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1、免疫分析技術(shù)之ELISA,廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王 娟,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),細(xì)胞水平,分子水平,基因水平,,,,體外（或體內(nèi)）測(cè)定各類細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和效應(yīng)，從而了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平,測(cè)定各類免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、黏附分子的表達(dá)水平和生物活性，從而了解機(jī)體免疫因子間的相互關(guān)系,測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析,ELISA 概念,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）， 是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)，

2、基礎(chǔ)是：抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。,酶免疫測(cè)定類型,這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱ELISA。,1.1抗原抗體反應(yīng),1.1.1可逆性,抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為： Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=AgAbAgAb ，AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均

3、能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。,1.1.2特異性,抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,,1.1.3敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平 酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml 免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平 例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。,1.2免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用 由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此

4、免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。,基本原理,使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定

5、方法達(dá)到很高的敏感度。,2ELISA的類型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑： （1）固相的抗原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為結(jié)合物（conjugate）； （3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。,2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原,A. 將抗體吸附于固相表面； B. 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物； C. 加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。底物的降解量抗原量。,此法適用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備

6、酶結(jié)合物而建立此法。,2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體,用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,2.3 間接法測(cè)抗體,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。,A. 將抗原吸附于固相載體表面； B. 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。 測(cè)定底物的降解量抗體量,2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，

7、可用此法檢測(cè)特異性抗體。,2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。,2.6 捕獲包被法測(cè)抗體,,,,IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。,2.7 ABS-ELISA法,：固相支持物； ：樣品； ：特異性IgG；

8、：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）； ：DAB顯色液； ：顯色；,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物 （1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）； （2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； （3）酶的底物； （4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品； （5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液； （6）洗滌液； （7）酶反應(yīng)終止液,ELISA的試劑準(zhǔn)備A,固相載體 聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯，聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的

9、吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。,3.1.2 包被的方式,,將抗原或抗體固定的過(guò)程稱為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。,不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕

10、獲包被法。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。 脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。,天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。,3.1.3 包被用抗原,3.1.4 包被用抗體,IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)

11、吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.5 包被的條件,pH 9.6碳酸鹽緩沖液 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液 pH 7-8的Tris-HCL緩沖液 加入包被液后，在4-8冰箱中放置過(guò)夜，37中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6

12、 封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封閉？,ELISA的試劑準(zhǔn)備B,3.2 結(jié)合物,即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性,3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體,制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的Ig

13、G，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,,3.2.2酶,純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 辣根過(guò)氧化物酶HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)

14、合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.,3.2.3 結(jié)合物的制備,結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合

15、物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。,酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。,3.2.4 結(jié)合物的保存,用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐溫20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，

16、使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8保存期可達(dá)6個(gè)月。,3.2.5 結(jié)合物的稀釋,試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物,3.3 酶的底物,3.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm。 ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物

17、(urea peroxide)。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。,4 對(duì)照設(shè)定,陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。 陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較

18、，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。,參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。,陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。,5 標(biāo)本的采取和保存,體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。 以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。 血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性

19、顯色。,加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。,基本操作注意事項(xiàng),保溫 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)。 ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？ 溫育常采用的溫度有43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。,洗滌 洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。 ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)

20、記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。 可以說(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：,（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合

21、是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。,顯色,顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。,比色,拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底

22、物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為A492nm或OD492nm。,酶標(biāo)比色儀,酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)

23、范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。 操作時(shí)室溫宜在15-30，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。,6 結(jié)果判斷,6.1 定性測(cè)定 定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。

24、 在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。,A.陽(yáng)性判定值： （cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。 B.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值,。,間接法和夾心法,（2）競(jìng)爭(zhēng)法,因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值。 a. 陽(yáng)性判定值法 陰性判定值=0.4NCX+0.

25、6PCX 陽(yáng)性 A陽(yáng)性判定值 陰性 A陽(yáng)性判定值 b. 抑制率法 抑制率（%）= （陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）100%/陰性對(duì)照 陽(yáng)性 抑制率50%為 陰性 50%,4.7.2 定量測(cè)定,ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。,4. ELISA的操作要點(diǎn),嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確

26、的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。 嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。,,,免疫分析技術(shù)之 液相芯片技術(shù)及應(yīng)用,廣東省功能蛋白質(zhì)組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王 娟,,,liquichip 液相芯片系統(tǒng)___,液相芯片系統(tǒng)有機(jī)地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、激光技術(shù)、流體學(xué)、最新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了Luminex 100無(wú)與倫比的檢測(cè)特異性和靈敏度。,Benefits,Applications,Future,Technology,Principle,Most bioassays consist of two or mor

27、e biomolecules interacting,Principle,Using LiquiChip-Technology these biological interactions take place on small, microscopical beads these beads are fluorescent (red ),Principle,Detection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagents,Beads 球形基質(zhì),Capture

28、 molecule 探針分子,Analyte 待檢測(cè)物,Reporter molecule 報(bào)告分子,,,,Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Beads,Diameter 5.6 m,Two internal Dyes for Bead Classification,,,Defined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous Solvent,Two-Color Bead-Coding,Based on xMAP technology By using 10

29、different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color signature, is created,為了便于探針分子的固定，在球形基質(zhì)的表面進(jìn)行了一系列的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single we

30、ll,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,反應(yīng)主要包括3個(gè)步驟,探針分子的固定 將這種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與

31、樣品反應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報(bào)告熒光的報(bào)告分子與目的分子特異性的結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量 反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè),LiquiChip Workstation,Flow cytometer-based technology Measures fluorescence Components: Reader Microplate Handler Fluid Module,Flow Cytometer based Analysis,Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers

32、are used for excitation of fluorescence,Principle of Detection,The red laser is used to identify the bead code The green laser is used to identify the reporter signal,利用這100種球形基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同的探針分子，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)。,,A,F,H,E,B,G,C,D,,Benefits,系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)方案，使用者可以自行設(shè)計(jì)分析方案

33、，也可使用成套試劑盒 通量大，可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè) 液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測(cè)物的反應(yīng) 靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進(jìn)行檢測(cè) 操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低,,,,Liquichip和ELISA靈敏度的比較分別用ELISA和liquichip 對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行定量測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線I：使用liquichip測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線II、III：使用ELISA測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,Compared to ELISA:,樣本需求量小: EL ISA 每次實(shí)驗(yàn)均至少需要100200l 外周血，

34、而采用液相芯片只需50l 血液即可在一支試管中完成所有檢測(cè)項(xiàng)目,總體可節(jié)約80 %以上的樣本，這對(duì)外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有意義; 操作流程簡(jiǎn)化:由于EL ISA 工作曲線的置信區(qū)間僅23 對(duì)數(shù)級(jí)，因而對(duì)于較高濃度的細(xì)胞因子的檢測(cè),其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以滿足實(shí)驗(yàn)精確度，而液相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達(dá)45 對(duì)數(shù)級(jí)，活性范圍可10 倍于EL ISA ,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌步驟; 高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率大大高于EL ISA 固相沉底。,Measuring the level of many human or mouse cytokines

35、 in a single sample,Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for measuring kinase activity,Ser/Thr Kinase, Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated Protein,no washing steps faster higher throughput quantitative assay results no hazardous gels / radioactivity Sensitivity: higher than ECL/colorimetric assays,

36、 comparable to or better than radioactive assays,Advantages compared to Western blot procedures,Applications,When to use the LiquiChip System?,The LiquiChip System is used for a large variety of protein assays: Immunoassays Enzyme Assays Protein-protein interaction Assays Receptor ligand Assays Prot

37、ein nucleic acid assays,Assay Types,Immunoassays,Enzyme assays (kinase, protease),DNA-hybridization assays,Interaction assays,Realize the Power of Suspension Arrays,Assay system that offers: multiplexing of assays up to a factor of 100 a mix-and-measure procedures (no washing) suspension enzyme assa

38、ys (kinase, phosphatase and protease assays),,,A utoimmune,ASCA Human beta-2 Microglobulin Human Mouse Centromere B Human Chromatin Human ENA Profile 4 (SSA, SSB, Sm, RNP) Human ENA Profile 5 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70) Human ENA Profile 6 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1) Human Histone Human Histon

39、e H1 Human Histone H2A Human Histone H2B Human Histone H3 Human Histone H4 Human HSP-27 pS82 General HSP-27 Total General HSP-32 Human HSP-65 Human HSP-71 Human HSP-90 a Human,HSP-90 b Human Jo-1 Human PCNA Human Mouse PR3 Human PR3 (cANCA) Mouse Ribosomal P Human Mouse RNP Human Mouse RNP-A Human R

40、NP-C Human SCF Human Mouse Scl-70 Human Mouse Serum Amyloid P Human SLE Profile 8 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribosome-P, chromatin) Human Sm General Human Smith Mouse Human SSA Human Mouse SSB Human Mouse Streptolysin O Human TPO Human Mouse,Allergy Testing,Alternaria (Mold) Human Bermuda Gra

41、ss Human Cat Dander Human Egg White Human Milk Human Mite Pternoyssinus Human Mountain Cedar Human Short Ragweed Human Timothy Grass Human Wheat (food) Human,Cancer Markers,alpha Fetoprotein Human Cancer Antigen 125 Human Carcinoembryonic Antigen Human PSA, Free Human,Cardiac Markers,Creatine Kinase

42、-MB Human Endothelin-1 Mouse PAP Human SGOT Human Mouse TIMP-1 Human Mouse,Cytokines,BDNF Human CREB pS133 General CREB Total General DR-5 Human EGF Human Mouse ENA-78 Human Eotaxin Mouse Human Fatty Acid Binding Protein Human FGF-basic Human Mouse G-CSF Human Mouse GCP-2 Mouse GM-CSF Human Mouse Ra

43、t GRO-KC Rat HGF Human Mouse ICAM-1 Human IFN-alpha Human IFN-gamma Human Mouse Rat IL-10 Human Mouse Rat IL-11 Mouse IL-12 Human Mouse IL-12 p40 Human Mouse IL-12 p40/p70 Mouse Rat IL-12 p70 Human Mouse Rat IL-13 Human Mouse IL-15 Human Mouse IL-16 Human IL-17 Human Mouse,IL-18 Rat IL-1alpha Mouse

44、Human Rat IL-1beta Human Mouse Rat IL-1ra Human IL-1ra/IL-1F3 Human IL-2 Human Mouse Rat IL-3 Human Mouse IL-4 Human Mouse Rat IL-5 Human Mouse IL-6 Human Mouse Rat IL-7 Human Mouse IL-8 Human IL-9 Mouse IP-10 Human Mouse JE/MCP-1 Mouse KC Mouse KC/GROa Mouse LIF Mouse Lymphotacin Human Mouse M-CSF

45、Mouse MCP-1 Human Mouse Rat MCP-1(MCAF) Human MCP-3 Mouse MCP-5 Mouse MDC Human Mouse,MIG Human Mouse MIP-1 alpha Human Mouse MIP-1 beta Human Mouse MIP-1 gamma Mouse MIP-2 Mouse MIP-3 beta Mouse OSM Mouse PDGF-BB Mouse RANTES Human Mouse Rb (pT821) Human Rb (total) Human Rb pSpT249/252 Human Tau (p

46、S214) Human Tau (pS396) Human Tau (total) Human Tissue Factor Human Mouse TNF-alpha Human Mouse Rat TNF-beta Human TNF-RI Human TNF-RII Human VCAM-1 Mouse VEGF Human Mouse,Endocrine,Adiponectin Human Rat Amylin Mouse Rat Human C-Peptide Human Calcitonin Human CRF Human FGF-9 Mouse GLP-1 Human Mouse

47、Rat Glucagon Mouse Rat Human Growth Hormone Human Mouse Insulin Human Mouse Rat Leptin Human Mouse Rat Lipoprotein (a) Human Resistin Human Mouse Rat T3 Human T4 Human TBG Human Thyroglobulin Human TSH Human,Genotyping,FlexMAP General Mitochondrial DNA Screening General Tag-It Mutation Detection Kit

48、 General Y-SNP Identification General,Infectious disease,Adenovirus Human Mouse Bordetella pertussis Human Campylobacter jejuni Human Chlamydia pneumoniae Human Chlamydia trachomatis Human Cholera Toxin Human Cholera Toxin b Human Clostridium piliforme (Tyzzers) Mouse Cytomegalovirus Human Mouse Dip

49、htheria Toxin Human Ectromelia virus Mouse EDIM (Epidemic diarrhea of infant mice) Mouse Encephalitozoon cuniculi Mouse Epstein-Barr EA Human Epstein-Barr NA Human Epstein-Barr VCA Human HBV Core Human HBV Envelope Human HBV Surface (Ad) Human HBV Surface (Ay) Human HCV Core Human HCV NS3 Human HCV

50、NS4 Human HCV NS5 Human Helicobacter pylori Human Hepatitis A Human Hepatitis D Human,HIV-1 gp41 Human HIV-1 p24 Human HPV Human HSV-1 gD Human HSV-1/2 Human HSV-2 gG Human HTLV-1/2 Human Influenza A Human Influenza A H3N2 Human Influenza B Human Leishmania donovani Human Lyme disease Human Lymphocy

51、tic choriomeningitis virus Mouse M. pneumoniae Human M. tuberculosis Human Minute virus Mouse Mumps Human Mycoplasma pulmonis Mouse Parainfluenza 1 Human Parainfluenza 2 Human Parainfluenza 3 Human,Parvovirus Mouse Pneumonia virus of mice Mouse Polio Virus Human Polyoma virus Mouse Reovirus-3 Mouse

52、RSV Human Rubella Human Rubeola Human Sendai virus Mouse T.cruzi Human T.pallidum 15kd Human T.pallidum p47 Human Tetanus Toxin Human Theilers mouse encephalomyelitis virus Mouse Toxoplasma Human Varicella zoster Human HEV orf2 3KD Human HEV orf2 6KD Human HEV orf3 3KD Human HIV-1 gp120 Human,Isotyp

53、ing,IgA Human Mouse IgE Human Mouse IgG1 Mouse IgG2alpha Mouse IgG2beta Mouse IgG3 Mouse IgM Human Mouse light chain (kappa or gamma) Mouse,Kinase/Phosphorylated Protein,Akt General Akt/PKB (total) General Akt/PKBpS473 General ATF2 (Thr71) General Erk-2 General Erk1 (Thr202/Tyr204) General Erk1/Erk2

54、 (Thr202/Tyr204) General Erk2 (Thr202/Tyr204) General GSK-3beta General IkappaB-alpha pS32 General IkappaB-alpha Total General JNK (pTpY183/185) General JNK Total General JNKp (Thr183/Y182) General,MAPKAP K2 General p38 (total) General p38 MAPK pT180/pY182 General p53 (total) General p53 pS15 Genera

55、l PKB-alpha General PKC General SAPK1 General SAPK1a/JNK2 General SAPK4 General STAT1 pY701 General STAT1 Total General STAT3 (Tyr705) General ZAP-70 General,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0,4000,8000,12000,16000,20000,,Control,,LPS,IP-10,KC,MCP-1,MIG,MIP-1,GM-CSF,IFN-,IL-10,IL-12,IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,TNF-,圖1. BALB/c小鼠內(nèi)毒素休克后3 h肝臟組織中細(xì)胞因子的表達(dá)譜改變,MFI,1/2,Future,Spectral - not Spatial Separation,Questions?,