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1、高效液相色譜法,High Performance Liquid Chromatography （HPLC）,前言:,HPLC是70年代以后發(fā)展最快的一個分析化學(xué)分支，現(xiàn)已成為生化、醫(yī)學(xué)、藥物、化學(xué)化工、食品衛(wèi)生、環(huán)保檢測等領(lǐng)域最常用的分離分析手段。,我國：,開始僅為少數(shù)研究實驗室擁有， 現(xiàn)很多的生產(chǎn)、研究、質(zhì)檢部門。 廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制、分析化驗、制備分離。例： 講課目的：入門 教材問題： 學(xué)習(xí)要求：,課時安排： 第一章：高效液相色譜的基本原理 6學(xué)時 第二章：高效液相色譜的儀器裝置 2學(xué)時 第三章：液固、液液、鍵合相色譜 4學(xué)時 第四章：離子交換色譜和離子對色譜 3學(xué)時 第

2、五章：凝膠滲透色譜 1學(xué)時 第六章：實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù) 2學(xué)時 機(jī)動 2學(xué)時 第3、5、7周實驗,參考書籍：,1.色譜理論基礎(chǔ)（盧佩章、戴朝政編） 2.高效液相色譜法（鄒漢法、張玉奎、盧佩章編著） 3.高效液相色譜方法及應(yīng)用 （色譜技術(shù)叢書、化學(xué)工業(yè)出版社、 于世林編著),本課程基本要求：,1. 掌握色譜法的分類及有關(guān)術(shù)語； 2. 了解柱效的影響因素； 3. 掌握分離度的影響因素； 4. 了解定性、定量分析方法； 5. 掌握液相色譜儀的基本結(jié)構(gòu)及功能； 6. 掌握常用的液相色譜法基本概念及分離 對象 7. 掌握液相色譜的基本操作技能；,第一章 高

3、效液相色譜法基本原理,1-1 概述 一.發(fā)展歷史: 100多年前俄國植物學(xué)家Tswett分離 植物色素時采用的實驗方法: Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜) 描述他的實驗方法 即:Chromatography(色譜法),色譜法的發(fā)展,1906年正式命名 20世紀(jì)30年代開始廣泛研究和應(yīng)用 (柱色譜,薄層色譜氣相色譜) 高效液相色譜法的廣泛應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代,,現(xiàn)代液相色譜分析方法。 經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)， 引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)， 高壓輸送流動相， 高效固定相及高靈敏度檢測器.,二、色譜法概述,混合物最有效的分離、分析方法。 色譜法是一種分離

4、技術(shù)。 混合物分離過程：試樣中各組分在 色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的 分配。 一相固定不動，稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定 相的液體，稱為流動相。,高效液相色譜法的特性:,高壓、高效、高速、高靈敏。 適用：高沸點、熱不穩(wěn)定樣品,液相色譜儀,,,高效液相色譜儀流程圖,三、色譜法原理,,混合物中各組份在不同的兩相中溶解,吸附等化學(xué)作用性能的差異,當(dāng)兩相相對運動時,使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離 兩相中一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase), 一相是流動的,稱為流動相(Mobile Phase), (洗脫劑,溶劑

5、),分離原理:,分離是一個 物理過程。,,固定相(Stationary Phase) 流動相(Mobile Phase) 進(jìn)樣 (Injection) 洗脫 (Elution) 相互作用(Interaction),當(dāng)混合物進(jìn)入色譜柱后，就在固定相、流動相之間不斷地進(jìn)行分配平衡。不同的化合物，分子結(jié)構(gòu)不同，理化性質(zhì)不同，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配系數(shù)K有關(guān)： K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用強(qiáng)，后流出柱子。,四、高效液相色譜法的特點,高壓 以液體作為流動相，液體流經(jīng)色譜柱時，受到阻力較大 必須對流動相施加高壓。

6、 一般可達(dá)到150300kgcm2， 甚至可達(dá)700kgcm2以上。,高速 所需的分析時間較經(jīng)典液體色譜少得多（交換速度快），流量可達(dá)l10mLmin,高效 氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高（化學(xué)鍵合相），一般約可達(dá) 6000理論塔板米,高靈敏度 紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)(10-9 g)； 熒光檢測器的靈敏度可達(dá)10-11g。 所需試樣很少；微升數(shù)量級 高選擇性 可分離不同類型化合物和異構(gòu)體，也可分析在性質(zhì)上極為相似的化合物 (同位素、同分異構(gòu)體、空間異構(gòu)體、手性化合物）,,五、HPLC與GC區(qū)別,1分析對象的區(qū)別 GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、沸點低的樣

7、 品， 占有機(jī)物的20% HPLC：適于溶解后能制成溶液的樣品. 對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差 樣品均可檢測 。 占有機(jī)物的80%,2流動相的區(qū)別 GC：流動相為惰性，組分與流動相無親合作用 力，只與固定相有相互作用。 HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用 力，能提高柱的選擇性、改善分離度. 對分離起主要作用。 3操作條件差別 4.分析樣品區(qū)別 GC：加溫操作 GC：破壞樣品，不能回收 HPLC：室溫；高壓 HPLC：不破壞樣品，能回收 說明：氣相、液相地位同樣重要 兩種互補(bǔ)不足的色譜方法 靈敏度：氣相液相 應(yīng)用范圍：液相氣相,六、色譜法的分類,

8、吸附色譜(Absorption Chromatography) 組分對固定相表面吸附力的不同而分離 分配色譜(Partition Chromatography) 組分在固定相和流動相中的溶解度不同而分離 離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography) 組份離子交換親和力的差異而分離 體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography) 組分分子量大小不同,對固定相的滲透力不同而分離,基本概念 一、色譜圖（chromatogram）,檢測器將流動相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號。 記錄儀所記錄下的濃度對分離時間的函數(shù)，稱為色譜圖。,色譜過程特點

9、：,濃度對分離時間呈高斯曲線型 色譜條件一定時，各組分都有一特定時間在圖譜中出現(xiàn)，稱為組分的保留時間。 柱效一定時，組分保留值越小，峰越 窄；保留值越大，峰越寬。 相鄰峰的保留時間相差越大，越易分離。,常用術(shù)語： 1. 基線 : 僅有純流動相進(jìn)入檢測器時的流 出曲 線。 2.色譜峰: 響應(yīng)信號大小隨時間變化所形成的峰 形曲線。(正態(tài)分布),3.峰高與峰面積： 峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離 用h表示。,峰面積： 峰與峰底之間的面積 ，用A表示。 二、色譜保留,,1. 保留時間（tR） 從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)樣品的濃度極大值所需的時間，用tR表示。,2.分配系數(shù)

10、K,組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、揮發(fā)的過程叫做分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的濃度比（單位：g/mL），稱為分配系數(shù)，用K 表示:,分配系數(shù)是色譜分離的依據(jù)。,分配系數(shù)K 的討論,一定溫度下，組分分配系數(shù)K越大，出峰越慢； 每個組份在各種固定相上的分配系數(shù)K不同； 選擇適宜的固定相可改善分離效果； 各組分有不同K 值是分離的基礎(chǔ)（差移速度） 某組分的K = 0時，即不被固定相保留，最先流 出。,3.容量因子k (capacity factor),一定溫度下，組分在兩相間分配達(dá)到平衡時的質(zhì)量比。,1.與k都是與組分及固定相的熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān) 的常數(shù), 隨分

11、離柱溫度、柱壓的改變而變化 2.與k都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數(shù) ，數(shù)值越大，該組分的保留時間越長。 3. 容量因子可以由實驗測得。,4. 容量因子與保留時間的關(guān)系,推導(dǎo): ux：組分在分離柱內(nèi)的遷移速度； u：流動相在分離柱內(nèi)的遷移速度；,,組分和流動相通過長度L的分離柱，需要時間分別為tR和t0，則 tR = to(1+k),k太小---沒有充分利用填料的分離能力 k太大---分析時間太長 k范圍： k 1/0（0溶劑強(qiáng)度---使組分遷移快慢的能力） P310 表3-10,作業(yè)：,思考題: 1、2、3、4、5、6、8、9,5. 選擇性系數(shù),可用來衡量兩物質(zhì)的分離程度，

12、用表示。,色譜理論需要解決的問題？,色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題。,組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？ 組分保留時間：色譜過程的熱力學(xué)因素控制； （組分和固定相的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)） 色譜峰變寬：色譜過程的動力學(xué)因素控制； （兩相中的運動阻力，擴(kuò)散） 兩種色譜理論：塔板理論和速率理論。,1-3 色譜柱的分離效率,一、塔板理論,塔板理論認(rèn)為: 一根柱子可以分為n段，每段內(nèi)組分在兩相間迅速達(dá)到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。 設(shè)柱長為L，理論塔板高度為H，則 H=L/ 為理論塔板數(shù)。,,,理論塔板數(shù)一N 色譜峰對稱 ： 說明： a. 在給定的操作條件下，N幾乎相同 b. N為常

13、量時，tw 隨 tR 成正比例變化 c. 與柱長有關(guān): 比較不同長度色譜柱的柱效時， 應(yīng)當(dāng)比較它們在相同柱長下的N值。例 d. 是一種理想狀態(tài),,, 有拖尾峰時: 可用半峰寬來表示N： N554 ( tR / W1/2 ) 2 W1/2 -----半峰寬,例：測得tR=105mm、 W1/2 =4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數(shù)約為15200.,,理論塔板高度H,物理意義：組分在兩相間達(dá)到一次平衡對應(yīng) 的柱長 H愈小組分在兩相間平衡分配次數(shù)越多 柱效（不能說明分離一定實現(xiàn)）,說明：,大，固定相分離潛能大。 （分離與否，還取決于其

14、他色譜條件） 一定色譜條件下，對k有差異的組分，則柱效愈高，分離效果愈好。,塔板理論的特點和不足：,(1)當(dāng)L一定時，N 越大(H 越小)，被測組 分在柱內(nèi)被分配的次數(shù)越多，柱效越 高，所得色譜峰越窄。 (2)柱效不能表示被分離組分的實際分離 效果：如兩組分的分配系數(shù)K 相同， 無論該色譜柱的柱效多大，都無法 分離。,(3)塔板理論無法解釋同一色譜柱在 不同的流動相流速下柱效不同的 實驗結(jié)果，也無法指出影響柱效 的因素及提高柱效的途徑。,二.峰擴(kuò)展和速率方程式,1.峰擴(kuò)展--由于柱內(nèi)柱外各種因素引起的色譜峰變寬或變形，從而造成色譜柱效的降低 峰擴(kuò)展程度：取決于組分在柱內(nèi)平衡分 配次

15、數(shù) 例： 引起峰擴(kuò)展因素：柱內(nèi)、柱外,柱外因素,檢測器流動池體積（盡量?。?柱出口到檢測器的連接管（盡量短） 進(jìn)樣器死體積,2. 速率方程式（范弟姆特方程式）,H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度， u：流動相流速(cm/s)。 減小A、B、C 三項可提高柱效。 A，B，C 三項各與哪些因素有關(guān)？,A 渦流擴(kuò)散項,A = 2dp dp：固定相的平均顆粒直徑 ：固定相的填充不均勻因子,固定相顆粒越小dp，填充得越均勻，A，H，柱效。表現(xiàn)在渦流擴(kuò)散所引起的色譜峰變寬現(xiàn)象減輕，色譜峰較窄。,B/u 分子擴(kuò)散項,B = 2 D D：試樣組分分子的擴(kuò)散系數(shù)（cm2

16、s-1） (1) 存在著濃度差，產(chǎn)生縱向擴(kuò)散; (2) 擴(kuò)散導(dǎo)致色譜峰變寬，H()，分離變差; (3) B/u與流速有關(guān)：流速 滯留時間 擴(kuò)散 (0.5ml/min) (4) 擴(kuò)散系數(shù)D，B 值。 液相中，分子擴(kuò)散可忽略,C u 傳質(zhì)項,傳質(zhì)溶質(zhì)分子在兩相間濃度不同，由濃度高的相不斷遷 移至濃度低的相，直到濃度達(dá)到平衡。 根據(jù)傳質(zhì)形式分：固定相傳質(zhì)和移動相傳質(zhì) C =（Cs + Cm） 固定相傳質(zhì)原因：進(jìn)出固定相速度不同（固相，液相） 減小措施：使用薄的固定相層，小顆粒填料 移動相傳質(zhì)：遷移滯留 減小措施 填裝均勻緊密 使用小顆粒填料和表面多孔性填料,3. 速率理論的要點

17、:,(1)柱內(nèi)的峰擴(kuò)展與渦流擴(kuò)散、分子擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力有關(guān)。固液兩相間的分配平衡不能瞬間達(dá)到是造成色譜峰擴(kuò)展、柱效下降的主要原因。,(2) 通過選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗔６取⒁耗ず穸燃傲鲃酉嗔魉倏商岣咧А?(3) 為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。闡明了流速和填料對柱效及分離的影響。 (4) 各種因素相互制約：流速增大，分子擴(kuò)散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使柱效下降； 選擇最佳條件，才能使柱效達(dá)到最高。,4.獲得高柱效的幾種方法：,選用細(xì)的顆粒填料 流動相流速低 流動相粘度小 升高溫度 溶質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)與其結(jié)構(gòu)有關(guān) 大分子，擴(kuò)散系數(shù)小 小分子，擴(kuò)散系數(shù)大,5. 影響分離的

18、因素與提高柱效的途徑 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項B/u較小，可忽略不計，即 H = A + C u,降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 氣相和液相區(qū)別,分離度,色譜分離目的：合理的時間內(nèi)將樣品中組分成功 分離 分離度：表示分離狀況的一種度量 分離度影響因素： 保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素； 峰的寬度色譜過程的動力學(xué)因素。,討論：,色譜分離中的四種情況：, 柱效較高，K(分配系數(shù))較大，完全分離。 K 不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。 柱效較低，K 較大，但分離的不好。 K 小，柱效低，分離效果更差。,,一分離度的表達(dá)式：,R

19、=0.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%； R=1：分離程度98%(達(dá)到定性定量分析的最低要求) R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰達(dá)到基線分離）。,對濃度不同組分而言：,兩個組分的分離度會隨濃度比的增大而 減小 例： 對多組分而言： 整個色譜分離的分離度取決于Rs最小值的兩個峰。,二分離度影響因素 峰的寬度（峰寬越小， Rs越大） 峰的寬窄主要反映了色譜分離的動力學(xué)特性 兩峰的保留時間之差（tR越大， Rs越大） 反映了色譜分離的熱力學(xué)特性 分離度基本 關(guān)系式：,四控制分離度方法,改變k 調(diào)節(jié)溶劑強(qiáng)度可以改變k 增大---使用較弱溶劑 降低---使用較強(qiáng)溶劑 正相色譜---固定相極性大于移動相

20、 （溶劑極性大溶劑強(qiáng)度大洗脫能力強(qiáng)?。?反相色譜---固定相極性小于移動相 （溶劑極性大溶劑強(qiáng)度小洗脫能力弱大） 例： P307311,更換色譜柱（改變N）,措施： a.選擇長柱子(N=L/H) b.填料顆粒盡量小 c.低流速(溶質(zhì)傳質(zhì)阻力小，峰擴(kuò)展小) d.低的溶劑粘度(提高柱效) e.提高柱溫,改變選擇性系數(shù),,（ =1， 不能實現(xiàn)分離),下列途徑改善： a.流動相(梯度洗脫) P279 （適用于極性范圍寬的樣品） b.固定相(換柱，改變填料） c.溫度（改變熱力學(xué)參數(shù)）,五. 分離度控制的一般原則:,開始k值很小，若要增大Rs，則首先應(yīng)將k調(diào)整至1 k 10范圍，這樣

21、，不用改變其他條件，就可使Rs增大。 開始k已在1 k 10范圍，但Rs不大，則必須增大N來改善Rs。 k，N的改變都不能增大Rs時，再設(shè)法改變,作業(yè)：,思考題： 7，1017,第二章 儀器裝置 四大部件： 高壓輸液泵 進(jìn)樣器 高效分離柱 檢測器,21 高壓輸液泵 作用：向色譜柱輸送一個連續(xù)、恒定的移動相。 一、對泵系統(tǒng)的要求 1.使用方便（易調(diào)節(jié)流量、過壓保護(hù)等） 2.更換洗脫液容易、死體積小 3.有最大工作壓力(20MPa，130MPa) 4.一定流量范圍（直徑小，流量??；速度快，流量大。）（0.110ml/min) 5.流量穩(wěn)定性好(流量噪聲、流量波動、流量漂 移） 6.流量

22、精度高,機(jī)械往復(fù)式柱塞泵的工作原理：,特點：,能連續(xù)供給恒定體積的移動相，不受整個色譜系統(tǒng)中其余部分稍有變化的影響。 死體積較小，約0.1ml，更換溶劑方便，適用于梯度洗脫。 缺點： 輸出有脈沖波動 二個因素：脫氣不完全 泵的周期性吸液 影響檢測靈敏度。（對紫外檢測器影響不大）,梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,泵系統(tǒng)發(fā)展趨勢,高效：填料顆粒分離效率 柱壓降泵的工作壓力 分析時間短：更快流速柱壓降 (超快

23、速分析） 減少洗脫液用量(4.6mm1mm) 液相色譜的多元洗脫系統(tǒng) P277280,22 色譜柱,組成：精密管徑的不銹鋼管、填料、柱接頭 要求：柱管內(nèi)壁非常光滑 柱接頭設(shè)計要保證系統(tǒng)中引入最小 死體積（柱前、柱后） 能密封高壓液體 兩端加過濾片,柱體為直形不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。,柱效的影響因素,填料的顆粒度及其均勻性 柱長、填裝的方法與技巧 常用：內(nèi)徑25mm（4.6mm) 柱效一定時，柱長與顆粒度成正比 例如：顆粒度510um、柱長1530cm 顆粒度35um、 柱長7.515cm P282283,23 進(jìn)樣裝置,六

24、通進(jìn)樣閥 P280281 結(jié)構(gòu)如圖：,2-4 檢測系統(tǒng) 功能：連續(xù)地將色譜柱中流出的組分隨時間 變化的情況，轉(zhuǎn)變成大小不同的電信 號輸入到記錄儀中，得到色譜圖。 按檢測方式不同，分為： 總體性質(zhì)檢測器（通用型） 示差折射檢測器 溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型） 紫外檢測器、熒光檢測器、電導(dǎo)檢測器,檢測器的性能指標(biāo) 一個理想檢測器，必須具備下列條件： 靈敏度高 不受溫度及流動相流速變化的影響 響應(yīng)隨組分量的變化而線性地變化 穩(wěn)定性好，操作方便,衡量指標(biāo)： 靈敏度 S=R/Q 噪音在沒有樣品情況下，檢測器輸出的最大 振幅（溫度、流量、泵） 漂移檢測器在一段時間內(nèi)，基線隨時間的增

25、 加而產(chǎn)生的偏離（電壓、流動相） 最小檢測限樣品產(chǎn)生兩倍于噪音信號時的濃度 （檢測下限） 線性范圍檢測信號呈線性變化時，最大和最 小進(jìn)樣量之比,檢測器,紫外檢測器 （光電二極管陣列檢測器） 示差折光檢測器 熒光檢測器 電導(dǎo)檢測器,a. 紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點：,靈敏度高； 線性范圍寬； 流通池可做得很小(1mm 10mm ，容積 8L)； 對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作 (波長范圍，常用波長） 200400nm 254nm、280nm 可用于梯度洗脫。,b. 光電二極管陣列檢測器,紫外檢測器的重要進(jìn)展；

26、 光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖。,光電二極管陣列檢測器,三維：光譜-色譜圖,,檢測原理 比爾定律： A=c L 紫外檢測器優(yōu)點： 靈敏度高（1010g/ml) 對梯度洗脫是一種理想檢測器 局限性： 不能檢測對紫外光沒有吸收的樣品 不能使用對紫外光有吸收的溶劑 P289293,第三章 液固色譜和鍵合相色譜,31 液固吸附色譜 一、原理: 固定相是極性吸附劑，不同組份官能團(tuán)具有不同極性，因而對固定相的吸附能力不同。 極性越大，吸附能力越強(qiáng)；極性越低，吸附能力越弱而導(dǎo)致分離。,存在競爭吸附：吸附解吸平衡 溶質(zhì)、流動相分子之間 溶質(zhì)中

27、不同官能團(tuán)之間 競爭的結(jié)果，導(dǎo)致了分離。 溶質(zhì)在柱內(nèi)受到兩種力作用： 固定相的吸附力 流動相的溶解力 當(dāng)吸附力溶解力 k大 吸附力溶解力 k小,二分離對象：,官能團(tuán)有差別的不同類型化合物 （烷基類吸附弱，不能分離） 幾何異構(gòu)體 (固定相表面是剛性結(jié)構(gòu) 溶質(zhì)分子官能團(tuán)與吸附中心的相互作用隨分子的幾何形狀而改變）,三填料的類型及其選擇,按形狀分： a. 球形 b. 無定形 按多孔程度分： a. 多孔型 b. 薄殼型 按極性分： a. 極性（硅膠、Al2O3 、MgO、分子篩） b.非極性（活性碳）,四、硅膠的活性控制及標(biāo)準(zhǔn)化,硅膠的特點： 活性控制意義： 標(biāo)準(zhǔn)化方法： 市售未處理硅膠加

28、熱46小時，活化去水，再加進(jìn)定量水分，使吸附劑含水量保持恒定。 （100m2表面積含水0.020.03g為佳）,吸附強(qiáng)度分類,根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)類型，可將它們 在硅膠上 的吸附強(qiáng)度排序：P315 歸納： 官能團(tuán)不同極性不同吸附強(qiáng)度不同 幾何異構(gòu)體空間位置不同吸附強(qiáng)度不同 P314-316 P331-333,分子空間效應(yīng)。 與官能團(tuán)相鄰的大烷基可能降低保留能力；（位阻效應(yīng)） 順式化合物的保留能力可能比反式化合物強(qiáng)； 對位化合物的保留能力可能比鄰位化合物強(qiáng)。,五樣品分子結(jié)構(gòu)對保留的影響,對吸附色譜來說, 主要取決于樣品分子所含的官能團(tuán)的類型及其數(shù)目。 常見官能團(tuán)的吸附強(qiáng)度： 不吸附：烷烴 弱吸附：烯烴

29、、硫醇、硫醚、單環(huán)或雙環(huán)芳 烴、鹵代芳烴 中等吸附：多環(huán)芳烴、醚、腈、硝基物、大多 數(shù)羰基化合物 強(qiáng)吸附：醇、酚、胺、酰胺、亞楓、酸和多 官能團(tuán)化合物,六、 液相色譜的流動相,1. 流動相實用要求 （1）溶劑的純度和化學(xué)特性必須滿足 色譜過程的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求。,（2）避免使用與固定相發(fā)生不可逆反應(yīng)溶劑。 （使用AI2O3-避免酸、使用硅膠避免堿）,（3）溶劑應(yīng)不干擾使用檢測器的正常工作，與檢測器相匹 配。 使用的溶劑應(yīng)當(dāng)易于除去，不干擾對分離組分的回收。,2. 流動相分類,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：一般淋洗和梯度

30、淋洗。 常用溶劑： 正相:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、 正戊烷 正庚烷 反相: 甲醇、乙腈、水溶液。,LSC 流動相的選擇,在吸附色譜中, 對溶質(zhì)保留值和分離選擇性起主導(dǎo)作用的是溶質(zhì)與固定相的作用, 流動相主要是調(diào)節(jié)溶質(zhì)的保留值在適當(dāng)范圍內(nèi)。 溶劑強(qiáng)度洗脫能力 k 液固吸附色譜的流動相值要適當(dāng)， 常用正己烷、正庚烷, 添加少量CH2Cl2、CHCl3、CH3CN和CH3OH。 (混合后的溶劑強(qiáng)度在兩種純?nèi)軇┲g）,液固色譜的應(yīng)用特點： 對具有不同極性取代基的化合物表現(xiàn)出較高的選 擇性，但對同系物的分離能力較差 對強(qiáng)極性或離子型樣品，因有時會發(fā)生不可逆 吸附，液固色譜常不能獲得滿意的分離結(jié)果

31、。 吸附劑的含水量對吸附劑活性、樣品容量和保 留值有較大影響 液固吸附色譜主要應(yīng)用于: 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體的分離。,,思考：在液固色譜中，以硅膠為固定相，對以下四 組分進(jìn)行分離，流出色譜柱的順序可能是： a.鄰苯二胺 b對苯二胺 c間苯二胺 a. 苯酚 b. 對羥基苯胺 c. 苯胺 d. 苯,1 2,作業(yè),思考題： 19、20、2225、2729、3144,3-2 反相鍵合相色譜,,鍵合相色譜是目前HPLC中最常見的分離模式, 約80%的HPLC是采用反相鍵合相色譜。 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,反相鍵合相色譜 定義固定相通過某種化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分 子以共價鍵結(jié)合在色

32、譜擔(dān)體的表面， 這種色譜類型稱之。 制備硅膠基質(zhì)化學(xué)鍵合固定相注意點： 鍵合反應(yīng)前，將硅膠表面硅氧烷全部水 解為硅烷醇。 除去硅膠表面吸附水，使表面完全呈自 由硅醇基。,形成化學(xué)鍵合固定相 具備條件： 所用基質(zhì)材料 應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性 有能與基質(zhì)表面發(fā)生 化學(xué)反應(yīng)的官能團(tuán),化學(xué)鍵合固定相 (P303),a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣 c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,化學(xué)鍵合固定相的特點：,（1）傳質(zhì)快: 表面無深凹陷。 （2）壽命長: 化學(xué)鍵合，耐流動相沖擊； 穩(wěn)定。

33、（3）選擇性好: 可鍵合不同官能團(tuán)，提高選 擇性 （4）有利于梯度洗脫。 由于產(chǎn)生弱極性固定相，因而擴(kuò)展了反相色譜分離技術(shù)的應(yīng)用。反相色譜正相色譜,存在著雙重分離機(jī)制：,由鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主。 常用反相鍵合固定相： C18、C8 P300P302,反相色譜保留機(jī)理,兩種觀點: 疏溶劑理論 （溶質(zhì)與極性溶劑疏遠(yuǎn)） 雙保留機(jī)理 （殘留羥基）,影響溶質(zhì)保留的因素 流動相 組分的保留隨流動相極性的減少而減少, ln k H2O % , 有機(jī)溶劑% 增大, 極性下降, k值隨之下降。,思考：在ODS柱上，用70%甲醇/水或60%甲醇/水洗脫苯系物，

34、哪一種流動相使苯系物的保留值大，為什么？, 鍵合固定相： a.烷基覆蓋量增加，k值隨之增大。 b.烷基鏈長增加, k值隨之增大。 思考： 同樣是70%甲醇流動相，苯在C18比C8柱上的保留值大，為什么？, 溶質(zhì) 非離子化合物：極性大, k值小 非極性化合物：分子表面積大, k值大 同系物：鏈長增大, k值增大 苯系物：環(huán)數(shù)增大, k值增大; 若化合物的非極性部分相同, 極性官能團(tuán)增 加, 則k值下降 幾何異構(gòu)體：能形成內(nèi)氫鍵的異構(gòu)體的化合 物 k值大。,,反相色譜中流動相選擇,水有機(jī)改善劑 常用：甲醇、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán) 極性：有機(jī)改善劑水 洗脫能力：有機(jī)改善劑水 極性順序：甲

35、醇乙腈二氧六環(huán)四氫呋喃 洗脫能力：水甲醇乙腈二氧六環(huán)四氫 呋喃,反相鍵合相色譜的優(yōu)點：,流動相可選用水溶性 樣品的溶解度范圍提高 流動相可變性大 柱重現(xiàn)性好 固定相表面化學(xué)能低 平衡容易 梯度洗脫 固定相選擇多 固定相耐溶劑沖洗 熱穩(wěn)定性好,缺點：,流動相PH范圍要控制（PH28） pH太低：Si-C鍵易斷裂 pH太高：硅膠基質(zhì)易溶解 游離的硅羥殘基影響分離（封尾） P328-331,思考 烷基苯同系物分離分析 多環(huán)芳烴分離分析,出峰順序？ 如何選擇色譜條件？ 如何優(yōu)化分離？,第四章、離子交換色譜，離子對色譜,離子交換色譜： 適用于離子型物質(zhì)的分離和分析,,,4-1 離子交換色譜

36、 一.原理：用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相，樣品中各離子依據(jù)它們與離子交換劑的交換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。,原理：流動相(溶質(zhì)離子)+離子交換劑(反離子), 平衡時，平衡常數(shù)為,控制k可以改變流動相的離子強(qiáng)度注：只有當(dāng)溶質(zhì)呈離子狀態(tài)時，才能在離子 交換柱上有保留(流動相p和溶質(zhì)都是很重要的參數(shù)),二、離子交換劑 陽離子交換劑帶負(fù)電荷官能團(tuán) -SO3-(磺酸型）、 -COO-(羧酸型） 陰離子交換劑帶正電荷官能團(tuán) NH3（氨基型）、NR3（季胺型）,常見：硅膠為基體的鍵合相離子交換劑 例,pH對交換容量的影響：,強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性離子交換劑，交換性能不受

37、pH影響，交換容量恒定。 弱酸性陽離子交換劑，在較高pH條件下 弱堿性陰離子交換劑，在較低pH條件下 發(fā)生離子交換 pH與交換容量關(guān)系圖,三、離子交換色譜的影響因素,流動相PH的影響 例：弱酸 ：HAH++A- PHA- 交換能力tR PHA- 交換能力tR 弱堿：-NH2+H+-NH3+ PHNH3+ 交換能力tR PHNH3+ 交換能力tR 對分離不同PKa的酸堿是個有利因素 例,流動相中反離子的 形式和濃度 交換平衡常數(shù)KB/A： 反映了溶質(zhì)和交換劑的親和力大小 親合力影響因素： a.電荷數(shù)親合力 b.離子的水合體積親合力 c. 離子極化率親合力,對磺酸型陽離子交換樹脂，

38、一價陽離子的洗脫強(qiáng)度順序： Cs+Rb+ K+NH4+ Na+H+ Li+ 二價陽離子的洗脫強(qiáng)度順序： Ba2+Pb2+ Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+ 對季胺型陰離子交換樹脂，陰離子的洗脫強(qiáng)度順序： ClO4- I- HSO4- SCN- NO3- Br- NO2- CN- Cl- BrO3- OH- HCO3- H2PO4- IO3- CH3COO- F- 注：調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度常用Na2SO4、NaNO3, 不采用NaCI 增加離子強(qiáng)度類似于增加洗脫強(qiáng)度,三者相互作用力關(guān)系： .溶質(zhì)對R+的親合力交換能力 tR .流動相離子對R+親合力 洗脫能力 tR 有機(jī)溶劑影響 有機(jī)溶劑溶劑

39、強(qiáng)度 洗脫能力 k P335337,作業(yè)：,思考題： 21、4651、59、60,四.離子抑制法,定義在反相色譜中，通過調(diào)節(jié)流動相pH 值，抑制組分解離，增加其在固定相上 的保留，以達(dá)到分離的目的。,分離對象：弱酸、弱堿性物質(zhì) k影響因素：與流動相pH值有關(guān) 弱酸 HA: pHHA 疏水締合tRk pHHA 疏水締合tRk 弱堿A: pHHA+ tR k pHHA+ tR k pH- k關(guān)系曲線圖 但對強(qiáng)酸，強(qiáng)堿不適合。為什么？,4-2 離子對色譜 P333335,定義-將一種與溶質(zhì)離子電荷相反的離子(反離子)，加 到流動相中與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對，能 夠在兩相之

40、間進(jìn)行分配。 反相離子對色譜： 非極性的疏水固定相(C18柱)，含有反離子Y+的甲醇-水或 乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對X-Y+。 X+水相 + Y-水相 = X+Y-有機(jī)相,基本原理：,X+水相 + Y-水相 = X+ Y-有機(jī)相 形成的離子對化合物X+Y-，在兩相間進(jìn)行分配 平衡常數(shù)：,溶質(zhì)的容量因子k為：,容量因子隨KXY和Y-水相的增大而延長，而KXY取決于反離子和固定相的性質(zhì)，則控制流動相中加入的反離子特性和濃度可以調(diào)節(jié)組分保留時間，達(dá)到提高色譜分離選擇性的目的。,常見：固定相：化學(xué)鍵合相 流動相：緩沖溶液（含反離子) 有機(jī)改善劑

41、 離子對試劑:,陰離子分離：常用烷基銨類（十六烷 基三甲胺、四丁基胺） 陽離子分離：常用烷基磺酸鹽(己烷磺 酸鈉、高氯酸鹽)。,四、影響反相離子對色譜分離選擇性因素,1.溶劑極性的影響 極性有機(jī)溶劑比例洗脫強(qiáng)度k 2.離子強(qiáng)度的影響 水溶液中離子強(qiáng)度 洗脫能力 k 3.PH值的影響 弱酸：PH值接近7組分完全電離最易形成 離子對k最大 PHX-HX 固定相中離子對減少k 一般：PH=27.4 PH8 硅膠溶解,,4.離子對試劑性質(zhì)和濃度的影響 離子對試劑烷基鏈?zhǔn)杷跃喓衔?k 無機(jī)鹽離子對試劑疏水性減少締合物k 離子對試劑濃度：10-410-2mol/L 5.溫度的影

42、響 流動相粘度大, 溫度柱效,思考: 1.反相離子對色譜中，那些因素影響組分的保留？如何影響？ 2.離子交換色譜中，溶質(zhì)、固定相、流動相三者間具有怎樣的關(guān)系？它們是如何影響組分的保留的？,第五章: 體積排阻色譜法 (凝膠色譜法),根據(jù)化合物分子大小和形狀差別進(jìn)行分離的方法 分離對象: 高分子化合物、生物大分子樣 品、蛋白質(zhì)樣品。 固定相：凝膠(具有一定大小孔徑分布),原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快； 凝膠色譜的校正曲線 MV關(guān)系曲線 (分子量越小，滲透越深，洗脫體積越大）,凝膠色

43、譜特點：,a.樣品峰全部在溶劑的保留時間前洗脫 b.柱內(nèi)的峰擴(kuò)展較小 c.峰較窄，有利于檢測 d.采用示差檢測器 不足：a.峰容量小 b.不能分離大小相似、分子量接近 的組分,固定相,（1）半剛性凝膠 高交聯(lián)度的聚苯乙烯，孔徑范圍較寬。常以有機(jī)溶劑作流動相。 孔徑10nm 分子量103 孔徑10200nm 分子量50107 （2）剛性凝膠 多孔硅膠，它既可用水溶性溶劑，又可用有機(jī)溶劑作流動相，可在較高壓強(qiáng)和較高流速下操作，但易拖尾。,凝膠的選擇:,滲透極限可以分離的最高分子量 （與孔徑有關(guān): 孔徑大，滲透極限大） 分離范圍校正曲線的線性部分 不同凝膠有不同的滲透極限和分離范圍,移動

44、相選擇 P321326, 339 341,a.能溶解樣品 b.不應(yīng)造成填料太大的溶脹或收縮 c.控制PH和離子強(qiáng)度，可消除非排除機(jī)理的影響 （離子強(qiáng)度0.050.1 常用磷酸鹽或硫酸鹽 PH接近中性為宜） d.盡量降低溶劑粘度（加電介質(zhì)） e.選擇與樣品折射率差別大的溶劑，提高靈敏度 樣品濃度：0.010.5% 常用：甲苯、苯、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、四氫呋 喃、水溶液,色譜分離方法的選擇,要正確地選擇色譜分離方法，必須做到 了解樣品的有關(guān)性質(zhì). 熟悉各種色譜方法的主要特點及其應(yīng)用范圍。 選擇色譜分離方法的主要依據(jù)： 樣品的分子量的大小， 在水中和有機(jī)溶劑中的溶解度，極

45、性和穩(wěn)定程 度 化學(xué)結(jié)構(gòu)等物理、化學(xué)性質(zhì)。,一、分子量 對于分子量較低（一般在200以下），揮發(fā)性比較好，加熱又不易分解的樣品，可以選擇氣相色譜法進(jìn)行分析。 分子量在2002000的化合物，可用液固吸附、鍵合相色譜和離子交換色譜法。 分子量高于2000，則可用排阻色譜法。,二、溶解度 水溶性樣品最好用離子交換色譜法和離子對色譜法； 微溶于水，但在酸或堿存在下能很好電離的化合物，也可用離子交換色譜法； 油溶性樣品或相對非極性的混合物，可用液-固色譜法。,三、化學(xué)結(jié)構(gòu) 若樣品中包含離子型或可離子化的化合物，可首先考慮用離子交換色譜。 異構(gòu)體的分離可用液固色譜法； 同系物可用反相鍵合相

46、色譜法； 對于高分子聚合物，可用體積排阻色譜法,小結(jié):,a.已知結(jié)構(gòu)試樣查閱文獻(xiàn)資料以其他色譜分離技術(shù)作參考 b.分子量較大（M2000）蛋白質(zhì)、高聚物凝膠色譜法 c.分子量較?。?M2000）試樣多種溶劑中溶解度情況決定分離類型、填料、流動相 由于試樣組分的復(fù)雜性，還需對試樣的來源、性質(zhì)等作詳細(xì)了解，以作選擇參考。,分離類型選擇,,應(yīng)用 目前已普及于幾乎所有重要的分析學(xué)科領(lǐng)域和許多科研生產(chǎn)部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的大分子和離子型物質(zhì)，各種高分子化合物和不穩(wěn)定化合物。,例如：蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農(nóng)藥、甾族化合

47、物、多環(huán)芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。,,農(nóng)藥的分析,作業(yè):,思考題: 54，55，56，57，58,第六章、實驗技術(shù)和輔助實驗技術(shù),61 定性和定量分析 一、定性分析 利用保留值定性 a.與標(biāo)準(zhǔn)物對照 b.將標(biāo)準(zhǔn)物加入樣品中 c.二極管陣列檢測器 聯(lián)機(jī)定性 收集洗脫液后定性分析,二、定量分析,標(biāo)準(zhǔn)曲線法（外標(biāo)法） 是一種簡便、快速的絕對定量方法。 步驟： 用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。 特點： 適用于大量分析色譜條件完全相同,歸一化法（所有組分都出峰,并在

48、檢測器上都 有信號） 內(nèi)標(biāo)法（選取合適內(nèi)標(biāo)物.準(zhǔn)確度,精密度較 好） 標(biāo)準(zhǔn)加入法（加入標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用加入 前后峰面積變化計算）,三、影響定量分析結(jié)果準(zhǔn)確度因素,樣品制備 a. 樣品溶劑與洗脫液互溶性好 b. 將干擾組分盡可能分離 c.含量低時必須富集 回收率試驗：標(biāo)準(zhǔn)物加入到已知含量被測樣 品中用制備樣品同樣方法處理定量 測定，得回收率。 回收率（測定值樣品值）/加入量 目的：檢驗被測組分在制備中是否100%定量 轉(zhuǎn)化,儲存條件：低溫、干燥、避光 樣品制備方法：a.溶解（超聲波、離心） b.濃縮 c. 萃取 d.預(yù)分離 e.衍生化 進(jìn)樣技術(shù) 影響因素：a.進(jìn)

49、樣裝置的準(zhǔn)確度和精度 b.分析人員對進(jìn)樣技術(shù)的熟練程度 進(jìn)樣六通進(jìn)樣閥（定量進(jìn)樣管34倍）,檢測器特性 穩(wěn)定性和線性范圍直接影響定量準(zhǔn)確性 a.被測組分濃度和響應(yīng)值呈線性關(guān)系 b.進(jìn)樣量不能超出線性范圍 注：定量分析不宜采用梯度洗脫（基 線易漂移）,62 HPLC實驗技術(shù),一、色譜柱的保養(yǎng) 新柱要作凈化處理 平時使用： a.正式進(jìn)樣前，先用流動相沖平衡 b.一種流動相換另一種時，需互溶 柱的儲存： 儲存于相對惰性溶劑中（反相柱用甲醇） 對復(fù)雜樣品或易污染樣品，應(yīng)裝預(yù)柱 實驗結(jié)束時，當(dāng)洗脫液用緩沖液，應(yīng)先水沖柱甲醇保護(hù),二、流動相的處理,流動相的脫氣 原因：a.高柱壓下流動相中空氣，會在

50、柱 的洗脫 液流中形成氣泡，干擾檢測器信號。 b.除去氧（氧易與固定相、流動相反應(yīng)， 不利于柱 穩(wěn)定） 脫氣方法：a.真空脫氣法 b.惰性氣體吹脫法 c.超聲波脫氣法,,流動相的純化 a.將溶劑通過干燥的多孔硅膠漏斗（0.45) b.在進(jìn)樣器之前設(shè)置預(yù)柱，將雜質(zhì)吸附掉 流動相配制 a.先配制再脫氣，或先脫氣再配制 b.對含量少的溶劑必須用移液管精確量取 c.如用緩沖液，濃度應(yīng)盡量低些 （0.0010.01mol/L）,三、樣品的預(yù)處理,目的：除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 微量組分濃縮 改善分離效果 儀器和色譜柱得到保護(hù) 對樣品預(yù)處理，達(dá)到以下要求：

51、 樣品全部轉(zhuǎn)化為溶液 溶液濃度低 溶劑洗脫強(qiáng)度低于流動相，與流動相相溶,預(yù)處理常用方法,萃取法 水溶液試樣被分析物質(zhì)用有機(jī)溶劑萃取 常用：CHCl3、CH2Cl2、正己烷、二乙醚、 苯、乙酸乙酯 脂溶性非離子型化合物雜質(zhì)形成鹽萃取到 水相 吸附法:a.薄層吸附： 吸附劑硅膠、氧化鋁 b.預(yù)柱吸附：(被分析物吸附到柱上） 膜過濾法：去除蛋白質(zhì) 衍生化法：,63 HPLC輔助實驗技術(shù),一、化學(xué)衍生化技術(shù) 柱前衍生化被測組分通過衍生化反應(yīng)，生成衍生化產(chǎn)物，然后通過色譜柱進(jìn)行分離、測定。 優(yōu)點：不受反應(yīng)條件限制、允許較長反應(yīng)時 間、試劑過量易除去 缺點：反應(yīng)后易產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物，給分

52、 離帶來困難,,柱后衍生化樣品先通過色譜柱流出的組分分別與衍生化試劑反應(yīng)，衍生化產(chǎn)物進(jìn)入檢測器 優(yōu)點：可自動連續(xù)進(jìn)行、操作簡便，不會 因衍生化反應(yīng)給色譜分離帶來困難 缺點：儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜、要求反應(yīng)時間短， 重現(xiàn)性好、柱后死體積大 無論柱前、柱后，都要求： a.反應(yīng)定量進(jìn)行 b.副反應(yīng)和過量試劑不影響檢測,二、柱切換技術(shù),應(yīng)用范圍：分離分析極性范圍很寬的多組 分樣品，可用梯度洗脫代替。 該技術(shù): 樣品富集、純化、制備、切割 柱切換閥要求： a.能承受無數(shù)次切換循環(huán) b.死體積小 c.閥材料無吸附性、耐腐蝕,三、制備色譜,分析色譜在樣品分離基礎(chǔ)上， 作定性、定量分析 （進(jìn)樣量?。?制備色譜在分離基礎(chǔ)上，獲得 純物質(zhì)（進(jìn)樣量大）,液相制備色譜儀,遇到的典型問題,獲得最大制備量的途徑,微量和痕量組分的分離制備,再循環(huán)技術(shù)將含有重疊峰的組分洗脫液從檢測器出口泵色譜柱，進(jìn)行第二、三次分離，能得到良好分離效果對儀器要求：制備數(shù)mg以下分析色譜儀，3mg為最大進(jìn)樣量制備數(shù)十mg制備型色譜儀，內(nèi)徑：23.4mm、流量10ml/min樣品濃度：a.制備色譜：0.110% b.分析色譜：0.050.5,