number of genes in the human genome(100,000 expected;30,000 identified)was a major surprise from the project.Human Beings are 99.99%the same Millions of differences between of us先天愚型也稱21三體綜合征(47XX+21)或Down綜合征（唐氏綜合征），屬常染色體畸變遺傳病藍膚癥：藍色的人，整個十九世紀60年代，一個龐大的“藍人”家族居住在肯德基州山上，緊挨著克里克聯(lián)盟的印第安人。A

4、n enzyme called“NADH diaphorase,”(輔酶輔酶脫氫酶脫氫酶)。This enzyme repairs hemoglobin that has been damaged by oxidization.Humans in whom this gene is defective cannot make the enzyme,and accumulate damaged hemoglobin,which is blue.As a result,their skin appears blue.什么使他們倆不一樣什么使他們倆不一樣什么使他成這樣什么使他成這樣v速度快、效率高v

5、可同時對大量核酸序列進行檢測和分析v操作簡便、自動化程度更高v總體效率較常規(guī)雜交方法高一、生物芯片的定義一、生物芯片的定義生物芯片是采用類似集成電路制作中的微加工技術(shù)，將生命科學研究中的若干不連續(xù)過程如樣品制備、生化反應、檢測和分析等步驟集成到一塊幾平方厘米大小的芯片上，并使這些分散的過程連續(xù)化與微型化，以此來實現(xiàn)對大量生物樣品數(shù)據(jù)的快速、自動和并行處理。生物芯片（biochip）采用原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子生物大分子比如核酸片段、多肽等等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子雜

6、交，通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機（CCD）對雜交信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。二、生物芯片的特點二、生物芯片的特點v高通量、集成化、并行化和微型化特點特點v高通量：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。v集成化：降低成本，保證質(zhì)量。v高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。v微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率。生物芯片根據(jù)探針不同分為：DNA芯片，蛋白質(zhì)芯片，細胞芯片，組織芯片。根據(jù)用途不同，可分為：表達分析芯片，測序芯片和芯片實驗室根據(jù)原理和載體不同，可分為：固相芯片和液相芯片v微縮芯

7、片實驗室：是生物芯片發(fā)展的最終目標，將各種生物化學分析操作的整個過程，從樣品制備、生化反應到結(jié)果檢測，都集成化并縮微到芯片上自動完成，以獲得所謂的微型全分析系統(tǒng)生物芯片的應用生物芯片的應用v分子生物學、生物進化（生物起源及新物種鑒定）v生物醫(yī)學（新藥的篩選與合成，疾病診斷和治療，如癌癥、早年性癡呆癥等的病因研究）v農(nóng)林科學（農(nóng)作物育種改良、食品衛(wèi)生監(jiān)督、微生物檢測）v環(huán)境科學v生化武器偵檢v司法鑒定等第一節(jié) 基因芯片一、基因芯片的原理二、基因芯片技術(shù)三、基因芯片的應用一、基因芯片的原理一、基因芯片的原理v基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測序技術(shù)上的一種高效、快速的核酸序列分析手段。v原理：將

8、大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行基因的分析。DNA Microarry 原理原理:DNA雜交雜交堿基互補堿基互補雜交是雜交是根據(jù)堿基互補的原理。探針分子固定于支持物上探針分子固定于支持物上固定于支持物上的探針固定于支持物上的探針,與標記的樣品進行雜交與標記的樣品進行雜交利用基因探針到基因混合物中識別特定基因。固定于支持物上的探針固定于支持物上的探針,與標記樣品的堿基不互補與標記樣品的堿基不互補則探針與樣品不能進行雜交則探針與樣品不能進行雜交通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析從而得到基因的表達水平從

9、而得到基因的表達水平 正常正常 高表達高表達 低表達低表達通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。基因芯片技術(shù)流程圖基因芯片技術(shù)流程圖 v 基因芯片技術(shù)從本質(zhì)上說與Southern Blotting或Northern Blotting相同（所以Affymetrix曾與Southern就專利問題產(chǎn)生沖突），只是探針密度極高而已。不過，為此花費了大量的人力物力從事研制工作。當然，其結(jié)果也很是誘人。1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探針：高密度的探針序列按照一定的次序固定在支持物上，每個位點的序列是已知的外觀探針支持物剖面圖平面局部放大硬件：序列合成設備包括：核酸或多肽合成

10、儀（作預合成點樣用）、照相平板印刷及半導體制作相應設備（作光引導原位合成）。激光共聚焦顯微掃描設備：激光共聚焦顯微鏡或相應設備，以采集高密度點陣雜交信號并進行數(shù)字化處理分析。軟件基因序列分析及探針篩選技術(shù)（可能涉及專利等產(chǎn)權(quán)問題）序列合成及定位技術(shù)（光引導原位合成或微量點樣技術(shù)）雜交信號的采集和分析技術(shù)（需要處理極大量的雜交信號并能由此得到所需信息）二、基因芯片技術(shù)二、基因芯片技術(shù)v基因芯片技術(shù)主要包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測以及結(jié)果分析。（一）芯片制備 1.合成探針 探針合成是基因芯片制作的首要步驟。基因組探針：從基因組文庫中選擇與待測靶序列完全匹配或帶有突變 位

11、點的序列，通過PCR技術(shù)擴增獲得cDNA探針：根據(jù)待分析基因表達的mRNA，從cDNA文庫中通過PCR技術(shù) 擴增獲取，擴增片段的選擇盡可能靠近cDNA序列的3端，長度一般在1kb左右寡核苷酸探針：對于較短的寡核苷酸探針，則可以直接應用DNA合成 儀合成2.探針在載體表面的固定（分為兩大類）原位合成：在支持物表面原位合成寡核苷酸探針，適用于寡核苷 酸，有原位光刻合成、壓電打印法和分子印章原位合 成三種途徑合成點樣：將預先合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的 高速點樣機器人直接點在芯片上的技術(shù)，用于大片段 DNA，寡核苷酸，mRNA。固相載體材料固體片狀材料：主要有玻片、硅片和瓷片等；膜

12、性材料：有硝酸纖維素膜、尼龍膜以及聚丙烯膜等?；蛐酒嗖捎幂d玻片或者尼龍膜做載體為使探針能穩(wěn)定固定在片基表面，需對片基進行化學處理，即活化，主要是涂布多聚賴氨酸或者包被氨基硅烷偶聯(lián)試劑 原位合成有三種途徑：原位合成有三種途徑：原位光刻合成壓電打印法 分子印章原位合成法。DNA固相合成法DNA固相合成法原位光刻合成v原理：v首先使支持物羥基化，光敏保護基團將其保護。v在合成堿基單體的5羥基末端連上一個光敏保護基。v選取適當?shù)谋喂饽?mask)使需要聚合的部位透光，受光部位的羥基脫保護而活化。v因為合成所用的單體分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護基的保護，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應后仍

13、舊帶有光敏保護基團。v每次通過控制透光與不透光決定哪些區(qū)域應被活化，以及所用單體的種類和反應次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預定序列寡聚體的目的。v 圖103原位光刻合成技術(shù)的流程圖 原位光刻合成v優(yōu)點：合成效率高，點陣密度高v缺點：設備昂貴，技術(shù)復雜，反應產(chǎn)率低壓電打印法原理v其裝置與普通的彩色噴墨打印機并無兩樣，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。v將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計算機控制噴墨打印機將特定種類的試劑噴灑到預定的區(qū)域上。沖洗、去保護、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術(shù)。如此類推，可以合成出長度為40到50個堿基的探針。v 優(yōu)點：設備廉價，技術(shù)相對

14、簡單，反應產(chǎn)率高v 缺點：點陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染壓電打印原位合成法工作方式 預合成點樣技術(shù)（Off-chip synthesis)這一方法在多聚物的設計方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA或蛋白固相合成儀進行。多聚物合成后再用特殊的點樣裝置或儀器將其以較高密度分布于硝酸纖維膜或經(jīng)過特殊處理的玻璃片上，點陣密度可達到2500spots/cm2（Yershov et al報道點陣密度最高可達20,000-30,000spots/cm2）。二、樣品的制備二、樣品的制備v樣品的制備過程包括：核酸分子的純化、擴增和標記1樣品的分離純化樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得主要從活組織或血液中獲得

15、DNA或或mRNA，這個，這個過程包括細胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸過程包括細胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。的過程。二、樣品的制備二、樣品的制備v2.擴增：測定過程需要較多的樣本v基因類型分析的樣本是DNA（PCR直接擴增）v基因表達研究的樣本是cDNA（RT-PCR制備）v3.標記：v樣本制備后應進行標記，通常為酶標記、熒光標記和核素標記。v帶有標記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴增的過程，摻入靶分子序列。v也可以在制備引物時，摻入標記的核苷酸，擴增靶序列后，使擴增產(chǎn)物末端帶有標記物。v 樣品分子標記的質(zhì)量

16、影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反樣品分子標記的質(zhì)量影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標記等各環(huán)節(jié)要求嚴格操作。轉(zhuǎn)錄以及標記等各環(huán)節(jié)要求嚴格操作。v熒光標記分辨率高于同位素標記，沒有同位素標記的限制，而且可以采用雙色，如對照樣品標紅色，待檢樣品標綠色，有助于結(jié)果分析與判斷，因此被廣泛應用于基因芯片樣品的標記。（三）雜交反應v雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行反應,產(chǎn)生一系列信息的過程，是芯片技術(shù)中除芯片制備外最重要的一步。v原理：液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應v 芯片雜交反應的條件依據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應時間。依

17、據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應時間。通常采用的條件是：通常采用的條件是：4242，50%50%甲酰胺，甲酰胺，6 6SSCSSC，0.5%SDS0.5%SDS，5 5DenhardtDenhardt試劑。試劑。也可采用也可采用6565，6 6SSCSSC，0.5%SDS0.5%SDS，5 5DenhardtDenhardt試劑或者試劑或者6565，10%SDS10%SDS，7%PEG-8007%PEG-800。雜交過程類似雜交過程類似NorthernNorthern或或SouthernSouthern雜交，如封閉液預雜交、雜交、清洗、雜交，如封閉液預雜交、雜交、清洗、干

18、燥與檢測。干燥與檢測。v選擇合適的反應條件能減少生物分子之間的錯配率。v選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補模板雜交。v溫度、非特異性本底等均會影響雜交結(jié)果v 最好在封閉循環(huán)條件下雜交（四）信號檢測和分析v雜交信號的檢測方法很多，如熒光顯影法、質(zhì)譜法、化學發(fā)光和光導纖維等，其中使用最廣泛的是熒光顯影法。熒光檢測法的主要過程v主要過程：熒光素標記擴增過的靶序列或樣品，與芯片上的探針雜交，洗去未雜交分子，熒光顯微鏡對片基進行掃描，采集每點熒光強度并分析比較。v正常的堿基配對雙鏈比錯配雙鏈分子具有較高的穩(wěn)定性，探針與樣品完全配對時產(chǎn)生的熒光

19、信號強度更強，且熒光信號的強度還與樣品中靶分子的含量呈一定的線性關系。因此精確測定熒光信號強度就可反映雜交反應的特異性和強弱。v分析檢測熒光強度的主要手段：v激光共聚焦顯微掃描技術(shù)和電荷偶聯(lián)裝置照相機(charged-coupled device camera,CCD)（四）顯色和分析測定方法（四）顯色和分析測定方法熒光法：重復性好，但靈敏度較低。（正常配對與錯配均能發(fā)出陽性信號）多色熒光技術(shù)：提高基因芯片檢測的準確性和測量范圍。（把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的熒光物來修飾）光纖DNA生物傳感器微陣列(fiber-optic DNA biosensor microarray)：（將生物傳感

20、器與微陣列的優(yōu)勢結(jié)合在一起的方法）操作分析過程非?？焖?，5min內(nèi)即可完成，且不需要激光共聚焦顯微鏡?；蛐酒兄频目傮w藍圖 研制方向的確定基因組序列分析與待檢基因探針序列的確定檢測樣品 的制備探針陣列的準備檢測設備的研制雜交檢測與數(shù)據(jù)分析基因芯片的應用基因芯片的應用Kary B.Mullis,PhDNobel Prize 1993polymerase chain reaction(PCR)聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應 DNA 擴增DNA 擴增RT-PCR 測定基因表達水平 RNAControlCellsTreatedCells RNA測數(shù)個基因PCRElectrophoresiscDNAVE

21、GF實時實時PCR (Real Time PCR)測數(shù)十個基因測數(shù)十個基因 正常正常 高表達高表達 低表達低表達基因芯片基因芯片同時檢測數(shù)千基因的表達。三、基因芯片的應用三、基因芯片的應用1.尋找和發(fā)現(xiàn)新基因?qū)ふ液桶l(fā)現(xiàn)新基因?qū)DNAcDNA文庫的克隆擴增，以點陣形式排列在載文庫的克隆擴增，以點陣形式排列在載體上，用特定的寡核苷酸探針系統(tǒng)與其雜交，體上，用特定的寡核苷酸探針系統(tǒng)與其雜交，對雜交信號進行分析即可快速地對文庫中代表對雜交信號進行分析即可快速地對文庫中代表不同基因的不同基因的cDNAcDNA克隆予以鑒定和分類。通過相克隆予以鑒定和分類。通過相應的公式計算出克隆的相似系數(shù)，并進行比應

22、的公式計算出克隆的相似系數(shù)，并進行比較，不但可以得到各基因的表達豐度，而且可較，不但可以得到各基因的表達豐度，而且可以發(fā)現(xiàn)新的基因。以發(fā)現(xiàn)新的基因。三、基因芯片的應用三、基因芯片的應用2.基因表達分析基因表達分析 對基因功能的研究對基因功能的研究將大量的功能基因制成表達譜芯片，用不同的熒光染料將大量的功能基因制成表達譜芯片，用不同的熒光染料標記不同組織或細胞的標記不同組織或細胞的mRNAmRNA與芯片上的基因雜交、掃與芯片上的基因雜交、掃描，可得到基因在不同組織或細胞的表達譜。再通過描，可得到基因在不同組織或細胞的表達譜。再通過計算機分析這些基因在不同組織中表達的差異，可直計算機分析這些基因在

23、不同組織中表達的差異，可直接快速地同時監(jiān)測成千上萬的基因，這是進行基因功接快速地同時監(jiān)測成千上萬的基因，這是進行基因功能研究的重要而高效的手段。能研究的重要而高效的手段。2、基因表達分析、基因表達分析三、基因芯片的應用三、基因芯片的應用3.DNA序列測定與序列間比較序列測定與序列間比較（1）DNA序列測定序列測定 雜交測序技術(shù)雜交測序技術(shù)(sequencing by hybridization,SBH)(sequencing by hybridization,SBH)鄰堆雜交技術(shù)鄰堆雜交技術(shù)(contiguous stacking hybridization,CSH)(contiguous s

24、tacking hybridization,CSH)原理原理:將未知序列的靶將未知序列的靶DNADNA與大量含不同序列的寡核苷酸集合雜與大量含不同序列的寡核苷酸集合雜交形成完整的雙鏈體，根據(jù)堿基配對的原理確定其互補的靶核交形成完整的雙鏈體，根據(jù)堿基配對的原理確定其互補的靶核酸序列。對雜交部位進行鑒定和分析并經(jīng)計算機分析處理，拼酸序列。對雜交部位進行鑒定和分析并經(jīng)計算機分析處理，拼接出正確的靶接出正確的靶DNADNA序列。序列。DNA測序測序。如使用美國Affymetrix公司1998年生產(chǎn)出的帶有13.5萬個基因探針的芯片就可以使人類DNA解碼速度提高了25倍。三、基因芯片的應用三、基因芯片的

25、應用v（2）序列比較研究 v在遺傳分析和基因組分析中，常常需要進行大規(guī)模的序列比較，確定序列之間的相似性。v原理：一特定DNA在芯片上的雜交特征可與一已知序列的DNA片段相比較，一個最高得分的特定DNA清單(LIST)與已知序列的清單比較用來判斷其相似性。v序列分析可加快人們對于不同物種的相關序列的比較研究，可用于人類基因組多樣性和進化研究計劃。三、基因芯片的應用三、基因芯片的應用4.突變體和多態(tài)性的檢測突變體和多態(tài)性的檢測利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸利用結(jié)合在玻璃支持物上的等位基因特異性寡核苷酸(ASOs)(ASOs)微陣列建立了簡單快速的基因多態(tài)性分析方法。微陣列建立了簡

26、單快速的基因多態(tài)性分析方法。（apo(a)(TTTTA)napo(a)(TTTTA)n）5.在疾病診斷的應用在疾病診斷的應用（1）感染性疾病的診斷 性傳播疾病、肝炎等。（2）遺傳性疾病的診斷 地中海貧血、婚前檢查等。（3）耐藥性檢測 結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測芯片等。5、疾病診斷、疾病診斷其優(yōu)點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二是快速簡便；三是可同時檢測多種疾病?；虮磉_水平的異?？梢鸺膊腫瘤細胞多種致癌基因表達升高v腫瘤細胞多種腫瘤抑制基因表達降低v常染色體顯性遺傳性多囊腎 Polycystic Kidney Disease vPKD1 和 PKD2 先天異常v多在40歲以后發(fā)病v

27、半數(shù)出現(xiàn)腎衰遺傳病遺傳病 遲發(fā)型遲發(fā)型基因突變基因突變癌癥抑制基因癌癥抑制基因BRCA1 和和 BRCA2 突變可引起乳腺癌突變可引起乳腺癌檢測檢測BRCA1 和和 BRCA2 突變及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌突變及早發(fā)現(xiàn)乳腺癌癌癥有多基因突變癌癥有多基因突變突變的基因突變的基因P53P19p16子宮內(nèi)膜癌的基因表達上調(diào)的基因。子宮內(nèi)膜癌的基因表達下調(diào)的基因。Which treatment?What are my chances?Which class ofcancer?Is it benign?基因在癌癥研究中的應用基因在癌癥研究中的應用 Understanding Cancer 6、藥物篩選和新藥開發(fā)、

28、藥物篩選和新藥開發(fā) 由于所有藥物都是直接或間接地通過修飾、改變?nèi)祟惢虻谋磉_及表達產(chǎn)物的功能而生效，而芯片技術(shù)具有高通量、大規(guī)模、平行性地分析基因表達或蛋白質(zhì)狀況的能力，在藥物篩選方面具有巨大的優(yōu)勢。其優(yōu)點為：其優(yōu)點為：在進入臨床試驗前，藥物基因組學可以通過化合物對基因多態(tài)性的影響挑選先導物，從而降低由于藥效的不穩(wěn)定導致的失敗幾率。在期臨床試驗中，個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥物代謝動力學差異。由于藥物作用靶蛋白的差異反映在基因多態(tài)性上，因此在期臨床試驗中，由個體基因型可以預見基因多態(tài)性造成的藥效差異，由此來指導期臨床試驗。一旦發(fā)現(xiàn)一種可以導致藥物作用差異的蛋白，其他與之相關的蛋白可作為

29、潛在的藥物作用靶。7、環(huán)境保護、環(huán)境保護 在環(huán)境保護上，基因芯片可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環(huán)境、人體、動植物的污染和危害，同時也能夠通過大規(guī)模的篩選尋找保護基因，制備防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產(chǎn)品。8 8、司法、司法 通過DNA指紋對比來鑒定罪犯，未來可以建立全國甚至全世界的DNA指紋庫，到那時以直接在犯罪現(xiàn)場對可能是疑犯留下來的頭發(fā)、唾液、血液、精液等進行分析，并立刻與DNA罪犯指紋庫系統(tǒng)存儲的DNA“指紋”進行比較，以盡快、準確的破案。9、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 基因芯片技術(shù)可以用來篩選農(nóng)作物的基因突變，并尋找高產(chǎn)量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關基因，也可以用于基

30、因掃描及基因文庫作圖、商品檢驗檢疫等領域。10.指導個體化用藥指導個體化用藥Individualized Chemotherapy種族、個體等因素都會導致遺傳背景的差異，臨床上，同樣劑量的藥物對于不同患者在藥物療效與副作用方面會有很大差異，如果利用基因芯片技術(shù)對患者進行診斷再開處方，就可以對患者實施個體化治療。疾病一般不是由單個基因引起的，在治療中很多同種疾病的具體病因是因人而異的，所以用藥也因人而異。第三節(jié)第三節(jié) 蛋白芯片蛋白芯片一、蛋白芯片的原理與分類二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測的基本流程三、蛋白質(zhì)芯片的應用 蛋白質(zhì)芯片（protein chip），又稱蛋白質(zhì)微陣列(protein micro

31、array)，是用于蛋白質(zhì)功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機械點樣或共價結(jié)合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質(zhì)上形成的生物分子點陣。2、蛋白質(zhì)芯片原理蛋白質(zhì)芯片原理蛋白芯片是指將大量蛋白質(zhì)分子(蛋白質(zhì)組)按預先設置的排列固定于一種載體表面行成微陣列，然后與要檢測的組織或細胞等進行“雜交”，再通過自動化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的“雜交”是指蛋白與蛋白之間如(抗體與抗原)在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別。蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome)是指一個基因，一個細胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組學研究的是在不同時間和空間發(fā)揮功

32、能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動的基本規(guī)律。生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生生物活性的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生生物活性的蛋白質(zhì)加工、修飾加工、修飾基因的轉(zhuǎn)錄基因的轉(zhuǎn)錄 表達表達 蛋白質(zhì)前體蛋白質(zhì)前體蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome)(proteome)是指一個基因，一個細胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組學研究的是在不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動的基本規(guī)律。蛋白質(zhì)組學可以分為三個領域:蛋白質(zhì)的大規(guī)模的分離與鑒定，以及它們的表達后修飾;蛋白水平的差異顯示在疾病中的運用;運用當前的一切手段研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互關系。蛋白質(zhì)組與基因組的相比蛋白質(zhì)組與基因組的相比:對

33、一個機體而言，基因的數(shù)目是恒定的，而蛋白質(zhì)的種類和數(shù)目在同一個機體的不同細胞中各不相同不相同，即使同一細胞在不同的時期，不同條件下，其蛋白質(zhì)表達也不同 。mRNA水平(包括mRNA 的種類和含量)并不能完全反映出蛋白并不能完全反映出蛋白質(zhì)質(zhì)的表達。另外從研究手段方面來說，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比基因技術(shù)相對要復雜和困難，不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質(zhì)組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴增目的片段，這樣對于那些含量很低但對細胞功能起重要作用的蛋白質(zhì)很難進行大規(guī)模的研究。2 蛋白質(zhì)芯片的特點蛋白質(zhì)芯片的特點:蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的研究方法，能在一次實驗中提供相當大的信息量，使我們能夠

34、全面、準確的研究蛋白表達譜。蛋白質(zhì)組芯片的靈敏度高，它可以檢測出蛋白樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達ng 級。蛋白質(zhì)芯片具有高度的準確性。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類按工作原理分為探針型和凝膠電泳型芯片探針型類似于DNA芯片，即在固相支持物表面高密度排列的探針蛋白質(zhì)點陣，可特異捕獲樣品中的靶蛋白，然后通過檢測器對靶蛋白進行定性或定量分析。微型化凝膠電泳板：在電場作用下，樣品中的蛋白質(zhì)通過芯片上的孔道分離開來，經(jīng)噴霧直接進入質(zhì)譜儀進行檢測，以確定樣品中蛋白質(zhì)的分子量及種類。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按點樣蛋白質(zhì)有無活性功能分為無活性和有活性的芯片。v無活性的芯片是將已經(jīng)合成好的蛋白

35、質(zhì)點在芯片上v有活性的芯片則是指點在芯片上的樣品是活的生物體（如細菌），在芯片上原位表達蛋白質(zhì)?；钚孕酒梢蕴峁┠M的機體內(nèi)環(huán)境，對于分析蛋白質(zhì)功能有利。蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按作用分為蛋白質(zhì)表達芯片(Protein expression chip,PEC)和蛋白質(zhì)功能芯片(Protein function chip,PFC)vPEC能通過觀察在不同條件下蛋白質(zhì)表達以及表達的水平而獲得此基因表達的詳細信息v而PFC則能分析眾多蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類v按樣品結(jié)合方式分為化學型和生物化學型。v化學型蛋白質(zhì)芯片是通過介質(zhì)的疏水力、靜電力、共價鍵等，利用反相層析、離子

36、交換層析、金屬螯合層析等結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)，然后經(jīng)特定的洗脫液除去雜質(zhì)蛋白質(zhì)，而保留感興趣的蛋白質(zhì)，這種芯片特異性較差。v生物化學型蛋白質(zhì)芯片則是指把生物活性分子（如抗體、受體、配體等）通過生化反應結(jié)合到芯片表面，用于捕獲樣品中的靶蛋白。v由于生物化學型芯片具有高度的特異性及生物活性分子的多樣性，其應用范圍和前景明顯優(yōu)于化學型蛋白芯片。二、蛋白質(zhì)芯片的制作和檢測基本流程二、蛋白質(zhì)芯片的制作和檢測基本流程v1.制備抗體文庫 利用噬菌體展示等技術(shù)制備v2.選擇固相載體片基 常用的載體片基材質(zhì)有硅、云母、各種膜片等。特定處理后承載吸附有關的生物活性分子。v3.制備探針蛋白質(zhì)及點樣v4.制備待檢樣品、

37、標記及與芯片進行抗原抗體反應 v5.蛋白質(zhì)的檢測 v基質(zhì)輔助的激光解吸附電離化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)v表面加強激光解析電離化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)v基質(zhì)輔助的激光解吸附電離化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)v原理：利用激光脈沖輻射使芯池中的待分析樣品解離形成荷電離子，由于具有不同質(zhì)荷比，這些離子在儀器場中飛行的時間長短不一，由此繪制出一張質(zhì)譜圖，經(jīng)計算機軟件處理得到模擬譜圖，對結(jié)果進行分析。v特點：快速、敏感，特異性高，同時不會破壞所測定的蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測的基本流程二、蛋白質(zhì)芯片制作和檢測的基本流程FBMSCFBVEGFIL6MIP-

38、1b IGF-1HGFosteoprotegrinPosNeg蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片Antibody-based protein array由于蛋白數(shù)目極其龐大(200000),利用蛋白質(zhì)芯片建立蛋白高通量檢測技術(shù)去研究在不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動的基本規(guī)律,其將會使生命科學的研究進行另一次飛躍。蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)缺點優(yōu)點:v高效率:同時檢測成千個蛋白v敏感性高缺點:v制作復雜,成本較高 v現(xiàn)行沒有令人滿意蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)優(yōu)點三、蛋白質(zhì)芯片的應用三、蛋白質(zhì)芯片的應用1.在基礎研究中的作用在基礎研究中的作用抗原抗原-抗體相互作用、蛋白質(zhì)抗體相互作用、蛋白質(zhì)-

39、蛋白質(zhì)相互作用、酶蛋白質(zhì)相互作用、酶-底物底物相互作用、配體相互作用、配體-受體相互作用、高通量的蛋白質(zhì)表達篩受體相互作用、高通量的蛋白質(zhì)表達篩選及檢測翻譯后修飾等選及檢測翻譯后修飾等 2.在臨床研究中的作用在臨床研究中的作用u發(fā)現(xiàn)新的疾病標志物作為臨床診斷的指標發(fā)現(xiàn)新的疾病標志物作為臨床診斷的指標u（正常人群和疾病人群蛋白表達譜的比較）（正常人群和疾病人群蛋白表達譜的比較）u對疾病病理分子機制的研究對疾病病理分子機制的研究u篩選藥物靶點，發(fā)現(xiàn)新藥物，研究藥理學篩選藥物靶點，發(fā)現(xiàn)新藥物，研究藥理學三、蛋白質(zhì)芯片的應用三、蛋白質(zhì)芯片的應用v芯片實驗室是將樣品制備、生化反應和檢測分析的全過程集約化

40、，并縮微到一張芯片上自動完成，形成的所謂微型全分析系統(tǒng)（micro total analysis system,-TAS）,或稱“縮微芯片實驗室”（lab-on-a-chip）。芯片實驗室芯片實驗室一、縮微芯片實驗室特點一、縮微芯片實驗室特點分析全過程自動化分析速度快所需樣品少極高的樣品并行處理能力體積小便于攜帶縮微芯片實驗室應用新進展vAffymitrix公司和賓夕法尼亞大學醫(yī)學院和密歇根大學的科學家們利用在微縮芯片上刻出的加熱器、泵、閥門、微量分析器、電化學檢測器以及其他光電子檢測器等，已經(jīng)先后制作出了結(jié)構(gòu)不同的微縮芯片實驗室樣機，向人們展示了制作微縮芯片實驗室的可能性。v在意大利，研究人

41、員利用微機電系統(tǒng)技術(shù)開發(fā)出一種芯片實驗室原型，這種芯片有非常優(yōu)秀的特性，是分析DNA的理想工具v在瑞典，研究人員開發(fā)出一種納米實驗室，能在1小時內(nèi)同時處理480種蛋白質(zhì)樣本，如縮氨酸圖、DNA排序等。v芯片實驗室的另一應用是制成一次性的用品，如檢驗卡等，可以用于醫(yī)院，也可以作為消費者用品，用途很廣泛，市場潛力巨大。芯片序列捕獲技術(shù)v芯片序列捕獲技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補雜交原理發(fā)展的。v即根據(jù)目標基因組序列，設計與之完全互補的探針，將這些探針固定在某些支持物上（用于分離），然后打斷基因組DNA，加上接頭（用于測序）后與探針雜交，洗脫未雜交上的DNA，回收目標DNA片段，可以直接建庫進行DNA測

42、序。芯片序列捕獲技術(shù)v根據(jù)雜交狀態(tài)不同，芯片序列捕獲可以分為固相雜交法和液相雜交法。v固相雜交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上。v固相捕獲系統(tǒng)的試驗流程：v1.選定目標DNA區(qū)域，在修飾了的玻璃片基上原位合成一系列與目標區(qū)域互補的探針，固定在芯片上。v2.基因組DNA片段化處理，構(gòu)建文庫。v3.DNA片段與芯片上的探針雜交。v4.清洗芯片，去除未結(jié)合序列，然后將富集后的DNA片段洗脫下來。v5.PCR擴增捕獲的DNA片段，檢測達到質(zhì)控要求后進行高通量測序。芯片序列捕獲技術(shù)（流程圖）芯片序列捕獲技術(shù)v液相雜交與固相雜交最大的差異在于雜交反應的環(huán)境不同。v液相雜交是在溶液中，目標DNA片段和已帶有生物素標記探針直接雜交，然后通過生物素親和素的反應使目標DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上。v洗去非目標DNA，洗脫后，富集的DNA用于測序。v液相雜交與固相雜交相比有兩大優(yōu)勢：v第一、雜交效率更高；v第二、易于操作，時間短，便于自動化操作。芯片序列捕獲技術(shù)v主要優(yōu)點：v1.高效、定向地捕獲目標區(qū)域v2.具有高均一性、高覆蓋率v3.具有高度靈活性v4.省時、省力、省成本