《基因工程的酶學基礎ppt課件》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《基因工程的酶學基礎ppt課件（94頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

第六章 基因工程的酶學基礎,1,,限制性內(nèi)切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 DNA修飾酶 外切核酸酶 單鏈內(nèi)切核酸酶 RNA酶,2,,核酸酶：水解相鄰的兩個核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，從而使核酸分子斷鏈。 根據(jù)水解的不同方式，分為： 外切核酸酶（exonuclease） 內(nèi)切核酸酶（endonuclease） 根據(jù)作用的核酸底物不同，分為： RNA酶 DNA酶 底物非專一性核酸酶,3,6.1 限制性內(nèi)切酶,定義：限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。,4,1. 細菌限制修飾系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) 20世紀60年代在研究噬菌體的寄主范圍時發(fā)現(xiàn)的。 從天然宿主大腸桿菌K中分離得到的λk噬菌體，當其感染B菌株時，感染率僅為10-4，分離得到幸存的子代λk病毒，再用其感染B菌株，感染率為100%；若再用其感染K菌株，感染率又降為10-4。此現(xiàn)象稱為宿主限制現(xiàn)象。,一、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),5,,各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶，以此來限制外源DNA在自身細胞內(nèi)的存在。 幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都和能識別甲基化相同DNA位點的甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用，構(gòu)成限制-修飾系統(tǒng)。 宿主細胞的DNA被甲基轉(zhuǎn)移酶修飾而被保護起來，不被限制性內(nèi)切酶識別，從而使自身DNA免受降解。,6,,2. 限制酶HindIII的發(fā)現(xiàn) Smith 等于1970年首次從流感嗜血桿菌（H. influenzae）中發(fā)現(xiàn)并分離到HindIII限制酶。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 Nathans（1971年）用HindIII繪制SV40的限制酶譜。,7,二、限制性內(nèi)切核酸酶的類型,已經(jīng)鑒定出的限制性內(nèi)切核酸酶可分為4種不同類型： Ⅰ型酶：能識別專一的核苷酸序列，并在識別位點附近的核苷酸切割DNA雙鏈，但切割序列是隨即的，無專一性。在基因工程中應用不大。 Ⅱ型酶：能識別專一的核苷酸序列，并在識別序列的固定位置切割雙鏈DNA分子，是基因工程中最常用的工具酶。,8,,Ⅲ型酶：有專一的識別序列，但不是對稱的回文序列，在識別序列旁邊的位置上切割雙鏈。切割后產(chǎn)生的DNA片段具有各種單鏈末端。 Ⅳ型酶：新鑒定出的一種酶，目前無應用。,9,命名原則： 屬——種——株——分離序號 例如：EcoRⅠ 屬：Escherichia 種：coli 株：R 分離序號：Ⅰ,三、限制性內(nèi)切酶的命名,10,第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名,HindⅢ,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,11,（一）識別序列的特異性 大多數(shù)Ⅱ型限制內(nèi)切酶的識別序列長度為4~6bp，具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)的回文序列（palindromic sequence）。,四、Ⅱ型限制內(nèi)切酶的基本特性,BamHⅠ：,如果識別序列由5對堿基組成，其對稱軸為中間的一對堿基，如MaeⅢ的識別序列為：,--GTNAC-- --CANTC--,其中，N為任意堿基。,12,回文詩,悠悠綠水傍林偎， 日落觀山四望回。 幽林古寺孤明月， 冷井寒泉碧映臺。 鷗飛滿浦漁舟泛， 鶴伴閑亭仙客來。 游徑踏花煙上走， 流溪遠棹一篷開。,開篷一棹遠溪流， 走上煙花踏徑游。 來客仙亭閑伴鶴， 泛舟漁浦滿飛鷗。 臺映碧泉寒井冷， 月明孤寺古林幽。 回望四山觀落日， 偎林傍水綠悠悠。,13,14,,有些限制性內(nèi)切酶的識別序列中，某一位或二位堿基并非嚴格專一，但不影響其作用位點，只是增加酶的識別和作用頻率。如HindⅡ識別序列為--GTYRAC--，其中Y表示C或T，R表示A或G。 有的酶識別6個以上的核苷酸序列，稱為稀有限制性內(nèi)切酶，如NotⅠ，識別序列為（GCGGCCGC）,15,,（二）切割位點的特異性 1.DNA分子酶切片段的末端 切割：水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5’端為磷酸基，3’ 端為羥基。,16,,,酶切后產(chǎn)生的片段末端有黏性末端和平末端等形式。 黏性末端：DNA分子在限制性內(nèi)切酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸形成的末端結(jié)構(gòu)。它們能夠通過互補堿基間的配對而重新連接起來。,17,,（1）在對稱軸兩側(cè)相對位點分別切割一條鏈。靠近5’ 端切割產(chǎn)生 5' 端突出的粘性末端，如EcoRI ：,18,,（2）靠近 3' 端切割產(chǎn)生3' 端突出的粘性末端。如Pst I：,19,,（3）在對稱軸中心同時切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端（blunt end），如SmaI：,20,,2.同切點酶（或同裂酶，isoschizomer） 同裂酶：是一類來源于不同的微生物、能識別相同靶序列的限制性內(nèi)切核酸酶。,例：SmaⅠ CCC ↓ GGG XmaⅠ C ↓ CCGGG,,識別序列相同，切割位點不同,識別序列相同，切割位點也相同,例：HpaⅡ與MspⅠ識別順序都是C↓CGG,21,,3.同尾酶（isocaudamer） 定義：來源不同，識別的靶序列也各不相同，但切割后能產(chǎn)生相同的黏性末端。,,,,,Bam HⅠ,Bg lⅡ,,+,+,,22,1.酶的純度 2.DNA樣品的純度 高純度DNA是必需的 樣品如果殘留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS等物質(zhì)，或蛋白質(zhì)、多糖等都可能影響內(nèi)切酶的反應活性。 如果DNA純度不高時，可采取以下措施： 增加酶的用量、擴大反應體系體積、延長反應時間、添加陽離子亞精胺等。,五、影響限制內(nèi)切酶活性的因素,23,,3.DNA的甲基化程度 識別序列中特定核苷酸的甲基化會影響酶的活性。 在基因克隆中是使用失去了甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。 可根據(jù)各種同裂酶所具有的不同的甲基化敏感性研究真核基因組DNA的甲基化作用模式。例如，MspI可以切割甲基化的CCGG，而HpaII不能切割甲基化的序列。,24,,4.酶切反應的溫度 大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度為37℃。,表2-3 部分限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度,25,,5.DNA分子的構(gòu)型 某些限制酶，切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍。 還有些限制性核酸內(nèi)切酶切割它們自己的處于不同部位的限制位點，其效率也有明顯的差別。 大多數(shù)內(nèi)切酶對只含識別序列的寡聚核苷酸不具有催化活性。,26,,2hr 20hr HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10% 75% EcoRI GGAATTCC 90 90,27,,6.反應緩沖液 pH范圍： 7.0~7.6 緩沖液組份: Tris(三羥甲基氨基甲烷）、NaCl、 MgCl2、二硫蘇糖醇（DTT）或β-巰基乙醇 有些酶需要BSA，以防止酶在低濃度蛋白質(zhì)溶液中變性。,28,,7.酶的星號活性（star activity） 當條件改變時，許多酶的識別位點會改變，導致識別與切割序列的非特異性，稱為星號活性。 EcoRⅠ正常情況下，其靶子序列為GAATTC，但若緩沖液pH8、鹽離子濃度低于50mm和甘油超過5%（V/V），可在NAATTN處切割，以EcoRI*表示,29,,8.限制性內(nèi)切酶反應的終止 消化DNA樣品后，在進一步處理DNA樣品前往往需要鈍化內(nèi)切酶的活性。 鈍化大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的方法是65℃溫浴5分鐘。 但有些酶，如BamH I和HaeⅡ具備對熱穩(wěn)定性，則需加入終止反應液（加入0.5mol／L的EDTA使之在溶液中的終濃度達到10mmol/L 以螯合Mg2+）。,30,1.DNA分子的雙酶切消化 可以先后分別在不同的反應體系中進行： 先用需要低鹽離子濃度的酶切割，再調(diào)節(jié)鹽離子濃度，加入另一種酶切割。 先用最適反應溫度較低的酶切割，升溫后再加入第二種酶。,六、限制內(nèi)切酶對DNA的消化,31,,,32,2.DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化 完全酶切消化：內(nèi)切酶對DNA序列中全部的識別序列進行切割。 部位酶切：內(nèi)切酶對DNA序列中所有的識別序列進行不完全切割。,33,,34,酶切反應注意事項 價格昂貴 決不能用水稀釋,以免變性失活。 預先加入除酶以外的所有其他試劑。 取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復凍融。 使用無菌的新吸頭。 少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過總體積的10％,否則酶液中的甘油會抑制酶活性。,35,6.2 DNA連接酶,一、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn) DNA連接酶（DNA ligase）是能催化雙鏈DNA片段靠在一起的3’羥基末端與5’端磷酸基因末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接在一起?！胺肿羽ず蟿?36,,依據(jù)反應時所需能量輔因子的不同分為兩類： 依賴ATP的DNA連接酶 依賴NAD+的DNA連接酶 依據(jù)其來源可分為三類： T4噬菌體DNA連接酶、 大腸桿菌DNA連接酶 熱穩(wěn)定DNA連接酶。,37,,二、DNA連接酶的特點 連接反應需要一條DNA鏈游離的3’-OH，另一條鏈5’末端具有磷酸基團。 連接反應中需要ATP或NAD+和Mg2+為輔因子和激活因子。 DNA連接酶并不能夠連接兩條單鏈的DNA分子！ DNA連接酶只能封閉雙螺旋DNA骨架上的缺口（nick），不能封閉失去核苷酸所形成的裂口（gap）,38,,,39,,,40,,41,三、DNA連接酶的作用機理,42,四、影響連接反應的因素,1.反應溫度： 黏性末端：4~15℃比較合適 平末端：10~20℃ 2.連接酶濃度： 平末端連接所需酶量較多 黏性末端連接所需酶量較少。,43,,3.ATP濃度 一般情況下ATP最適的終濃度為0.5mmol/L。 當ATP濃度上升至5.0mmol/L時，將影響酶對平末端的連接； 當ATP濃度上升至7.5mmol/L時，對黏性末端及平末端的連接均有抑制作用。,44,,4.DNA片段末端,45,6.3 DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶（DNA polymerase）：在引物和模板的存在下，把dNTP連續(xù)加到DNA分子3-OH末端，催化核苷酸的聚合。 分為兩類： 依賴于DNA的DNA聚合酶 依賴于RNA的DNA聚合酶-反轉(zhuǎn)錄酶,46,一、DNA聚合酶,Ⅰ. E.coli DNA聚合酶I（polI）-Kornberg酶,1）具兩種外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦稱為Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應條件的影響 3） 外切酶活性：具3’→5’和5’→3’外切酶活性,47,①5’-3’聚合酶活性,條件 : Mg2+ dNTP 3’-OH,48,沿3’ 5方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸。 在體內(nèi)DNA復制時起校對作用，保證了DNA復制的真實性，從而降低突變率。,,②3’- 5’外切酶活性,49,可降解DNA：RNA雜合體中的RNA分子 帶切除的核酸分子必須具有5’端游離的磷酸基團； 核酸分子被切除前位于已配對的DNA雙螺旋區(qū)段上； 被切除的可以是脫氧核苷酸，也可以是非脫氧核苷酸,③5’ - 3’外切酶活性,50,,DNA聚合酶Ⅰ的重要用途是用于缺口平移法制備核酸的雜交探針。,51,,,52,,Ⅱ. Klenow片段 Klenow片段具有DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性和3’-5’外切酶活性 ① 補平 3’ 凹端 DNA 。使用單純的 DNA 合成活性。注意要加足夠的 dNTP ；如果使用帶標記的 dNTP ，則可對 DNA 進行末端標記。,53,,② 抹平 DNA 3’ 凸端。在 3’—5’ 外切活性作用下，可切除突出的 3’ 凸端。注意必須加足量 dNTP ，否則外切活性不會停止。,54,,,③用于Sanger雙脫氧末端終止法進行DNA序列分析 ④ 在 cDNA 克隆中合成第二鏈 ⑤ 在單鏈模板上延伸寡核苷酸,55,,Ⅲ. T4 DNA聚合酶,5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 在無dNTP時，可以從任何3’-OH端外切 在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止 在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位,56,,T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端標記,,T4-DNA pol,,T4-DNA pol,Mg2+ 5‘ ppp dNTP a-32P-dATP,57,,,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端,58,,Ⅳ.T7噬菌體DNA聚合酶 5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 已知DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強 改造后成為雙脫氧終止法對長片段DNA的測序酶,59,,T7噬菌體DNA聚合酶的基本用途： 用于拷貝長段模板的引物延伸反應 通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記,60,,Ⅴ.耐熱DNA聚合酶（Taq酶） Taq酶的特點： 熱穩(wěn)定性 離子依賴性 5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性。 在聚合鏈末端不依賴模板多聚合出一個腺苷（A）,,61,是一種依賴RNA的DNA聚合酶。 商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種 來自禽類成髓細胞瘤病毒(AMV)。 來自能表達Moloney鼠白血病毒(M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶的基因已克隆到E.coli中表達,二、反轉(zhuǎn)錄酶,62,,(1) 5’-3’ 聚合酶活性, 能以RNA或DNA模板合成DNA分子； (2) RNA酶H活性，對RNA:DNA雜交體中的RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用NaOH降解RNA模板的步驟。 主要用途：將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA以制備基因片段。,63,,3’AAAAAAAAAAAA,,5’mRNA,5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,,反轉(zhuǎn)錄酶,Mg2+ dNTP,64,,反轉(zhuǎn)錄酶,,3’ RNA,,5’ DNA,,3’ RNA,,5’ DNA,3’,5’,,反轉(zhuǎn)錄酶,,5’ DNA,3’,反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈,5’,3’,65,,66,6.4 DNA 修飾酶,（一）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT） 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶 來源：小牛胸腺 特點： 末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。 在沒有模板鏈的情況下，可以非特異性的將核苷酸連接到dsDNA或ssDNA的在3’-OH。 可以同聚物加尾,67,,如果以dATP或dGTP為同聚物加尾反應的底物則以Mg2+為首選； 如果以dTTP或dCTP為同聚物加尾，則必需有Co2+存在。,,TdT,Mg2+ dATP,,5’ p,,3’ AAAAAA,AAAAAA 3’,p 5’,68,,主要用途： 用于克隆DNA片段：平末端DNA片段的末端加尾連接法 用于DNA片段3’末端標記,69,,平末端DNA片段的末端加尾連接法,,,,,,,,,,3’,,,,,,,,,,3’,5’,5’,,,,,,,,,,3’,,,,,,,,,,3’,5’,5’,,,DNA聚合酶和 T4DNA連接酶,70,（二）T4多核苷酸激酶 基本特性：催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到在DNA或RNA的5’-OH末端，使5’末端重新磷酸化。 用于標記DNA或RNA的5’末端,71,,,T4噬菌體多核苷酸激酶 ＊ATP,單鏈或雙鏈DNA或RNA,A、正向反應：足夠的酶和ATP存在，平末端、5’凹陷末端和雙鏈DNA的切（烈）口都能磷酸化,72,,單鏈或雙鏈DNA或RNA,,T4噬菌體多核苷酸激酶 ＊ATP 過量ADP,B、交換反應：過量ADP存在時，DNA分子的5’磷酸轉(zhuǎn)移給ADP，然后從ATP那里獲得γ-32P基團,73,,能催化核酸分子脫掉5’的磷酸基團，從而使DNA（或RNA）片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。 來源： 從大腸桿菌中分離的細菌堿性磷酸酶(Bacterial Alkaline Phosphatase)簡稱BAP ，具耐熱性； 從小牛腸中分離的叫小牛腸堿性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)，簡稱CIP，70℃可滅活，使用更廣泛。,（三）堿性磷酸酶,74,,其主要用途有： ⑴在用32P標記DNA 5’端之前，去除5’端的磷； ⑵在DNA重組技術(shù)中，去除DNA片段的5’磷酸，防止載體的自身環(huán)化，提高重組子比例。,75,,76,外切核酸酶：從多核苷酸鏈的末端開始逐個降解核苷酸的酶。 分類： 作用于單鏈的外切核酸酶 作用于雙鏈的外切核酸酶,6.5 外切核酸酶,77,,78,,一、大腸桿菌外切核酸酶VII（exoVII） 反應不受二價陽離子影響 ，不需要Mg2+ 從單鏈DNA的兩端同時消化DNA,79,,二、大腸桿菌外切核酸酶Ⅲ（exo Ⅲ） 催化雙鏈DNA從3-OH末端開始水解 可以作用平末端、3’凹陷末端或有缺口的DNA 不能水解單鏈DNA和3’末端突出的雙鏈DNA,80,,應用： 與Klenow配合使用，制備放射性探針或3’標記,81,A 產(chǎn)生平末端或 or 3’ 凹端 B 產(chǎn)生 3’突出端,A digestion B digestion,,A,,exoIII,,B,B,B,B,B,B,S1 nuclease Klenow fragment,重新連接,Transformation E.coli,Target sequence,Universal primer,A B,exoIII可以構(gòu)建單向缺失,,Activity!,82,6.6 單鏈內(nèi)切核酸酶,一、S1核酸酶 S1核酸酶來源于米曲霉，它可以降解單鏈DNA和RNA，產(chǎn)生5’磷酸化單核苷酸或寡聚核苷酸。 Zn2+必需 最適pH范圍為4.0 - 4.3 需要NaCl 0.1 – 0.4mol/L 降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍,83,,活性：可以降解單鏈DNA或RNA或雙鏈的單鏈區(qū)。,,ssDNA或RNA,,,5’,3’,SI酶、 Zn2+、pH4.5,5’dNMPs或5’rNMPs,,,,,SI酶、 Zn2+、pH4.5,,,,,,+,帶缺口的DNA或RNA,,,,SI酶、 Zn2+、pH4.5,,,黏性末端,平末端,84,,S1核酸酶的重要用途： 去除DNA片段的單鏈突端，使之成為平端 去除cDNA合成時形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu) 成熟mRNA與基因組DNA雜交后，結(jié)合此酶水解，可定位內(nèi)含子 S1核酸作圖法可測定雜交核酸分子的雜交程度,85,,二、Bal31核酸酶 來源：從埃氏互生單胞菌BAL31中分離 活性： 對單鏈DNA具有內(nèi)切酶活性 對雙鏈DNA具有3’ 5’和5’ 3’的外切活性 對兩端的水解速度不一定相等 產(chǎn)生5’-單磷酸核苷和縮短的ds-DNA 具有核糖核酸酶的作用，催化核糖體和tRNA的降解,,,86,,,,Ca2+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,ssDNA or RNA,5’dNMPs 或 5’NMPs,Ca2+,Ca2+,Bal 31核酸酶的活性,加入螯合劑EGTA（乙二醇雙β-氨基乙醚四乙酸）終止反應。,87,,三、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ） 有Mg2+存在時，能在雙鏈DNA上隨機獨立地產(chǎn)生切口； 在Mn2+存在時，能在雙鏈DNA的大致同一位置切割產(chǎn)生平末端DNA片段,88,應用： 與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ聯(lián)合參與切口平移法標記DNA分子 在Mn2+存在下，隨機裂解雙鏈DNA分子，構(gòu)建大片段插入的基因組文庫 用于DNase Ⅰ足跡法分析DNA結(jié)合蛋白在DNA上的精確結(jié)合部位 使用無RNase的DNase Ⅰ去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的模板DNA,89,一、核糖核酸酶A（RNase A） 來源：牛胰臟 活性：切割胞嘧啶（或尿嘧啶）與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵，反應終產(chǎn)物是嘧啶3’磷酸和末端帶嘧啶3’磷酸的寡核苷酸。 反應條件極寬，極難失活，具有熱穩(wěn)定性,6.7 RNA酶,90,,低鹽溶液下（0-100mmol/L NaCl），RNase A切割單鏈或雙鏈RNA，也能切割DNA：RNA雜合體中的RNA； 高鹽溶液下（300mmol/L NaCl）水解單鏈RNA 去除RNaseA要用蛋白酶K處理，再用酚/氯仿反復抽提 降解DNA樣品中的RNA，需使用無DNA酶的RNase,91,,應用： 去除DNA：RNA或RNA：RNA雜合體中未雜合的RNA區(qū)域； 降解DNA中RNAase分子 確定DNA（或RNAase）中單堿基突變的位置。,92,,二、核糖核酸酶H（RNase H） 特異性降解DNA：RNA雜合鏈中的RNA 不能降解單鏈或雙鏈的DNA（或RNA） 應用：與E.coli DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶一起參與cDNA的第二條鏈的合成,93,,,水解產(chǎn)生含5’磷酸基的產(chǎn)物,水解產(chǎn)生含3’磷酸基的產(chǎn)物,94,