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1、二維電泳應用于糖蛋白的分離鑒定,目錄,,糖蛋白,1,,糖基化,2,,凝膠電泳—分離純化技術,3,,基于PAS反應的染色方法,4,糖蛋白（glycoprotein）,膜蛋白中的糖,膜蛋白分子中的糖,這些寡糖鏈常常是具分支的雜糖鏈，不呈現(xiàn)重復的雙糖系列，一般由2-10個單體（少于15）組成，未端成員常常是唾液酸或L-巖藻糖。,糖蛋白的結(jié)構,單糖的種類葡萄糖(Glu)半乳糖(Gal)甘露糖(Man)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)巖藻糖(Fuc)N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc),連接方式,糖蛋白的結(jié)構,糖基化,糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾最重要的方式之一，是必需的生理過程，

2、對蛋白質(zhì)生物學功能的正確發(fā)揮起著至關重要的作用。糖蛋白的形成是糖基化的一種表現(xiàn)形式,糖基化,,,,,,,,,,,,生物活性,折疊,溶解度,半衰期,抗原性,蛋白質(zhì),,糖鏈,糖蛋白,分離純化及鑒定是糖蛋白研究的重要步驟,糖蛋白的分離純化方法,,,,,,Capillaryelectrophoresis,毛細管電泳,MLC,多維液相色譜,electroblottillg,電印跡技術,gelelectrophoresis,凝膠電泳,,電泳技術的基本原理,電泳：帶電粒子在電場中的定向移動。,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),原理Pr為兩性電解質(zhì)，不同Pr其aa的數(shù)量、種類及占比例不同

3、，因此pI不同，pI范圍窄且凈電荷為零，因此依pI分離Pr。EF是在凝膠中加兩性載體電解質(zhì)，通直流電后，可形成從陽極到陰極逐步增加的pH梯度(連續(xù)的,穩(wěn)定的,線性的pH)。,原理當Pr在電場中遷移到它的PI時，由于凈電荷為零，不再移動。如擴散，附近的凝膠會使其荷電陽、陰極會重新吸引它回到pI位置。因此Pr只能在pI位置被濃縮成窄、穩(wěn)定的帶。稱這種濃縮效應為聚焦。只要凝膠中的pH梯度范圍足夠窄。便可將pI相近的Pr分開，EF是電泳技術中分辨率最高的技術。,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),,,等電聚焦(IsoelectrofocusingIEF),返回,聚丙烯酰胺凝膠電泳(

4、PAGE),聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide,簡稱Bis)在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethylethylenediamine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O3，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2,C17H2O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophore

5、sis，簡稱PAGE)。,電泳過程示意圖A為電泳前3層凝膠排列順序，3層膠中均有快離子，慢離子B顯示電泳開始后，蛋白質(zhì)樣品夾在快、慢離子之間被濃縮成極窄的區(qū)帶。C顯示蛋白質(zhì)樣品分離成數(shù)個區(qū)帶。,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,插入梳子,聚丙烯酰胺凝膠電泳,加緩沖液,加樣,聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳,剝膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳,標準Marker蛋白的電泳圖譜,聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠電泳,,可直接在膠上對糖蛋白進行酸水解或酶解后進行后續(xù)的鑒定分析或糖鏈的結(jié)構分析。,,可以同時分離多個復雜混合物,,,,,優(yōu)勢,雙向凝膠電泳（二維電泳）第一向采用等電聚焦根據(jù)復雜的蛋白質(zhì)成分中各個蛋白質(zhì)的PI的不

6、同，將蛋白質(zhì)進行分離。第二向采用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）就是按蛋白質(zhì)分子量的大小使其在垂直方向進行分離。其結(jié)果不再是條帶狀，而是呈現(xiàn)為斑點狀。,二維電泳,,膠性PH9中電加解入質(zhì)了溶雙液PH3,加上電場后建立穩(wěn)定PH梯度,蛋白質(zhì)溶液加入，建立電場,染色后，蛋白質(zhì)因PI值不同，沿PH梯度分離開,第一向等電聚焦,PI逐漸降低,等電聚焦膠放在SDS－聚丙烯酰胺凝膠上,第二向SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳,分子量逐漸降低,PI逐漸降低,雙向凝膠電泳示意圖,二維電泳,染色,二維電泳,,,,,1,基于PAS反應的染色方法,,,,,3,GelCode糖蛋白染色試劑盒,,,,,,,

7、,,,2,硼酸根熒光染料,二維電泳中糖蛋白的染色方法,基于PAS反應的染色方法,PAS--periodicacid-Schiff’sbasemethod(高碘酸/過碘酸-席夫式堿方法)原理在過碘酸的作用下，糖蛋白中糖鏈上相鄰兩個碳原子上的羥基被氧化成醛基，醛基再與帶有紫外或熒光基團的氨基形成席夫式堿，在紫外或熒光燈下檢測即可。席夫式堿——N原子和C原子雙鍵結(jié)合的一類化合物,基于PAS反應的染色方法,,,,,酸性品紅,丹酰肼熒光試劑,丹磺酰甘氨酰肼熒光試劑,Pro-QEmerald類染料,過碘酸作用顯紫紅色對還有唾液酸的糖蛋白靈敏染色7天靈敏度低μg,高碘酸作用醛基與胺基反應形成腙染色2天靈敏度低40ng反應條件苛刻,酸性條件靈敏度低10-20ng糖蛋白染色專一性高，適用于未知樣品的鑒定分析和樣品純度的鑒定,美國新發(fā)明的一種糖蛋白鑒定試劑盒反應條件溫和靈敏度極高糖基化位點表達程度圖譜熒光標記物結(jié)構尚未公開,ThankYou!,