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1、免疫分析技術(shù)之ELISA,廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王娟,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),細(xì)胞水平,分子水平,基因水平,,,,體外（或體內(nèi)）測(cè)定各類細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和效應(yīng)，從而了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平,測(cè)定各類免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、黏附分子的表達(dá)水平和生物活性，從而了解機(jī)體免疫因子間的相互關(guān)系,測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析,ELISA概念,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA），是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatictechniques)上發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)，基礎(chǔ)是：抗原或抗體的

2、固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。,酶免疫測(cè)定類型,這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱ELISA。,1.1抗原抗體反應(yīng),1.1.1可逆性,抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAb抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb，AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。,

3、1.1.2特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,,1.1.3敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。,1.2免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。,基本原理,使抗原

4、或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。,2ELISA的類型,EL

5、ISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。,2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原,A.將抗體吸附于固相表面；B.加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；C.加酶標(biāo)抗體；D.加底物。底物的降解量抗原量。,此法適用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。,2.2雙抗原夾心法測(cè)抗體,用特異性抗原進(jìn)行包被和制

6、備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,2.3間接法測(cè)抗體,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。,A.將抗原吸附于固相載體表面；B.加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測(cè)定底物的降解量抗體量,2.4競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。,2.5競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因

7、此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。,2.6捕獲包被法測(cè)抗體,,,,IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。,2.7ABS-ELISA法,：固相支持物；：樣品；：特異性IgG；：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；：DAB顯色液；

8、：顯色；,3.ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液,ELISA的試劑準(zhǔn)備A,固相載體聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯，聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。,3.

9、1.2包被的方式,,將抗原或抗體固定的過(guò)程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。,不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載

10、體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。,天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。,3.1.3包被用抗原,3.1.4包被用抗體,IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較

11、高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.5包被的條件,pH9.6碳酸鹽緩沖液pH7.2的磷酸鹽緩沖液pH7-8的Tris-HCL緩沖液加入包被液后，在4-8冰箱中放置過(guò)夜，37中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：

12、0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。所有的ELISA固相均需封閉？,ELISA的試劑準(zhǔn)備B,3.2結(jié)合物,即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑1酶的催化活性2抗體（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游離的抗體（或抗原）4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性,3.2.1結(jié)合物用的抗原和抗體,制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,,3.2

13、.2酶,純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過(guò)氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)

14、是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.,3.2.3結(jié)合物的制備,結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。,酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度

15、較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。,3.2.4結(jié)合物的保存,用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8保存期可達(dá)6個(gè)月。,3.2.5結(jié)合物的稀釋,試劑準(zhǔn)備C酶的底物,3.3酶的底物,3.3.1HRP的底物,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物

16、最常用的底物。,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(ureaperoxide)。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較

17、高于用顯色底物的比色法。,4對(duì)照設(shè)定,陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)和陰性對(duì)照品(negativecontrol)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。,參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。,陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含H

18、BsAg，最好抗HBs也是陰性。,5標(biāo)本的采取和保存,體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。,加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。,基本操作注意事項(xiàng),保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，

19、抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。,洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和

20、浸泡式兩種：,（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。（2）浸泡式微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。,顯色,顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的

21、影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。,比色,拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸

22、收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,酶標(biāo)比色儀,酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時(shí)室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。,6結(jié)

23、果判斷,6.1定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。,A.陽(yáng)性判定值：（cut-offvalue）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。B.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較

24、難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值,。,間接法和夾心法,（2）競(jìng)爭(zhēng)法,因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。a.陽(yáng)性判定值法陰性判定值=0.4NCX+0.6PCX陽(yáng)性A陽(yáng)性判定值陰性A陽(yáng)性判定值b.抑制率法抑制率（%）=（陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）100%/陰性對(duì)照陽(yáng)性抑制率50%為陰性50%,4.7.2定量測(cè)定,ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)

25、定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。,4.ELISA的操作要點(diǎn),嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。,,,免疫分析技術(shù)之液相芯片技術(shù)及應(yīng)用,廣東省功能蛋白質(zhì)組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王娟,,,liquichip液相芯片系統(tǒng)___,液相芯片系統(tǒng)有機(jī)地整和了有色微球（color-codedmicrosphereorbead）、激光技術(shù)、流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了Luminex100無(wú)與倫比

26、的檢測(cè)特異性和靈敏度。,Benefits,Applications,Future,Technology,Principle,Mostbioassaysconsistoftwoormorebiomoleculesinteracting,Principle,UsingLiquiChip-Technologythesebiologicalinteractionstakeplaceonsmall,microscopicalbeadsthesebeadsarefluorescent(red),Principle,DetectionandQuantitationofthesebiologicalinter

27、actionsismadebyfluorescentdetectionreagents,Beads球形基質(zhì),Capturemolecule探針分子,Analyte待檢測(cè)物,Reportermolecule報(bào)告分子,,,,AssaysonUniformPolystyrene(聚苯乙烯)Beads,Diameter5.6m,TwointernalDyesforBeadClassification,,,DefinedMixtureDyinginShrinkinginofbothDyesOrganicSolventAqueousSolvent,Two-ColorBead-Coding,Basedonx

28、MAPtechnologyByusing10differentlevelsofeachoftwofluorescentdyes,anarrayof100beads,eachwithauniquecolorsignature,iscreated,為了便于探針分子的固定，在球形基質(zhì)的表面進(jìn)行了一系列的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定,“LiquidArray”Technology,Differentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell,“LiquidArray”

29、Technology,Differentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell,“LiquidArray”Technology,Differentbeadcodes(colors)areusedtoallowtheidentificationofmultiplereactionsinasinglewell,反應(yīng)主要包括3個(gè)步驟,探針分子的固定將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報(bào)告熒光的報(bào)告分子與目的分子特異性的結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)

30、行定量反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè),LiquiChipWorkstation,Flowcytometer-basedtechnologyMeasuresfluorescenceComponents:ReaderMicroplateHandlerFluidModule,FlowCytometerbasedAnalysis,BeadsarealignedinasinglefilestreambyhydrodynamicfocusingTwolasersareusedforexcitationoffluorescence,PrincipleofDetection,Theredlaserisusedtoidenti

31、fythebeadcodeThegreenlaserisusedtoidentifythereportersignal,利用這100種球形基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)。,,A,F,H,E,B,G,C,D,,Benefits,系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)方案，使用者可以自行設(shè)計(jì)分析方案，也可使用成套試劑盒通量大，可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè)液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測(cè)物的反應(yīng)靈敏度高，信噪比好，只需要微

32、量的樣品即可進(jìn)行檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低,,,,Liquichip和ELISA靈敏度的比較分別用ELISA和liquichip對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行定量測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線I：使用liquichip測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線II、III：使用ELISA測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,ComparedtoELISA:,樣本需求量小:ELISA每次實(shí)驗(yàn)均至少需要100200l外周血，而采用液相芯片只需50l血液即可在一支試管中完成所有檢測(cè)項(xiàng)目,總體可節(jié)約80%以上的樣本，這對(duì)外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有意義;操作流程簡(jiǎn)化:由于ELISA工作曲線的置信區(qū)間僅23對(duì)數(shù)級(jí)，因而對(duì)于較高濃度的細(xì)胞因子的檢測(cè),其樣本必須經(jīng)

33、不同程度的稀釋以滿足實(shí)驗(yàn)精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達(dá)45對(duì)數(shù)級(jí)，活性范圍可10倍于ELISA,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌步驟;高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率大大高于ELISA固相沉底。,Measuringthelevelofmanyhumanormousecytokinesinasinglesample,Ready-to-useBroad-RangeKinasekitsformeasuringkinaseactivity,Ser/ThrKinase,TyrKinaseKitKinase/PhosphorylatedProtein,nowashin

34、gstepsfasterhigherthroughputquantitativeassayresultsnohazardousgels/radioactivitySensitivity:higherthanECL/colorimetricassays,comparabletoorbetterthanradioactiveassays,AdvantagescomparedtoWesternblotprocedures,Applications,WhentousetheLiquiChipSystem?,TheLiquiChipSystemisusedforalargevarietyofprotei

35、nassays:ImmunoassaysEnzymeAssaysProtein-proteininteractionAssaysReceptorligandAssaysProteinnucleicacidassays,AssayTypes,Immunoassays,Enzymeassays(kinase,protease),DNA-hybridizationassays,Interactionassays,RealizethePowerofSuspensionArrays,Assaysystemthatoffers:multiplexingofassaysuptoafactorof100ami

36、x-and-measureprocedures(nowashing)suspensionenzymeassays(kinase,phosphataseandproteaseassays),,,Autoimmune,ASCAHumanbeta-2MicroglobulinHumanMouseCentromereBHumanChromatinHumanENAProfile4(SSA,SSB,Sm,RNP)HumanENAProfile5(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70)HumanENAProfile6(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1)HumanHistoneHum

37、anHistoneH1HumanHistoneH2AHumanHistoneH2BHumanHistoneH3HumanHistoneH4HumanHSP-27pS82GeneralHSP-27TotalGeneralHSP-32HumanHSP-65HumanHSP-71HumanHSP-90aHuman,HSP-90bHumanJo-1HumanPCNAHumanMousePR3HumanPR3(cANCA)MouseRibosomalPHumanMouseRNPHumanMouseRNP-AHumanRNP-CHumanSCFHumanMouseScl-70HumanMouseSerum

38、AmyloidPHumanSLEProfile8(SSA,SSB,Sm,RNP,Scl-70,Jo-1,Ribosome-P,chromatin)HumanSmGeneralHumanSmithMouseHumanSSAHumanMouseSSBHumanMouseStreptolysinOHumanTPOHumanMouse,AllergyTesting,Alternaria(Mold)HumanBermudaGrassHumanCatDanderHumanEggWhiteHumanMilkHumanMitePternoyssinusHumanMountainCedarHumanShortR

39、agweedHumanTimothyGrassHumanWheat(food)Human,CancerMarkers,alphaFetoproteinHumanCancerAntigen125HumanCarcinoembryonicAntigenHumanPSA,FreeHuman,CardiacMarkers,CreatineKinase-MBHumanEndothelin-1MousePAPHumanSGOTHumanMouseTIMP-1HumanMouse,Cytokines,BDNFHumanCREBpS133GeneralCREBTotalGeneralDR-5HumanEGFH

40、umanMouseENA-78HumanEotaxinMouseHumanFattyAcidBindingProteinHumanFGF-basicHumanMouseG-CSFHumanMouseGCP-2MouseGM-CSFHumanMouseRatGRO-KCRatHGFHumanMouseICAM-1HumanIFN-alphaHumanIFN-gammaHumanMouseRatIL-10HumanMouseRatIL-11MouseIL-12HumanMouseIL-12p40HumanMouseIL-12p40/p70MouseRatIL-12p70HumanMouseRatI

41、L-13HumanMouseIL-15HumanMouseIL-16HumanIL-17HumanMouse,IL-18RatIL-1alphaMouseHumanRatIL-1betaHumanMouseRatIL-1raHumanIL-1ra/IL-1F3HumanIL-2HumanMouseRatIL-3HumanMouseIL-4HumanMouseRatIL-5HumanMouseIL-6HumanMouseRatIL-7HumanMouseIL-8HumanIL-9MouseIP-10HumanMouseJE/MCP-1MouseKCMouseKC/GROaMouseLIFMous

42、eLymphotacinHumanMouseM-CSFMouseMCP-1HumanMouseRatMCP-1(MCAF)HumanMCP-3MouseMCP-5MouseMDCHumanMouse,MIGHumanMouseMIP-1alphaHumanMouseMIP-1betaHumanMouseMIP-1gammaMouseMIP-2MouseMIP-3betaMouseOSMMousePDGF-BBMouseRANTESHumanMouseRb(pT821)HumanRb(total)HumanRbpSpT249/252HumanTau(pS214)HumanTau(pS396)Hu

43、manTau(total)HumanTissueFactorHumanMouseTNF-alphaHumanMouseRatTNF-betaHumanTNF-RIHumanTNF-RIIHumanVCAM-1MouseVEGFHumanMouse,Endocrine,AdiponectinHumanRatAmylinMouseRatHumanC-PeptideHumanCalcitoninHumanCRFHumanFGF-9MouseGLP-1HumanMouseRatGlucagonMouseRatHumanGrowthHormoneHumanMouseInsulinHumanMouseRa

44、tLeptinHumanMouseRatLipoprotein(a)HumanResistinHumanMouseRatT3HumanT4HumanTBGHumanThyroglobulinHumanTSHHuman,Genotyping,FlexMAPGeneralMitochondrialDNAScreeningGeneralTag-ItMutationDetectionKitGeneralY-SNPIdentificationGeneral,Infectiousdisease,AdenovirusHumanMouseBordetellapertussisHumanCampylobacte

45、rjejuniHumanChlamydiapneumoniaeHumanChlamydiatrachomatisHumanCholeraToxinHumanCholeraToxinbHumanClostridiumpiliforme(Tyzzers)MouseCytomegalovirusHumanMouseDiphtheriaToxinHumanEctromeliavirusMouseEDIM(Epidemicdiarrheaofinfantmice)MouseEncephalitozooncuniculiMouseEpstein-BarrEAHumanEpstein-BarrNAHuman

46、Epstein-BarrVCAHumanHBVCoreHumanHBVEnvelopeHumanHBVSurface(Ad)HumanHBVSurface(Ay)HumanHCVCoreHumanHCVNS3HumanHCVNS4HumanHCVNS5HumanHelicobacterpyloriHumanHepatitisAHumanHepatitisDHuman,HIV-1gp41HumanHIV-1p24HumanHPVHumanHSV-1gDHumanHSV-1/2HumanHSV-2gGHumanHTLV-1/2HumanInfluenzaAHumanInfluenzaAH3N2Hu

47、manInfluenzaBHumanLeishmaniadonovaniHumanLymediseaseHumanLymphocyticchoriomeningitisvirusMouseM.pneumoniaeHumanM.tuberculosisHumanMinutevirusMouseMumpsHumanMycoplasmapulmonisMouseParainfluenza1HumanParainfluenza2HumanParainfluenza3Human,ParvovirusMousePneumoniavirusofmiceMousePolioVirusHumanPolyomav

48、irusMouseReovirus-3MouseRSVHumanRubellaHumanRubeolaHumanSendaivirusMouseT.cruziHumanT.pallidum15kdHumanT.pallidump47HumanTetanusToxinHumanTheilersmouseencephalomyelitisvirusMouseToxoplasmaHumanVaricellazosterHumanHEVorf23KDHumanHEVorf26KDHumanHEVorf33KDHumanHIV-1gp120Human,Isotyping,IgAHumanMouseIgE

49、HumanMouseIgG1MouseIgG2alphaMouseIgG2betaMouseIgG3MouseIgMHumanMouselightchain(kappaorgamma)Mouse,Kinase/PhosphorylatedProtein,AktGeneralAkt/PKB(total)GeneralAkt/PKBpS473GeneralATF2(Thr71)GeneralErk-2GeneralErk1(Thr202/Tyr204)GeneralErk1/Erk2(Thr202/Tyr204)GeneralErk2(Thr202/Tyr204)GeneralGSK-3betaG

50、eneralIkappaB-alphapS32GeneralIkappaB-alphaTotalGeneralJNK(pTpY183/185)GeneralJNKTotalGeneralJNKp(Thr183/Y182)General,MAPKAPK2Generalp38(total)Generalp38MAPKpT180/pY182Generalp53(total)Generalp53pS15GeneralPKB-alphaGeneralPKCGeneralSAPK1GeneralSAPK1a/JNK2GeneralSAPK4GeneralSTAT1pY701GeneralSTAT1Tota

51、lGeneralSTAT3(Tyr705)GeneralZAP-70General,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,4000,8000,12000,16000,20000,,Control,,LPS,IP-10,KC,MCP-1,MIG,MIP-1,GM-CSF,IFN-,IL-10,IL-12,IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,TNF-,圖1.BALB/c小鼠內(nèi)毒素休克后3h肝臟組織中細(xì)胞因子的表達(dá)譜改變,MFI,1/2,Future,Spectral-notSpatialSeparation,Questions?,