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1、植物育種學(xué),第12章----生物技術(shù)在植物育種中的應(yīng)用,第二節(jié)---植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交,制作人：2010級(jí)種子二班 宋子超 20102792 2012.11.11,植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞去壁后，在無菌條件下，使其進(jìn)一步生長發(fā)育的技術(shù)。 體細(xì)胞雜交是在離體條件下將同一物種或不同物種的原生質(zhì)體融合，培養(yǎng)并獲得雜種細(xì)胞的再生植株。 自1971年煙草葉片分離原生質(zhì)體并培養(yǎng)獲得再生植株以來，已有280余種植物原生質(zhì)體再生植株問世。 原生質(zhì)體融合克服了植物種屬間生殖障礙，為新

2、種質(zhì)的創(chuàng)造提供了一條有效途徑 過程： 1、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng) 2、原生質(zhì)體融合 3、雜種細(xì)胞的選擇 4、雜種細(xì)胞的鑒定,一、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng) （一）原生質(zhì)體的分離 1、制備原生質(zhì)的材料： 分為 、自然條件下生長的植株：可以從植株各個(gè)組織器官分離原生質(zhì)體，常用的是葉肉細(xì)胞（來源方便、供應(yīng)及時(shí)、有明顯的葉綠體便于在融合中識(shí)別） 、無菌幼苗：無菌幼苗的子葉、下胚軸和根均可分離。優(yōu)點(diǎn)：無需經(jīng)表面滅菌處理，避免殺菌劑對(duì)材料的傷害，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易重復(fù)。缺點(diǎn)：培養(yǎng)室光照不夠，苗弱制備原生質(zhì)體的產(chǎn)量比較低，質(zhì)膜較易破。 、外植體來源的愈傷組織、體細(xì)胞胚及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞： 優(yōu)點(diǎn)： 這種材料

3、可避免環(huán)境條件的不良影響，可常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理時(shí)操作方便。缺點(diǎn)：染色體不穩(wěn)定，長期培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物是整倍體與非整倍體的混合物，使植株再生率降低。,2、材料的預(yù)處理 目的是為了提高原生質(zhì)體的 產(chǎn)量和代謝活力；逐步降低植物細(xì)胞水勢(shì)，增強(qiáng)原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)及高滲透壓的適應(yīng)；使游離的原生質(zhì)體更能適應(yīng)新的培養(yǎng)條件。 處理方法： ：預(yù)培養(yǎng)法：材料先在一定配方培養(yǎng)基上培養(yǎng)然后再分離原生質(zhì)體 ：暗處理法：材料暗處培養(yǎng)一定時(shí)間再分離原生質(zhì)體 ：藥物及添加劑處理法：材料在添加劑或藥物處理后，再進(jìn)行原生質(zhì)體的分離 ：萎蔫處理法：離體葉片置日光或燈光下照射23小時(shí)，葉片稍萎調(diào)，易于撕去下表皮，有利于

4、酶降解葉肉細(xì)胞壁 ：更新培養(yǎng)基法,3、原生質(zhì)體的分離 植物原生質(zhì)體分離有機(jī)械分離和酶分離法，目前一般采用酶法分離，酶法分離是指在酶的作用下分解細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體，優(yōu)點(diǎn)是快速大量。 酶法分離注意事項(xiàng)： 、酶的種類和用量：根據(jù)植物材料不同以及細(xì)胞壁成分不同確定。纖維 素酶、半纖維素酶、果膠酶。 、酶液的滲透勢(shì)：細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓必須平衡否則原生質(zhì)體易破裂。 、酶液的酸堿度：酶液的PH對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有很大的影響。不同植物材料對(duì)酶液的PH要求有別。 、溫度環(huán)境：分離時(shí)間與溫度和不同的材料酶活力植物細(xì)胞特點(diǎn)有關(guān)。 、通氣條件對(duì)原生質(zhì)體的量和質(zhì)也有明顯的影響：通氣良好原生質(zhì)體量多健康，否則產(chǎn)量低健

5、康的少。,4、原生質(zhì)體的純化 酶分解后的植物組織是由未消化的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)、破碎細(xì)胞及原生質(zhì)體等組成的混合物，需提純。 方法有： ：過濾-離心法：簡單易收集大量原生質(zhì)體，常用。 ：漂浮法：根據(jù)原生質(zhì)體、細(xì)胞或細(xì)胞碎片的相對(duì)密度不同而設(shè)計(jì)的。 5、原生質(zhì)體的活力測(cè)定 原生質(zhì)體的活力測(cè)定，原生質(zhì)體的活力測(cè)定決定以后的培養(yǎng)成功。 形態(tài)識(shí)別：完整飽滿的細(xì)胞質(zhì)、顏色鮮艷、正常膨大。有活力！,（二）、原生質(zhì)體培養(yǎng) 1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：不同植物的原生質(zhì)體對(duì)營養(yǎng)需求不同。KM培養(yǎng)基、V-KM培養(yǎng)基 除培養(yǎng)基外還注意： （1）、植物激素：生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度，2,4-D。 （2）、原生質(zhì)體的密度 （3）、光

6、照和溫度 （4）、氮源種類 2、原生質(zhì)體培養(yǎng)方法：固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法,3、原生質(zhì)體培養(yǎng)過程 培養(yǎng)條件滿足的條件下，原生質(zhì)體首先會(huì)形成新的細(xì)胞壁，繼而進(jìn)行分裂，形成細(xì)胞團(tuán)。在促進(jìn)分化的條件下還能分化出芽、莖、根，再生成完整植株。 （1）、細(xì)胞壁再生 ： 再生壁開始的時(shí)間隨所用的植物材料種類及取材來源而異。 （2）、細(xì)胞分裂：第一次細(xì)胞分裂依賴于壁的形成。 （3）、植株再生 ： 原生質(zhì)體形成小的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，轉(zhuǎn)移到固體分化培養(yǎng)基上后就開始形態(tài)發(fā)生而逐漸長成完整的植株。 原生質(zhì)體來源的細(xì)胞器官發(fā)生也可以通過兩條途徑：一是通過愈傷組織形成不定芽，另一條途徑是由植物原生質(zhì)體再生細(xì)胞在培養(yǎng)中直接誘導(dǎo)類胚體，由類胚體發(fā)育成完整植株。,