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第一章 基因工程和蛋白質(zhì)工程,1,第一節(jié) 基因工程的原理,思考：藍(lán)色妖姬如何培育的？,2,“藍(lán)色妖姬”最早來(lái)自荷蘭是一種加工花卉。它是用一種對(duì)人體無(wú)害的染色劑和助染劑調(diào)合成著色劑，等白玫瑰（或白月季）快到花期時(shí)，開(kāi)始用染料澆灌花卉，讓花像吸水一樣，將色劑吸入進(jìn)行染色。 據(jù)花卉專家介紹，目前世界上極少有自然生長(zhǎng)的藍(lán)色玫瑰花，現(xiàn)在市場(chǎng)上出售的“藍(lán)色妖姬”都是人工染色后的產(chǎn)物。比較正規(guī)的“藍(lán)色妖姬”是在花卉的成長(zhǎng)期開(kāi)始染色，顏色能均勻地附著在花瓣上，看上去比較自然；部分商販直接將普通的白玫瑰花采摘后染成藍(lán)色，顏色不自然，也容易掉色。 2008年11月1日閉幕的東京國(guó)際花卉博覽會(huì)上，全球首批真正的藍(lán)玫瑰首次在公眾面前亮相。這種藍(lán)玫瑰是轉(zhuǎn)基因玫瑰，被植入三色紫羅蘭所含一種能刺激藍(lán)色素產(chǎn)生的基因，花瓣因而自然呈現(xiàn)藍(lán)色。,3,基因工程培育藍(lán)色玫瑰的簡(jiǎn)要過(guò)程：,普通玫瑰(無(wú)藍(lán)色),藍(lán)色基因,與運(yùn)載體DNA拼接 導(dǎo)入,,,,普通玫瑰細(xì)胞(含藍(lán)色基因),藍(lán)色玫瑰(有藍(lán)色),上述培育藍(lán)色玫瑰的關(guān)鍵步驟是什么？,三色紫羅蘭,,提取,4,基因工程培育藍(lán)色玫瑰的關(guān)鍵步驟：,關(guān)鍵步驟一：,從三色紫羅蘭中提取藍(lán)色基因,關(guān)鍵步驟二：,藍(lán)色基因與運(yùn)載體DNA連接,關(guān)鍵步驟三：,藍(lán)色基因?qū)胧荏w(普通玫瑰)細(xì)胞,5,解決培育藍(lán)色玫瑰的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？,關(guān)鍵步驟一的工具： 關(guān)鍵步驟二的工具： 關(guān)鍵步驟三的工具：,基因的剪刀——限制酶 基因的針線——DNA連接酶 基因的運(yùn)載工具——運(yùn)載體,6,1.基因工程又叫什么？ 2.基因工程的工具有哪些？ 3.“分子手術(shù)刀”是什么？作用是什么？斷開(kāi)的化學(xué)鍵是什么？ 4.“分子縫合針”是什么？作用是什么？縫合的化學(xué)鍵是什么？鏈接的是什么？ 5.“分子運(yùn)輸車”是什么？作用是什么？需要什么條件？常用的載體有哪些？,我展示 我精彩,7,,8,基因工程,按照人們的意愿，將一種生物的基因在體外_________，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行____________，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。,剪切,重新組合,9,DNA 重組技術(shù)的基本工具,,,“分子手術(shù)刀” ──限制酶,“分子縫合針” ──DNA連接酶,“分子運(yùn)輸車” ──基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,一、基因工程所需的工具,10,識(shí)別雙鏈DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。,主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的一種酶。能將外來(lái)的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。,4000種。,形成兩種末端,(一)、 “分子手術(shù)刀” ——限制性核酸內(nèi)切酶,11,限制性內(nèi)切酶作用過(guò)程,12,DNA連接酶,1.連接酶的作用：將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。,問(wèn)題,用DNA連接酶連接兩個(gè)相同的黏性未端要連接幾個(gè)磷酸二酯鍵？,2.連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。,13,DNA連接酶的作用過(guò)程,14,大腸桿菌(E.coli)的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。,,限制酶,什么叫黏性末端？,15,,限制酶,,,什么叫黏性末端？,16,什么叫黏性末端？,被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。,,,,17,什么叫平末端？,當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開(kāi)時(shí)，切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。,18,(二)、 “分子縫合針” —— DNA連接酶,1、種類： 2、作用部位：,兩類,磷酸二酯鍵,,,DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來(lái)，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。,19,DNA連接酶的作用過(guò)程,返回,20,限制酶切割的是哪個(gè)部位的鍵?,21,22,T,磷酸二酯鍵,,A,23,DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？ 答：不是一回事?；蚬こ讨兴玫倪B接酶有兩種：一種是從大腸桿菌中分離得到的，稱之為E·coli連接酶。另一種是從T4噬菌體中分離得到，稱為T(mén)4連接酶。這兩種連接酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口（nick），而不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？,24,（1）DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的末端上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。 （2）DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNA連接酶不需要模板。 此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。,25,(三)、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”,（1）運(yùn)載體的作用,作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲(chóng)基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。 利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對(duì)外源基因(抗蟲(chóng)基因)進(jìn)行大量復(fù)制。（隨載體的復(fù)制而復(fù)制）,,,（2）作為運(yùn)載體必須具備的條件,能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存。 具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。 具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。 必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體 細(xì)胞有害。 大小應(yīng)適合，便于提取和操作,26,（3）常用的運(yùn)載體,基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”,細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 λ噬菌體的衍生物 動(dòng)植物病毒,注意：真正用作運(yùn)載體的質(zhì)粒都 是人工改造過(guò)的。,,,27,基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”,最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的質(zhì)粒， 其中常含有抗藥基因，如四環(huán)素的 標(biāo)記基因。質(zhì)粒的存在與否對(duì)宿主 細(xì)胞生存沒(méi)有決定性作用，但復(fù)制 只能在宿主細(xì)胞內(nèi)成。,質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú) 立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外， 并且具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀 DNA分子。,,質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體。,28,“分子運(yùn)輸車” —基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體：,29,二、基因工程,概念： 按照人們的意愿，將一種生物的基因在體外剪切，并與特殊的運(yùn)載工具進(jìn)行重新組合，然后轉(zhuǎn)入另一種生物的體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增，并使之表達(dá)產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)的技術(shù)。 意義： 能夠打破生物種屬的界限，在分子水平上定向改造生物的遺傳特性。,30,二、基因工程的操作程序,目的基因的獲得 重組載體的構(gòu)建 重組載體的轉(zhuǎn)化和篩選 目的基因的表達(dá)和鑒定,31,獲取目的基因的方法,,⑴直接分離法 ——鳥(niǎo)槍法,用限制酶將完整的DNA隨機(jī)切成許多片段，然后用某種檢測(cè)方法挑選出所需要的基因。如用“核酸探針?lè)ā?，核酸探針是用放射性同位素?biāo)記的DNA單鏈，具有非常特異的脫氧核苷酸序列，能與DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合。,32,⑵人工合成法——反轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法 反轉(zhuǎn)錄法 ： mRNA→單鏈DNA→雙鏈DNA（目的基因） 化學(xué)合成法： 氨基酸序列→基因序列→合成目的基因,返回,33,運(yùn)載工具——載體(質(zhì)粒),34,用與提取目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒使之出現(xiàn)一個(gè)切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏性末端互補(bǔ)配對(duì)后，在DNA連接酶的作用下連接形成重組DNA分子。,,,,提取質(zhì)粒并用限制酶切割,用連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接,重組載體的構(gòu)建,35,目的基因與質(zhì)粒的連接,返回,36,重組載體的轉(zhuǎn)化和篩選,轉(zhuǎn)化方法： 基因槍法、顯微注射法和花粉管通道法。 受體是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)最常用的是顯微注射法，是植物細(xì)胞時(shí)常用基因槍法。 篩選： 利用載體上的標(biāo)記基因，借助選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,,返回,37,目的基因的表達(dá)和鑒定,基因工程成功的標(biāo)志： 目的基因表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的性狀。 鑒定： 檢測(cè)轉(zhuǎn)化的生物有沒(méi)有顯示出目的基因控制的性狀。,例：用轉(zhuǎn)基因棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng)，如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說(shuō)明目的基因未表達(dá)；如蟲(chóng)吃后中毒死亡，則說(shuō)明目的基因表達(dá)。,返回,38,課本知識(shí)回顧,基因工程又叫做 或 。通俗地說(shuō)，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種 提取出來(lái)，加 以 ，然后放到另一種生物的細(xì)胞里， 改造生物的遺傳性狀。,基因拼接技術(shù),DNA重組技術(shù),基因,修飾改造,定向地,,39,DNA 重組技術(shù)的基本工具,,,“分子手術(shù)刀” ──,“分子縫合針” ──,“分子運(yùn)輸車” ──,限制酶,DNA連接酶,基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,,,,40,限制性核酸內(nèi)切酶,主要是從 的一種酶。 識(shí)別雙鏈DNA 分子的某種 ，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的 斷開(kāi)。 形成兩種末端,原核生物中分離純化出來(lái),特定的核苷酸序列,磷酸二酯鍵,粘性末端,平末端,,,,,,41,二、 “分子縫合針” —— DNA連接酶,1、種類： 2、作用部位：,兩類,,E·coli DNA連接酶,T4 DNA連接酶,磷酸二酯鍵,42,基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體,通常有三種: 在進(jìn)行基因工程操作中,真正被用作載體的質(zhì)粒都是在 基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò) 的,質(zhì)粒,λ噬菌體衍生物,動(dòng)植物病毒,,,,天然質(zhì)粒,人工改造,,,43,1.如圖所示為部分雙鏈DNA片段，下列有關(guān)基因工程中工具酶功能的敘述錯(cuò)誤的是 ( ) A．切斷a處的酶為限制性核酸內(nèi)切酶 B．連接a處的酶為DNA連接酶 C．切斷b處的酶為DNA解旋酶 D．連接b處的酶為RNA聚合酶,課堂反饋,D,44,2．下列有關(guān)基因工程操作的敘述中，正確的是 A．用同種限制性核酸內(nèi)切酶切割載體與目的基 因可獲得相同的黏性末端 B．以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因的堿基序列相同 C．檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作的成功 D．用含抗生素抗性基因的質(zhì)粒作為載體是因?yàn)槠淇剐曰虮阌谂c外源基因連接,A,45,3．下列一般不作為基因工程中的標(biāo)記基因的是 ( ) A．四環(huán)素抗性基因 B．綠色熒光蛋白基因 C．產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因 D．貯藏蛋白的基因,D,46,4．質(zhì)粒作為“分子運(yùn)輸車”的條件是 ( ) ①能夠自我復(fù)制 ②雙鏈環(huán)狀DNA分子 ③有多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn) ④有標(biāo)記基因 ⑤真核細(xì)胞中沒(méi)有 A．①②③④⑤ B．①②③④ C．①③④ D．②③⑤,B,47,5．下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)敘述，不正確的是 ( ) A．需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B．必須在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 C．抗生素抗性基因可作為標(biāo)記基因 D．啟動(dòng)子位于目的基因的首端,B,48,6．下面是獲得抗蟲(chóng)棉的技術(shù)流程示意圖。有關(guān) 敘述錯(cuò)誤的是 ( ),A．重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程中需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶 B．圖中愈傷組織分化產(chǎn)生的再生植株基因型一般都相同 C．卡那霉素抗性基因中含有相關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn) D．轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉有性生殖的后代不能穩(wěn)定保持抗蟲(chóng)性狀,D,49,7．哪項(xiàng)不是基因表達(dá)載體的組成部分( ) A．啟動(dòng)子 B．終止密碼 C．標(biāo)記基因 D．目的基因 8、下列哪項(xiàng)不是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法( ) A．基因槍法 B．顯微注射法 C．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 D．花粉管通道法 9．基因工程中常用的受體細(xì)胞不包括( ) A．人體細(xì)胞 B．動(dòng)物細(xì)胞 C．植物細(xì)胞 D．微生物細(xì)胞,D,B,A,50,10．基因工程的正確操作步驟是( ) ①構(gòu)建基因表達(dá)載體 ②將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 ③檢測(cè)目的基因的表達(dá)是否符合特定性狀要求 ④取目的基因 A．③②④① B．②④①③ C．④①②③ D．③④①②,C,51,11．人體受病毒刺激后，可以產(chǎn)生干擾素，干擾素分 為α．β．γ三類，1980年，生物學(xué)家成功破譯了α干擾 素的全部遺傳信息，并運(yùn)用插入質(zhì)粒的方法，用大腸 桿菌生產(chǎn)得到干擾素可以用于治療肝炎和腫瘤，回答 下列問(wèn)題： (1)上述材料中涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有 (2)在利用大腸桿菌生產(chǎn)干擾過(guò)程中，目的基因是 __________________，所用載體是 。表達(dá)載體 的結(jié)構(gòu)組成包括 、 、 、 。 (3)目的基因在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，必須經(jīng)過(guò)__- 和 過(guò)程。,基因工程,合成α干擾素的基因,質(zhì)粒,目的基因,啟動(dòng)子,終止子,標(biāo)記基因,轉(zhuǎn)錄,翻譯,52,,12、下圖為DNA分子的切割和連接過(guò)程。,(1)EcoRI是一種 酶，其識(shí)別序列是 ，切割位點(diǎn)是 與 之間的 鍵。切割結(jié)果產(chǎn)生的DNA片段末端形式為 (2)不同來(lái)源DNA片段結(jié)合，在這里需要的酶應(yīng)是 連接酶，此酶的作用是在 與 之間形成 鍵，而起“縫合”作用的。還有一種連接平 末端的連接 酶是 。,限制性核酸內(nèi)切,GAATTC,鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸,腺嘌呤脫氧核苷酸,磷酸二酯,黏性末端,E·coliDNA,鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸,腺嘌呤脫氧核苷酸,磷酸二酯,T4DNA連接酶,53,謝謝！再見(jiàn),54,