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1、,,酶標(biāo)儀的使用,主要內(nèi)容,一、ELISA法介紹 二、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀 三、儀器操作,一、ELISA法介紹,經(jīng)典的化學(xué)分析方法（如滴定分析、重量分析、分光光度法）能對化學(xué)體系組分進(jìn)行常量或微量分析，而對復(fù)雜生物體系的微量成分的測定往往力不從心。 在此背景下，科學(xué)家研發(fā)了一系列測定生物體系成分含量的方法，其中免疫化學(xué)法（如酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、放射免疫法）因具有高特異性、超微量分析生物體有機(jī)成分的特點(diǎn)而得到迅速推廣和發(fā)展。,1971年人們建立了用酶來標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識別出來，并進(jìn)行定量，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，簡稱ELIS

2、A。 （Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay） 酶聯(lián)免疫法的專用儀器就是酶標(biāo)儀。,分析原理,酶標(biāo)儀的分析原理與分光光度法一樣，服從朗伯比爾定律。物質(zhì)的含量與顯色液的顏色深淺成正比，而顏色深淺可用吸光度表示，所以物質(zhì)的含量與吸光度值成正比。 酶標(biāo)記抗原或者抗體發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)后，與底物的結(jié)合物，在特定波長下有最大吸收，可通過測定顯色液的吸光度對待測物進(jìn)行定量。,ELISA法知識,1.免疫學(xué)知識 2.常用的ELISA分析 3.ELISA 應(yīng)用,1.免疫學(xué)知識,什么是抗體？ 什么是抗原？ 什么是抗原抗體反應(yīng)？,什么是抗體(Antibody)？,抗體是機(jī)體受抗原刺激后，在

3、體液中出現(xiàn)的一種能與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的球蛋白，稱免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)。 人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 含有免疫球蛋白的血清稱免疫血清。,免疫球蛋白（Ig）,免疫球蛋白（Ig）是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的，其主要作用是與抗原起免疫反應(yīng)，生成抗原-抗體復(fù)合物?？梢宰钄嗖≡w對機(jī)體的危害，也可以引起過敏反應(yīng)或其他有害反應(yīng)。,,免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),免疫球蛋白都是大分子的物質(zhì)，輕鏈和重鏈， 且具有抗原結(jié)合的部位。,,什么是抗原(Antigen) ？,凡能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并能與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)稱為抗原。物質(zhì)所具有的這種特性稱為抗原性?？?/p>

4、原的物質(zhì)可以是機(jī)體自身的成分如蛋白、酶、多肽或者多糖。也有外來的抗原（如病毒、污染物）。,抗原的特異性,各種抗原物質(zhì)的化學(xué)組成雖然很復(fù)雜，但能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并與抗體反應(yīng)相結(jié)合的化學(xué)組成，僅僅是抗原物質(zhì)表面的一些具有活性的化學(xué)基團(tuán)、化學(xué)結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)型，被稱為抗原物質(zhì)決定簇。 分子結(jié)構(gòu)的差異性，決定各種物質(zhì)抗原的特異性。,抗原抗體反應(yīng),抗原與抗體的反應(yīng)統(tǒng)稱為免疫學(xué)反應(yīng)。在體內(nèi)進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)，在體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)。 沒有抗原的刺激，機(jī)體不能產(chǎn)生抗體；利用抗體可以檢測抗原物質(zhì)。,ELISA法特點(diǎn),ELISA法是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性

5、。 由于測定中需要酶標(biāo)記抗原或抗體，酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。,2.常用的ELISA分析,1).測定抗原 2).測定抗體,(1)測定抗原,A將抗體吸附于固相表面，這個過程叫包被。 B 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物。 C 加酶標(biāo)抗體。 D 加酶反應(yīng)的底物。反應(yīng)終止時，反應(yīng)液的顏色深淺與抗原的含量成正比。,主要步驟,1.包被抗體的酶標(biāo)板（一抗）。 2.加待測抗原?？乖贵w反應(yīng)，洗滌。 3.加酶標(biāo)抗體（二抗）。反應(yīng)，洗滌。 4.加顯色底物（三抗），反應(yīng)，洗滌。 5.加終止液。 6.酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。 7.根據(jù)

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測抗原進(jìn)行定量。,(2)測定抗體,A 抗原包被在酶標(biāo)板。 B 加抗體，形成抗原抗體復(fù)合物。 C 加酶標(biāo)抗體（一抗） D 加酶底物（二抗），顯色，比色。,3.ELISA方法的應(yīng)用,原則上ELISA可用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定體液中的可溶性抗原。 在實(shí)際應(yīng)用中它和醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、環(huán)境學(xué)等方面密切相關(guān)。,舉例,醫(yī)學(xué)方面：腫瘤研究中檢測甲胎蛋白；檢測過敏原；檢測血清中白蛋白及免疫球蛋白；傳染病診斷中檢查乙型肝炎表面抗原。 環(huán)境科學(xué)方面：測定污染物抗原干預(yù)下生長因子、細(xì)胞因子、酶的變化。 其他：植物組織漿液中檢查植物病毒；普通比色分析。,,二、

7、酶標(biāo)儀和多功能酶標(biāo)儀,普通酶標(biāo)儀 多功能酶標(biāo)儀,,1.普通酶標(biāo)儀,即酶聯(lián)免疫檢測儀(ELISA Reader）,Bio-Rad Model 550,4萬元,光源,光電檢測器,,,電信號經(jīng)前置放大、對數(shù)放大、模數(shù)轉(zhuǎn)換等,,,,,,,,,,,濾光片 或單色器,酶標(biāo)儀結(jié)構(gòu)及原理,,光源：鎢燈 濾光片：常用的波長范圍： 405nm 450nm(四甲基聯(lián)苯胺) 490nm(鄰苯二胺) 630nm 單色器：可調(diào)節(jié)波長的光,,,,,,,,比色裝置： 聚苯乙烯塑料微孔板：96孔 光電檢測器,,,,,,,,酶標(biāo)儀與光度計(jì)的區(qū)別,波長：4-6個 比色裝置：酶標(biāo)板，非比色杯 光路：垂直

8、功能：不能波長掃描；只在固定波長的可見光范圍測定；可對化學(xué)物及生命組分進(jìn)行終點(diǎn)分析。,酶標(biāo)儀的應(yīng)用,普通酶標(biāo)儀基本功能有2個： （1）相當(dāng)于分光光度計(jì)：測定化合物含量或者細(xì)胞存活率等。 （2）基于免疫反應(yīng)的ELISA分析。 新型的多功能酶標(biāo)儀價格在20-50萬元，分析功能得到廣泛拓展，這對酶標(biāo)儀的應(yīng)用有深刻的意義。,ELISA的局限性,世界衛(wèi)生組織專家組提出對ELISA的評價認(rèn)為：“ELISA作為免疫診斷應(yīng)用是一個好辦法，但要做好它不容易。” 1.對ELISA法的非特異性評價的資料尚不夠完善，因此，對出現(xiàn)一些非特異性反應(yīng)的時候，往往不易解釋。 2.固相載體的質(zhì)量常不統(tǒng)一，主要是原料及制備工藝還

9、不一致，致使不同批號的固相載體有時本底值較高，有時吸附性能很差，影響試驗(yàn)結(jié)果。 3.試劑不統(tǒng)一，現(xiàn)在處于“八仙過海，各顯神通”，標(biāo)準(zhǔn)還不能統(tǒng)一。,2.多功能酶標(biāo)儀,Thermo公司全波長多功能酶標(biāo)儀,50多萬元,多功能酶標(biāo)儀的特點(diǎn),1.比色杯或者微孔板（6、12、24、48、96和384孔微孔板 ）,測樣量大 ； 2. 200-1000 nm ，有紫外可見光、熒光、偏振光等,波長變化可達(dá)到1nm, 只要是有色溶液即可測定吸光度； 3.可提供終點(diǎn)檢測、動力學(xué)、單孔掃描和光譜掃描等測讀模式 ； 4.分析功能擴(kuò)大。,多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用舉例,DNA/RNA定量和純度檢測 Bradford /Low

10、ry實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞活性/細(xì)胞毒性檢測 MTT分析 （IC50/LD50 ） 細(xì)菌生長分析 鈣流檢測 膜電位檢測 雙熒光素酶報(bào)告基因分析,多功能酶標(biāo)儀的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用,ATP檢測 微生物生長 綠熒光蛋白分析 藥代毒性分析 膜滲透分析 熒光偏振分析,三、酶標(biāo)儀操作,1. 注意事項(xiàng) 2. 酶標(biāo)板 3. 操作要點(diǎn),1.注意事項(xiàng),1）反復(fù)研讀試劑盒說明，熟悉操作步驟。 2）加樣的準(zhǔn)確性。操作中須注意顯色劑和終止的加量準(zhǔn)確，最好使用加樣槍加液以保證比色時吸光度的準(zhǔn)確性。槍頭不要混用。 3）洗滌時間。一般按照說明書要求，起碼洗滌5次，切要把殘液甩干。,,4）觀察和判讀吸光度結(jié)果應(yīng)在15min 內(nèi)完成，否則液體顏色

11、會減退。 5）待測生物樣品要放在4冰浴上。 6）顯色液要現(xiàn)用現(xiàn)配，避光低溫保存 。 7）注意購買抗體的保存。,2.酶標(biāo)板,酶標(biāo)板材料,可溶性抗原或抗體吸附于固相載體而成為不溶形式，這是進(jìn)行酶標(biāo)記測定的基本條件。許多物質(zhì)可作為固相載體，如纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、瓊脂糖珠、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯及聚氯乙烯等等。但在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。由于微量反應(yīng)板所用試劑量少，操作方便，適合于大規(guī)模應(yīng)用。,酶標(biāo)板材料,國產(chǎn)聚苯乙烯微量反應(yīng)板（上海塑料三廠出品）目前已大量應(yīng)用于ELISA測定，并且獲得了滿意的結(jié)果。但每批微量反應(yīng)板對抗原或抗體蛋白質(zhì)的吸附性能是有顯著差別的。實(shí)驗(yàn)證明，

12、吸附效果似乎與塑料的類型及其表面性質(zhì)有關(guān)。特別是塑料制品在加工過程中因工藝不同或受其他因素的影響而造成吸附性能的極大差異，甚至完全喪失吸附能力。,酶標(biāo)板鑒定,對每批制品在使用前，必須經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室鑒定，鑒定的方法和標(biāo)準(zhǔn)是對每批購置的微量反應(yīng)板抽樣，用檢測試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)顯色并終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)比色計(jì)中測定其O.D值。,,一般認(rèn)為全板中每兩孔間O.D值的誤差不超過10%為合格。如果中間孔與四周孔O.D值相差太大，或者反應(yīng)板的這一邊與另一邊凹孔的O.D值相差大，均不合格。此外，還要檢查陽性和陰性參考血清O.D值是否有明顯差別。一般要求有10倍左右的差異為合格。,酶標(biāo)儀單、雙波長檢測,一般的酶標(biāo)儀在測

13、定中均有單波長和雙波長的模式，為什么呢？,,酶標(biāo)儀是垂直光路，受被測樣本液面是否水平、酶標(biāo)板透光性、孔底是否平整等的影響較大。 選擇 630nm為參比波長, 測定其吸光度A0;在測定波長（如490nm/450nm）下測定樣本的吸光度A,雙波長測定后,取二者的差值, 測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差比單波長下測定的要小,實(shí)驗(yàn)誤差小。,,在ELISA測定所使用的底物如鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，顯色終止后，在 630nm處的吸光度值都只有吸收峰處（490nm/450nm）吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長檢測，不會影響檢測靈敏度。 一般酶標(biāo)儀比色應(yīng)該首選雙波長。,酶標(biāo)儀的工作環(huán)境,1.儀器應(yīng)放置在無強(qiáng)磁場和干擾電

14、壓的位置。 2.儀器應(yīng)放置在噪音低于40分貝的環(huán)境下。 3.為延緩光學(xué)部件的老化，應(yīng)避免陽光直射。 4.操作環(huán)境溫度應(yīng)在1540之間，環(huán)境濕度在15%85%之間。 5.操作時電壓應(yīng)保持穩(wěn)定。 6.操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽、煙塵。 7.保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間。,3.Bio-Rad Model 550酶標(biāo)儀操作,1.接通電源，打開酶標(biāo)儀開關(guān)。 2.儀器開始自檢。Self disgonsis in progress 3.按箭頭光標(biāo)到Mode,設(shè)置參數(shù)。當(dāng)儀器出現(xiàn)set analysis mode 時，按enter確定。 4.選擇測定波長的類型。按箭頭光標(biāo)到D/S,按se

15、lect選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Dual/Single，選擇雙波長，按select選中，enter 確定。,,5.選擇濾光波長，此酶標(biāo)儀有四個波長：1：405nm;2:450nm;3:490nm;4:630nm。按箭頭光標(biāo)到Filt,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在Mes=#X Ref=# Y，如按光標(biāo)選擇數(shù)字3，即490nm的測定波長,enter確定。再按Next, 到Ref,按光標(biāo)選擇參考波長，如選數(shù)字4.即為630nm，enter 確定。 6.選擇是否混合。按箭頭光標(biāo)到Mix,按select選中，enter 確定。光標(biāo)出現(xiàn)在yes/No，如光標(biāo)選擇No，按sel

16、ect選中,enter 確定，說明樣品不混合。,,7.返回原顯示，set analysis 的D/S FiltMix,按enter出現(xiàn)set analysis的Mode。說明儀器已經(jīng)到達(dá)測試狀態(tài)。 8.推開測定蓋，將酶標(biāo)板小心正確放到測定槽內(nèi)，合住蓋。 9.上好酶標(biāo)儀專用的光敏打印紙。 10.按Start，開始測量吸光度，并自動打印測定結(jié)果。 11.測定完成后，取出酶標(biāo)板，合上蓋，關(guān)儀器開關(guān)和電源，蓋上防塵罩。,4.Thermo多功能酶標(biāo)儀的操作,1.開機(jī)，點(diǎn)擊 SkanIt RE for Varioskan flash2.4.3,進(jìn)入分析系統(tǒng)； 2. 選擇new session;name;next； 3.選擇酶標(biāo)板，如96孔版；next； 4.選定文件夾；設(shè)定測定方法，如波長； 5.連接儀器connect；放板（in）,save;點(diǎn)擊excute session;開始讀板，Results,保存數(shù)據(jù)；觀察結(jié)果，記錄或保存； 6.取板（out）,斷開連接disconnect,關(guān)機(jī)。,思考題, 普通酶標(biāo)儀測定時為什么選擇雙波長測定？ ELISA法的原理是什么？ 普通酶標(biāo)儀和紫外分光光度計(jì)有什么區(qū)別？,謝謝,