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課時作業(yè)17 基因工程(含PCR技術(shù))與細(xì)胞工程 1．(2016廣州市考前訓(xùn)練)如圖為人類對克隆羊技術(shù)的拓展及應(yīng)用的設(shè)想。請據(jù)圖回答問題： (1)圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有_____________________________ ________________________________________________________________________等(至少寫三個)。 (2)若利用圖中過程最終獲得嬰兒說明________具有全能性，兩個嬰兒性狀與________基本相同。 (3)使用培養(yǎng)基進(jìn)行重組細(xì)胞培養(yǎng)時，通常要加入________等天然成分，為防止培養(yǎng)過程中雜菌污染，通常要在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定量的________。培養(yǎng)過程中通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，將其置于含________的混合氣體的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 (4)圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過程中，必須用________處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個細(xì)胞。 (5)胚胎干細(xì)胞在形態(tài)上具有的特點是_____________________。 答案　(1)核移植、胚胎移植、動物細(xì)胞培養(yǎng) (2)動物細(xì)胞核　原型男人 (3)血清(或血漿)　抗生素　95%空氣加5%CO2 (4)胰蛋白酶(或膠原蛋白酶) (5)體積小，細(xì)胞核大，核仁明顯 解析　(1)圖中所涉及的現(xiàn)代生物技術(shù)有核移植、胚胎移植、動物細(xì)胞培養(yǎng)等。(2)克隆嬰兒說明動物細(xì)胞核具有全能性，兩個嬰兒的細(xì)胞核來自于原型男人，因此性狀與原型男人基本相同。(3)重組細(xì)胞培養(yǎng)時通常要加入血清(或血漿)等天然成分；在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加一定量的抗生素，防止培養(yǎng)過程中雜菌污染。培養(yǎng)過程中通常采用培養(yǎng)皿或松蓋培養(yǎng)瓶，將其置于含95%空氣加5%CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，其中95%空氣是細(xì)胞代謝必需的，5%的CO2維持培養(yǎng)液的pH值。(4)圖中從“內(nèi)細(xì)胞團(tuán)到胚胎干細(xì)胞”的培養(yǎng)過程中，必須用胰蛋白酶(或膠原蛋白酶)處理內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，使之分散成單個細(xì)胞。(5)胚胎干細(xì)胞在形態(tài)上具有的特點是體積小，細(xì)胞核大，核仁明顯。 2．(2016淄博市一模)利用生物工程技術(shù)，可從轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁中分離獲得人凝血因子Ⅳ，用于血友病的治療。請回答下列問題： (1)根據(jù)凝血因子Ⅳ基因上游和下游的堿基序列，可用________技術(shù)獲取并擴(kuò)增基因。構(gòu)建該基因表達(dá)載體時，所用到的工具酶是________，該基因表達(dá)載體中，凝血因子Ⅳ基因的上游和下游分別是________________________________________________________________________。 (2)將目的基因表達(dá)載體導(dǎo)入奶山羊受精卵的常用方法是________。受體細(xì)胞選用受精卵的優(yōu)點是細(xì)胞大易操作、營養(yǎng)物質(zhì)含量高和________。 (3)在體外胚胎培養(yǎng)時，應(yīng)選用囊胚的________進(jìn)行DNA分析，用于選擇雌性胚胎。此期的胚胎也適于胚胎分割移植，此技術(shù)的優(yōu)點是________________________________________________________________________。 (4)人凝血因子Ⅳ是一種胞外酶，該蛋白的加工是在________等細(xì)胞器上進(jìn)行的。人凝血因子Ⅳ只在乳腺細(xì)胞合成的原因是________________________________________________________________________。 答案　(1)PCR　限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶　啟動子和終止子 (2)顯微注射法　細(xì)胞全能性高 (3)滋養(yǎng)層細(xì)胞　充分發(fā)揮雌性動物的生殖潛力(快速大量繁殖) (4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體　　基因的選擇性表達(dá) 解析　(1)可利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因；構(gòu)建該基因表達(dá)載體時，通常用同種限制酶切割含有目的基因的DNA和運(yùn)載體，再用DNA連接酶將目的基因與切開的運(yùn)載體連接起來，因此所用到的工具酶是限制酶和DNA連接酶。凝血因子Ⅳ基因為目的基因，在基因表達(dá)載體中，啟動子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端。(2)顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用的方法；受精卵的優(yōu)點是：細(xì)胞全能性最高，細(xì)胞大易操作、營養(yǎng)物質(zhì)含量高。(3)在體外胚胎培養(yǎng)時，可取囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞做DNA分析性別鑒定。胚胎分割有利于提高胚胎的利用率，胚胎移植可以充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力。(4)分泌蛋白是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器上加工的；基因的選擇性表達(dá)使人凝血因子Ⅳ只在乳腺細(xì)胞合成。 3．(2016衡水中學(xué)二模)2015年，屠呦呦因發(fā)現(xiàn)青蒿素治療瘧疾的新療法獲獎。工業(yè)上青蒿素一般從青蒿植株中提取，產(chǎn)量低，價格高?；蚬こ碳凹?xì)胞工程等為培育出高青蒿素含量的青蒿提供了思路?？茖W(xué)家先通過紫外線處理大量青蒿幼苗后，偶然發(fā)現(xiàn)一株高產(chǎn)植株。通過基因測序發(fā)現(xiàn)該高產(chǎn)植株控制青蒿素合成相關(guān)的一種關(guān)鍵酶的基因發(fā)生了突變。 (1)提取了高產(chǎn)植株的全部DNA后，要想快速大量獲得該突變基因可以采用PCR技術(shù)，該技術(shù)的原理是__________________________。 (2)如果用青蒿某個時期mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段，用該雙鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行了30個循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為________個DNA分子，該雙鏈與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做青蒿的________________，獲得的cDNA與青蒿細(xì)胞中該基因堿基序列________(填“相同”或“不同”)。 (3)將獲得的突變基因?qū)肫胀ㄇ噍镏?，先?gòu)建基因表達(dá)載體，圖1、2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請回答： 用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是____________________，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒在其目的基因前要加上特殊的啟動子，啟動子是________識別結(jié)合位點。 (4)檢測目的基因是否表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)，應(yīng)采取________技術(shù)。目的基因?qū)虢M織細(xì)胞后，通過________技術(shù)培育出青蒿幼苗。 答案　(1)DNA雙鏈復(fù)制 (2)230　cDNA文庫(或部分基因文庫)　不同 (3)SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因　RNA聚合酶 (4)抗原抗體雜交　植物組織培養(yǎng) 解析　(1)PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制，可在體外實現(xiàn)DNA的大量擴(kuò)增。(2)如果用青蒿某個時期mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段，用該雙鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行了30個循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為230個DNA分子，該雙鏈與載體連接后儲存在一個受體菌群中，這個受體菌群就叫做青蒿的部分基因文庫(cDNA文庫)，獲得的cDNA與青蒿細(xì)胞中該基因堿基序列不同。(3)用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒在其目的基因前要加上特殊的啟動子，啟動子是RNA聚合酶識別結(jié)合位點。(4)檢測目的基因是否表達(dá)出相應(yīng)蛋白質(zhì)，應(yīng)采取抗原抗體雜交技術(shù)。目的基因?qū)虢M織細(xì)胞后，通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出青蒿幼苗。 4．(2016唐山市二模)[生物——選修3：現(xiàn)代生物科技專題] 科研人員為了判定人體中某兩個基因是否在同一條染色體上，做了人鼠細(xì)胞融合實驗。人鼠融合細(xì)胞在細(xì)胞增殖過程中會隨機(jī)地丟失人的染色體(人染色體數(shù)46條，鼠染色體數(shù)60條)，選出保留要研究的人染色體的融合細(xì)胞，測定其是否出現(xiàn)待測基因的表現(xiàn)型(已知這些性狀都是小鼠細(xì)胞所沒有的)，從而判斷待測基因所屬的染色體。請回答： (1)人鼠細(xì)胞融合常用的生物融合誘導(dǎo)劑是____________________，融合過程體現(xiàn)了細(xì)胞膜的________性。 (2)如果僅考慮兩兩融合的細(xì)胞，融合體系中除含有人鼠融合細(xì)胞外，可能還有________、________。 (3)細(xì)胞融合后的增殖方式是__________________，一個人鼠融合細(xì)胞，在不分裂時染色體數(shù)目最多是____________條。 (4)有五個人鼠融合細(xì)胞株A、B、C、D、E，分別測得甲、乙、丙、丁四種表現(xiàn)型，結(jié)果如下： 保留的人染色體 測定的性狀 1 2 3 甲 乙 丙 丁 細(xì) 胞 株 A ＋ － － － ＋ － ＋ B － ＋ － ＋ － ＋ ＋ C － － ＋ － － － － D － － － － － － ＋ E ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 注：＋表示保留的染色體或具有某一性狀，－表示沒有。 實驗表明：控制________兩個性狀的基因都在人的2號染色體上。 (5)若想制備單克隆抗體，需要用已免疫的________細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合。 答案　(1)滅活的(仙臺)病毒　流動 (2)人人融合細(xì)胞　鼠鼠融合細(xì)胞 (3)有絲分裂　106 (4)甲、丙 (5)B 解析　(1)動物細(xì)胞融合的原理是細(xì)胞膜具有一定的流動性。植物原生質(zhì)體融合的誘導(dǎo)方法有物理法和化學(xué)法，而誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的方法有物理法、化學(xué)法和生物法，因此與植物原生質(zhì)體融合過程相比，過程A特有的誘導(dǎo)方法是生物法，即用滅活的病毒處理。(2)如果僅考慮兩兩融合的細(xì)胞，融合體系中除含有人鼠融合細(xì)胞外，可能還有人人融合細(xì)胞、鼠鼠融合細(xì)胞。(3)細(xì)胞融合后的增殖方式是有絲分裂，一個人鼠融合細(xì)胞，在不分裂時染色體數(shù)目最多是人的染色體數(shù)目＋鼠的染色體數(shù)目＝46＋60＝106。(4)分析表格可知：B組有鼠的全部染色體和人的1號染色體，具有乙、丁性狀；D組只有鼠的全部染色體，具有丁性狀，可見丁性狀在鼠的染色體上，人的1號染色體上含有控制乙性狀的基因；C組有鼠的全部染色體和人的2號染色體，具有甲、丙、丁性狀；可見人的2號染色體上含有控制甲、丙性狀的基因；(5)若想制備單克隆抗體，需要用已免疫的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合。 5．(2016洛陽市考前練習(xí)四)如圖所示為細(xì)胞融合技術(shù)的一些過程，請據(jù)圖回答： (1)如果A、B細(xì)胞為植物細(xì)胞，植物細(xì)胞在細(xì)胞融合前，可先除去________，余下的部分可稱為________。這一步驟中若用酶解法，所使用的酶是(　　) A．多肽酶　　　　　　　 B．淀粉酶 C．纖維素酶 D．脂肪酶 (2)若A、B是動物細(xì)胞，一般取自幼齡動物細(xì)胞或胚胎，然后用________使其分散開來；A、B到C的過程中常用的但不能用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的手段是________，所形成的D稱為________。 (3)若該過程是制備單克隆抗體，A為小鼠漿細(xì)胞，那么，在獲得此細(xì)胞之前，小鼠已被注射了________。獲得雜交瘤細(xì)胞后，常用的擴(kuò)大培養(yǎng)方法是培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)和注入________培養(yǎng)。 答案　(1)細(xì)胞壁　原生質(zhì)體　C (2)胰蛋白酶　滅活的病毒誘導(dǎo)　雜交細(xì)胞 (3)相應(yīng)的抗原　小鼠腹腔 解析　(1)植物細(xì)胞在細(xì)胞融合前，可先除去細(xì)胞壁，余下部分稱為原生質(zhì)體，因為植物細(xì)胞壁的成分主要是纖維素和果膠，故可以纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁。(2)若A、B細(xì)胞為動物細(xì)胞，一般取自動物胚胎或出生不久的幼年動物的組織或器官，然后用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將其分散開。由A、B到C的過程中，采用的不同于植物細(xì)胞融合的手段是生物法：如滅活病毒。所形成的D稱為雜交細(xì)胞。(3)若該過程是制備單克隆抗體，A為小鼠漿細(xì)胞，那么，在獲得此細(xì)胞之前，小鼠已被注射了相應(yīng)的抗原，獲得雜交瘤細(xì)胞后，常用的擴(kuò)大培養(yǎng)方法是培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)和注入小鼠腹腔培養(yǎng)。 6．(2016懷化市二模)如圖是植物細(xì)胞雜交過程示意圖，請據(jù)圖分析完成下列問題： (1)步驟①是________，最常用的方法是________。 (2)步驟②一般常用的化學(xué)試劑是________，目的是________。 (3)在利用雜種細(xì)胞培育成為雜種植株的過程中，運(yùn)用的技術(shù)手段是________，其中步驟④相當(dāng)于________，步驟⑤相當(dāng)于________。 (4)植物體細(xì)胞雜交的目的是獲得新的雜種植株，這項研究對于培養(yǎng)作物新品種方面的重大意義在于________。 答案　(1)去壁過程　纖維素酶、果膠酶處理(酶解法) (2)聚乙二醇(PEG)　誘導(dǎo)細(xì)胞融合 (3)植物組織培養(yǎng)技術(shù)　脫分化　再分化 (4)克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，擴(kuò)大親本范圍 解析　(1)步驟①是去壁過程，常用酶解法，即用纖維素酶和果膠酶處理。(2)步驟②是人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的過程，常用的化學(xué)試劑是聚乙二醇(PEG)。(3)將雜種細(xì)胞培育成雜種植株需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，圖中④相當(dāng)于脫分化過程，⑤相當(dāng)于再分化過程。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)能克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，擴(kuò)大親本范圍。 7．Rag2基因缺失小鼠不能產(chǎn)生成熟的淋巴細(xì)胞?？蒲腥藛T利用胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)對Rag2基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療。其技術(shù)流程如圖： (1)步驟①中，在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的________。 (2)步驟②中，重組胚胎培養(yǎng)到________期時，可從其內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出ES細(xì)胞。 (3)步驟③中，需要構(gòu)建含有基因Rag2的表達(dá)載體?？梢愿鶕?jù)Rag2基因設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Rag2基因片段。用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在片段兩側(cè)進(jìn)行酶切獲得Rag2基因片段。為將該片段直接連接到表達(dá)載體，所選擇的表達(dá)載體上應(yīng)具有________酶的酶切位點。該基因表達(dá)載體上除含Rag2基因外，還應(yīng)含有________(至少寫出兩個)。用________方法將基因表達(dá)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞。 (4)為檢測Rag2基因的表達(dá)情況，利用________原理，可提取小鼠骨髓細(xì)胞的________，用抗Rag2蛋白的抗體進(jìn)行雜交實驗。 答案　(1)細(xì)胞核 (2)囊胚 (3)HindⅢ和PstⅠ　啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點　顯微注射 (4)抗原抗體雜交(分子雜交)　蛋白質(zhì) 解析　(1)核移植是將體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，所以實驗前要去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核。(2)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)位于囊胚中，所以重組胚胎培養(yǎng)到囊胚期。(3)Rag2基因是利用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割獲得的，所以表達(dá)載體應(yīng)具有HindⅢ和PstⅠ的酶切位點?；虮磉_(dá)載體的組成包括啟動子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點、目的基因(Rag2基因)。將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法。(4)基因表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，所以提取小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原－抗體雜交。 8．(2016菏澤市二模)[生物——選修3：現(xiàn)代生物科技專題] 凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵性酶。研究人員運(yùn)用基因工程技術(shù)，將編碼該酶的基因轉(zhuǎn)移到了微生物細(xì)胞中并使之表達(dá)。下圖是基因工程中獲得的基因和構(gòu)建重組質(zhì)粒過程，請回答有關(guān)問題： (1)分析上圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒(如圖所示)最好選用________限制酶，理由是________________________________________________。 (2)工業(yè)生產(chǎn)過程中，最初多采用重組大腸桿菌或芽孢桿菌生產(chǎn)凝乳酶，將目的基因?qū)氪竽c桿菌或芽孢桿菌前所做的處理方法是________________________?，F(xiàn)在生產(chǎn)凝乳酶多采用重組毛霉或重組酵母菌，毛霉或酵母菌作為受體細(xì)胞的優(yōu)勢是______________________。 (3)研究發(fā)現(xiàn)，如果將該凝乳酶20位和24位氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔浯呋芰⑻岣?倍。科學(xué)家可以生產(chǎn)上述高效凝乳酶的現(xiàn)代生物工程技術(shù)是________________，該生物工程技術(shù)的實質(zhì)是________。 (4)轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細(xì)胞工程在動植物中都有廣泛應(yīng)用，但是胚胎工程只是指對動物的________所進(jìn)行的多種亞顯微操作和處理技術(shù)。 答案　(1)BamHI和PstⅠ　提高重組DNA的比例(防止自身的黏性末端連接或防止目的基因與載體反向連接) (2)用鈣離子處理細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞 含有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體可對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和修飾 (3)蛋白質(zhì)工程　基因工程的延伸(或在基因工程基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程) (4)配子或早期胚胎 解析　(1)限制酶不能破壞目的基因，也不能破壞質(zhì)粒上的標(biāo)記基因，且應(yīng)該用不同的限制酶進(jìn)行切割，以防止自身的黏性末端連接或防止目的基因與載體反向連接，所以構(gòu)建圖示的重組質(zhì)粒應(yīng)該選擇BamHⅠ和PstⅠ。(2)基因工程中，將目的基因?qū)氪竽c桿菌等微生物細(xì)胞時，需要用氯化鈣處理大腸桿菌，使之轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞，便于目的基因的導(dǎo)入。毛霉或酵母菌含有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體可對蛋白質(zhì)進(jìn)行加工和修飾，所以生產(chǎn)凝乳酶多采用毛霉或酵母菌作為受體細(xì)胞。(3)根據(jù)題意分析，通過改造凝乳酶的氨基酸，提高了其催化功能，利用的是蛋白質(zhì)工程，該過程的實質(zhì)是基因工程的延伸，又稱為第二代基因工程。(4)胚胎工程只是指對動物的配子或早期胚胎所進(jìn)行的多種亞顯微操作和處理技術(shù)。 9．近十年來，PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如下圖所示)，在很短的時間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍，使實驗室所需的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使DNA雙鏈打開，這一步是打開________鍵，稱為________，在細(xì)胞中是在________酶的作用下進(jìn)行的。 (2)當(dāng)溫度降低時，引物與模板末端結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個DNA分子，此過程中原料是____________，遵循的原則是______________。 (3)“PCR”技術(shù)的必需條件，除了模板、原料、ATP、酶以外，至少還有三個條件，即液體環(huán)境、適宜的________和________。 (4)通過“PCR”技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制，若將一個用15N標(biāo)記的DNA分子放入試管中，以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料，連續(xù)復(fù)制4次之后，則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為________。 答案　(1)氫　解旋　解旋 (2)脫氧核苷酸　堿基互補(bǔ)配對原則 (3)溫度　酸堿度 (4)1/8