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1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題,,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)專題,電泳技術(shù)簡(jiǎn)介,什么是電泳技術(shù)？ 電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。,電泳技術(shù)的分類,電泳法可分為自由電泳（無支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。 自由電泳包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。 區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、醋酸纖維薄膜電泳、非凝膠

2、性支持體區(qū)帶電泳（支持體有：淀粉，纖維素粉，玻璃粉，硅膠等)、凝膠支持體區(qū)帶電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。,凝膠電泳技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理,瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。其本身不帶有電荷。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物、核酸與核蛋白的分離、鑒定及純化。,瓊脂糖凝膠電泳：實(shí)驗(yàn)原理,DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同D

3、NA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 DNA 分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA ，也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA 分子。,瓊脂糖與瓊脂的區(qū)別,瓊脂是由瓊脂糖（agarose）和瓊脂果膠（agaropectin）組成的。瓊脂糖的結(jié)構(gòu)單元是 D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖；瓊脂果膠是由許多更小的分子組成的異質(zhì)混合物。它們的結(jié)構(gòu)相似，但瓊脂果膠帶硫酸根和羧基組分，凝膠能力差。 在瓊脂糖制備過程中需要把瓊脂果膠盡量去除，否則瓊脂糖有可能存在極微量硫酸根和丙酮酸取代電離基團(tuán)，就會(huì)造成電內(nèi)滲，

4、電內(nèi)滲對(duì)質(zhì)點(diǎn)的移動(dòng)產(chǎn)生影響。質(zhì)量較好的瓊脂糖硫酸根含量比較低，通常在0.2%以下，電內(nèi)滲比較小，通常在0.13%以下。 簡(jiǎn)言之，瓊脂糖是從瓊脂中精細(xì)提取的，有自身獨(dú)特的性質(zhì)，所以瓊脂糖要比瓊脂貴得多。,瓊脂糖凝膠電泳特點(diǎn),瓊脂糖凝膠的配置,1.根據(jù)電泳需要，配置合適濃度的電泳及制膠緩沖液。一般為 1 TAE或0.5TBE。注意：用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須是相同的。 2.根據(jù)制膠量及凝膠濃度，在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中，加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉。 注意：總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。 3. 在微波爐中加熱溶解瓊脂糖注意：必須保證瓊脂糖充分完全溶解，否則，會(huì)造成電泳圖

5、像模糊不清。加熱時(shí)如膠液劇烈沸騰發(fā)泡，停止加熱。微波爐中加熱時(shí)間不宜過長(zhǎng)。,瓊脂糖凝膠的配置,3.使溶液冷卻至60左右，如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5ug/ml，并充分混勻不提倡使用。注意：溴化乙錠是一種致癌物質(zhì)。使用含有溴化乙錠的溶液時(shí)，請(qǐng)戴用手套。溴化乙錠在可見光下會(huì)分解。 5. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在35 mm 之間。 注意：不要產(chǎn)生氣泡，溶液溫度太高(60)，會(huì)使得水分過分蒸發(fā)，改變凝膠離子濃度，影響電泳效果。 6. 在室溫下使膠凝固（大約30 分鐘），然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。注意： 凝膠不立即使用時(shí)，用保鮮膜

6、將凝膠包好在4下保存，或者放在制膠的緩沖液中，一般可保存25 天。,瓊脂糖凝膠緩沖液,有幾種緩沖液適用于天然雙鏈DNA的電泳 Tris-乙酸鹽和EDTA緩沖液（pH8.0,TAE，也稱為E緩沖液） Tris-硼酸鹽緩沖液(TBE) Tris-磷酸鹽緩沖液(TPE),瓊脂糖凝膠緩沖液,瓊脂糖凝膠緩沖液,瓊脂糖凝膠緩沖液,TBE可以使用10次左右，而TAE用23次就要更換。電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA條帶模糊或不規(guī)則DNA帶遷移。 電泳緩沖液剛好沒過凝膠1mm為好，太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,載樣緩沖液是上樣時(shí)與樣品一起加入泳道的

7、。載樣緩沖液有三個(gè)作用： 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)； 使樣品帶有顏色便于上樣操作； 其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。 上樣緩沖液有幾種，但基本都包括溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖凝膠的濃度無關(guān)； 在0.5TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)的速率約與長(zhǎng)約300bp的線性雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4kb的DNA相同。在0.5%-1.4%濃度的瓊脂糖凝膠中基本不會(huì)變化。,瓊脂糖凝膠載樣緩沖液,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,瓊脂糖凝膠的濃度,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,瓊脂糖凝膠的濃度,,影響電泳遷移率的因素,影響電泳遷移率的因素,DNA電泳常見問題分析,DNA電泳常見問題分析,DNA電泳常見問題分析,