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1、蛋白質(zhì)工程的崛起,活動(dòng)1：如果想讓某一個(gè)生物的性狀在另外一個(gè)生物的身上表達(dá)，常用的方法有哪些？,在已研究過(guò)的幾千種酶中，只有極少數(shù)可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶雖然在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒(méi)有活性或活性很低。這是因?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)中每一步的反應(yīng)體系中常常會(huì)有酸、堿或有機(jī)溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會(huì)很快變性失活。提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)非常重要的課題。一般來(lái)說(shuō)，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性包括：延長(zhǎng)酶的半衰期，提高酶的熱穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性喪失等。,干擾素是一種抗病毒、抗腫瘤的藥物。將人的干擾素的cDN

2、A在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生的干擾素的抗病毒活性為106U/mg，只相當(dāng)于天然產(chǎn)品的十分之一，雖然在大腸桿菌中合成的β-干擾素量很多，但多數(shù)是以無(wú)活性的二聚體形式存在。為什么會(huì)這樣？如何改變這種狀況？研究發(fā)現(xiàn)，β-干擾素蛋白質(zhì)中有3個(gè)半胱氨酸（第17位、31位和141位），推測(cè)可能是有一個(gè)或幾個(gè)半胱氨酸形成了不正確的二硫鍵。研究人員將第17位的半胱氨酸，通過(guò)基因定點(diǎn)突變改變成絲氨酸，結(jié)果使大腸桿菌中生產(chǎn)的β-干擾素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然β-干擾素的貯存穩(wěn)定性高很多。,例如：,玉米中賴氨酸含量比較低,天冬氨酸激酶（352位的蘇氨酸）,二氫吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺

3、）,天冬氨酸激酶（異亮氨酸）,二氫吡啶二羧酸合成酶（異亮氨酸）,玉米中賴氨酸含量可提高數(shù)倍,蛋白質(zhì)工程的概念,蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類對(duì)生產(chǎn)和生活的需求。,前提：,了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,原理：,改造基因（基因修飾或基因合成）,目的：,定向改造或制造蛋白質(zhì),基因表達(dá)流程圖,蛋白質(zhì)工程流程圖,從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相應(yīng)的脫氧核苷酸序列,,,,討論：1、怎樣得出決定這一段肽鏈的脫氧核苷酸序列？請(qǐng)把相應(yīng)的堿基序列寫出來(lái)。,活動(dòng)2某多肽鏈的一

4、段氨基酸序列是：……-丙氨酸-色氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸-……,丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG色氨酸：UGG賴氨酸：AAA、AAG甲硫氨酸：AUG苯丙氨酸：UUU、UUC,每種氨基酸都有對(duì)應(yīng)的三聯(lián)密碼子,只要查一下遺傳密碼子表,就可以將上述氨基酸序列的編碼序列查出來(lái)。但是由于上述氨基酸序列中有幾個(gè)氨基酸是由多個(gè)三聯(lián)密碼子編碼,因此其堿基排列組合起來(lái)就比較復(fù)雜,至少可以排列出16種。同學(xué)們可以根據(jù)學(xué)過(guò)的排列組合知識(shí)自己排列一下。首先應(yīng)該根據(jù)三聯(lián)密碼子推出mRNA序列為GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C），再根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律推出脫氧核苷酸序列：CGA（

5、或G或T或C）ACCTTT（或C）TACAAA（或G）。,2、確定目的基因的堿基序列后，怎樣才能合成或改造目的基因（DNA）？,可以通過(guò)人工合成的方法獲取或基因的定點(diǎn)誘變技術(shù)來(lái)改變。,基因會(huì)發(fā)生突變，突變可以自發(fā)，也可以誘發(fā)，這是每個(gè)稍有生物學(xué)知識(shí)的人都知道的常識(shí)。但在加拿大生物化學(xué)家M史密斯（1932－2000）發(fā)明定點(diǎn)突變法之前，突變株的產(chǎn)生必須經(jīng)由自然界或用化學(xué)等方法誘使基因體突變。這類方法屬于隨機(jī)突變，突變株必須在生物性狀上有所改變，才能確定有突變發(fā)生，但除非用分子生物方法或遺傳方法找到此突變處，否則無(wú)法確定突變位置。也就是說(shuō)，這種突變是盲目的。而史密斯發(fā)明的定點(diǎn)突變法卻是有目的的，該

6、法可經(jīng)由設(shè)計(jì)好的寡核苷酸，在任何一個(gè)基因片段上進(jìn)行隨意或設(shè)計(jì)好的突變，也就是說(shuō)，這種突變是預(yù)先設(shè)定好的，所以也有人將該法稱為“反遺傳法”。有意思的是這一給生命科學(xué)研究及應(yīng)用領(lǐng)域帶來(lái)革命性突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡時(shí)閑聊出來(lái)的。現(xiàn)在，幾乎每個(gè)生物實(shí)驗(yàn)室都會(huì)用定點(diǎn)突變法來(lái)研究基因或蛋白質(zhì)的功能。,蛋白質(zhì)工程的主要步驟通常包括：（1）從生物體中分離純化目的蛋白；（2）測(cè)定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射線晶體衍射等手段，盡可能地了解蛋白質(zhì)的二維重組和三維晶體結(jié)構(gòu);,（4）設(shè)計(jì)各種處理?xiàng)l件，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，包括折疊與去折疊等對(duì)其活性與功能的影響；（5）設(shè)計(jì)編碼該蛋白的基因改造方

7、案，如定點(diǎn)突變；（6）分離、純化新蛋白，功能檢測(cè)后投入實(shí)際使用。,,（二）蛋白質(zhì)改造工程舉例1．水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特異抑制劑，它有多種變異體，由65或66個(gè)氨基酸殘基組成。水蛭素在臨床上可作為抗栓藥物用于治療血栓疾病。為提高水蛭素活性，在綜合各變異體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上提出改造水蛭素主要變異體HV2的設(shè)計(jì)方案，將47位的Asn（天冬酰胺）變成Lys（賴氨酸），使其與分子內(nèi)第4或第5位Thr（蘇氨酸）間形成氫鍵來(lái)幫助水蛭素N端肽段的正確取向，從而提高抗凝血效率，試管試驗(yàn)活性提高4倍，在動(dòng)物模型上檢驗(yàn)抗血栓形成的效果，提高20倍。,2．生長(zhǎng)激素改造生長(zhǎng)激素通過(guò)對(duì)它特異受體的作用促

8、進(jìn)細(xì)胞和機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，然而它不僅可以結(jié)合生長(zhǎng)激素受體，還可以結(jié)合許多種不同類型細(xì)胞的催乳激素受體，引發(fā)其他生理過(guò)程。在治療過(guò)程中為減少副作用，需使人的重組生長(zhǎng)激素只與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合，盡可能減少與其他激素受體的結(jié)合。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者受體結(jié)合區(qū)有一部分重疊，但并不完全相同，有可能通過(guò)改造加以區(qū)別。由于人的生長(zhǎng)激素和催乳激素受體結(jié)合需要鋅離子參與作用，而它與生長(zhǎng)激素受體結(jié)合則無(wú)需鋅離子參與，于是考慮取代充當(dāng)鋅離子配基的氨基酸側(cè)鏈，如第18和第21位His（組氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)先設(shè)想一致，但要開(kāi)發(fā)作為臨床用藥還有大量的工作要做。,3．胰島素改造天然胰島素制劑在儲(chǔ)存中易形

9、成二聚體和六聚體，延緩胰島素從注射部位進(jìn)入血液，從而延緩了其降血糖作用，也增加了抗原性，這是胰島素B23-B28氨基酸殘基結(jié)構(gòu)所致。利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)改變這些殘基，則可降低其聚合作用，使胰島素快速起作用。該速效胰島素已通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)。,4．治癌酶的改造癌癥的基因治療分二個(gè)方面：藥物作用于癌細(xì)胞，特異性地抑制或殺死癌細(xì)胞；藥物保護(hù)正常細(xì)胞免受化學(xué)藥物的侵害，可以提高化學(xué)治療的劑量。皰疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它結(jié)構(gòu)類似物磷酸化而使這些堿基3’-OH缺乏,從而阻斷DNA的合成，殺死癌細(xì)胞。HSV—TK催化能力可以通過(guò)基因突變來(lái)提高。從大量的隨機(jī)突變中進(jìn)行篩選出一種酶,在酶活性部位附近有6個(gè)氨基酸被替換，催化能力20倍以上。蛋白質(zhì)工程的發(fā)展很快，研究工作很多，以上僅介紹了幾個(gè)例子。蛋白質(zhì)工程除了用于改造天然蛋白質(zhì)或設(shè)計(jì)制造新的蛋白質(zhì)外，其本身還是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的一種強(qiáng)有力的工具，它在解決生物理論方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并論。,蛋白質(zhì)工程的進(jìn)展與前景,蛋白質(zhì)工程目前的現(xiàn)狀：成功的例子不多，主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)揮其功能需要依賴于正確的空間結(jié)構(gòu)，而科學(xué)家目前對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)了解很少。,活動(dòng)3比較基因工程和蛋白質(zhì)工程,,,,,,,,,,活動(dòng)3比較基因工程和蛋白質(zhì)工程,