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實(shí)驗(yàn)四瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的方法和技術(shù)，檢測(cè)上次實(shí)驗(yàn)課提取的質(zhì)粒DNA,二、實(shí)驗(yàn)原理,帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱(chēng)為電泳。凝膠電泳由于其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為蛋白質(zhì)、核酸研究的首選標(biāo)準(zhǔn)方法泳動(dòng)率是帶電顆粒在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，單位時(shí)間內(nèi)在介質(zhì)中的遷移距離。泳動(dòng)率與樣品分子所帶的電荷密度、電場(chǎng)中的電壓及電流成正比，與樣品的分子大小、介質(zhì)黏度及電阻成反比。不同大小的帶電分子具有不同的泳動(dòng)率，在不同的介質(zhì)條件下又具有不同的分辨效率影響泳動(dòng)率的因素包括樣品的物理性狀、支持物介質(zhì)、電場(chǎng)強(qiáng)度和緩沖液離子強(qiáng)度DNA的凝膠電泳常使用兩種支持介質(zhì)：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠,關(guān)于電泳,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在堿性緩沖液中DNA分子帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型瓊脂糖凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子可以分離長(zhǎng)度為100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三種緩沖體系,質(zhì)粒DNA分子有三種構(gòu)型:CCDNA(共價(jià)閉合環(huán)狀DNA:兩條核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，DNA呈現(xiàn)超螺旋)、OCDNA(開(kāi)環(huán)DNA：質(zhì)粒的一條鏈斷裂)LDNA(線(xiàn)形DNA：質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂)，\這三種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的泳動(dòng)率不同，因此電泳后呈三條帶，CCDNA泳動(dòng)最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA,,電泳方向,EB：即溴化乙錠，它能夠插入DNA分子中的堿基對(duì)之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)?？梢詸z測(cè)10ng的DNA注意：EB是一種誘變劑，操作時(shí)一定要注意安全，必須戴塑料或乳膠手套,GoldView?:是一種可代替EB的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA時(shí)，GoldView?與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而且也可用于染RNA。,DNA的染料,線(xiàn)性DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度的關(guān)系,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉丙烯酰胺在催化劑過(guò)硫酸銨和加速劑TEMED的作用下聚合而成可以分離小片段（5～500bp）DNA分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的應(yīng)用：蛋白質(zhì)分子的分離鑒定蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定核酸的分析核酸序列測(cè)定,在pH值為8.0-8.3時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。,實(shí)驗(yàn)原理,三、儀器、材料與試劑,微波爐瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)紫外線(xiàn)透射儀質(zhì)粒DNADNAmarker50TAE6凝膠加樣緩沖液瓊脂糖1％溴化乙錠溶液,,,四、實(shí)驗(yàn)步驟,1.裝好制膠裝置[用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好(一定封嚴(yán)，不能留縫隙),]使用水平儀，將膠板調(diào)至水平，插入適當(dāng)梳子2.將1g瓊脂糖加入100ml1TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解（冷卻到60℃，加入5μl的1％EB，并搖勻），則為1％瓊脂糖凝膠液3.將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固4.充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中(注意：DNA樣品孔應(yīng)朝向負(fù)電極一端)，加1TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠0.5cm,5.用移液器吸取質(zhì)粒樣品5μl于封口膜上，再加入1μl的6加樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔(記錄電樣的順序和電樣量)6.打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3～5V/cm，可見(jiàn)溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)(注意DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng))7.當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳8.將凝膠置于紫外線(xiàn)透射儀上，打開(kāi)紫外燈，DNA存在處顯出桔紅色熒光條帶（注意：紫外線(xiàn)對(duì)眼睛有傷害作用，應(yīng)戴上防護(hù)眼睛）,每班4組，約30人每組7人：1套瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（電泳槽、電泳儀、制膠板、有機(jī)玻璃槽、8孔梳子），20μL或10μL移液槍1支，冰盒1個(gè)，50mL錐形瓶1個(gè)（貼上EB標(biāo)簽）。每班配2臺(tái)電爐，線(xiàn)手套2副。,實(shí)驗(yàn)分組,五、思考題,EB的中文名稱(chēng)是什么？使用EB時(shí)應(yīng)注意些什么？怎么制備一塊20mL體積1％瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠溶液終濃度0.5μg/mL）？什么是LoadingBuffer？LoadingBuffer中含有哪些成分？各組分的作用是什么？,1倒膠時(shí)把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會(huì)使制板變形2膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點(diǎn)樣孔3點(diǎn)樣時(shí)槍頭下伸，點(diǎn)樣孔內(nèi)不能有氣泡，緩沖液不要太多4EB有毒，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔5紫外線(xiàn)照射不要太久,注意,凝膠電泳槽,