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附件3 保健食品中巴比妥類(lèi)化學(xué)成分的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法 （KJ201903） 1 范圍 本方法規(guī)定了保健食品中巴比妥類(lèi)化學(xué)成分的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。 本方法適用于硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液等保健食品中巴比妥類(lèi)化學(xué)成分的快速測(cè)定。 2 原理 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的巴比妥類(lèi)化學(xué)成分經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而致使檢測(cè)線不顯色。通過(guò)檢測(cè)線的顯色與否判讀，定性判定樣品中是否含有巴比妥類(lèi)化學(xué)成分。 3 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。 3.1 試劑： 3.1.1 無(wú)水乙醇。 3.1.2 提取液：將無(wú)水乙醇（3.1.1）與水按照體積比10:90混勻。 3.1.3 甲醇。 3.2 參考物質(zhì) 3.2.1本方法所用巴比妥、苯巴比妥、異戊巴比妥、司可巴比妥鈉等參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)表1，純度≥95%。 表1 參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號(hào) 分子式 相對(duì)分子量 巴比妥 Barbital 57-44-3 C8H12N2O3 184.19 苯巴比妥 Phenobarbital 50-06-6 C12H12N2O3 232.24 異戊巴比妥 Amobarbital 57-43-2 C11H18N2O3 226.27 司可巴比妥鈉 Secobarbital 76-73-3 C12H17N2O3 238.28 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 3.3.1 巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5 mg/mL）：精密稱取巴比妥（或苯巴比妥，異戊巴比妥，司可巴比妥鈉）標(biāo)準(zhǔn)品（3.2.1）適量，置于10mL容量瓶中，加入適量甲醇（3.1.3）超聲溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.5 mg/mL的巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。﹣20 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。 3.3.2 巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 μg/mL）：精密量取巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.5 mg/mL）（3.3.1）1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1.3）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為50 μg/mL的巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液。 3.4材料 3.4.1免疫膠體金免疫層析試劑盒，適用于保健食品硬膠囊、軟膠囊、丸劑、片劑、散劑及口服液。 3.4.1.1檢測(cè)卡。 4 儀器和設(shè)備 4.1 離心管：15mL。 4.2 渦旋混合器。 4.3 剪刀。 4.4 塑料吸管。 4.5 電子天平：感量為0.01 g。 4.6 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min，轉(zhuǎn)子配套15mL離心管。 4.7移液器：200μL 4.8環(huán)境條件：溫度15℃～35℃，濕度≤80%。 5.分析步驟 5.1試樣制備 取適量樣品，硬膠囊及軟膠囊取內(nèi)容物充分混勻，丸劑及片劑充分粉碎混勻，散劑及口服液充分混勻。 5.2試樣提取 準(zhǔn)確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）于15mL具塞離心管中，加入10mL提取劑（3.1.2）。加蓋后振搖或渦旋振蕩0.5 min，放置至澄清（30 min內(nèi)）或4000 r/min離心5min，取上清液作為待測(cè)液，立即測(cè)定。 注：試樣提取和凈化（5.2）過(guò)程可按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，不做限定。 5.3 測(cè)定步驟 吸取200μL待測(cè)液滴加到檢測(cè)卡（3.4.1.1）上的加樣孔中，開(kāi)始計(jì)時(shí)。3～8 min內(nèi)觀察質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。 5.4 質(zhì)控試驗(yàn) 每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。 5.4.1 空白試驗(yàn) 稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 5.4.2 加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取空白試樣2 g（精確至0.01g）置于15mL具塞離心管中，加入一定體積的巴比妥類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中間液（3.3.2），使巴比妥類(lèi)化學(xué)成分添加濃度為：巴比妥40 mg/kg（或苯巴比妥40 mg/kg，異戊巴比妥60 mg/kg，司可巴比妥鈉60 mg/kg）。按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。 6.結(jié)果判定 通過(guò)對(duì)比控制線（C線）和檢測(cè)線（T線）的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定，也可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。目視判定示意圖見(jiàn)圖1。 6.1 無(wú)效 控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或檢測(cè)卡無(wú)效。 6.2 陰性結(jié)果 檢測(cè)線（T線）和控制線（C線）均顯色，表明樣品中巴比妥類(lèi)化學(xué)成分低于方法檢測(cè)限，判定為陰性。 6.3 陽(yáng)性結(jié)果 檢測(cè)線（T線）不顯色，控制線（C線）顯色，表明樣品中巴比妥類(lèi)化學(xué)成分的含量高于方法檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性。 陰性（-） 陽(yáng)性（﹢） 無(wú)效 圖1 檢測(cè)結(jié)果判讀 6.4 質(zhì)控試驗(yàn)要求 空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。 7 結(jié)論 當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行確證。 8 性能指標(biāo) 8.1 檢測(cè)限 巴比妥40mg/kg、苯巴比妥40mg/kg、異戊巴比妥60mg/kg、司可巴比妥鈉60mg/kg。 8.2 靈敏度 靈敏度應(yīng)≥96%。 8.3 特異性 特異性應(yīng)≥98%。 8.4 假陰性率 假陰性率應(yīng)≤4%。 8.5 假陽(yáng)性率 假陽(yáng)性率應(yīng)≤2%。 8.6 相對(duì)準(zhǔn)確度 相對(duì)準(zhǔn)確度應(yīng)≥96%。 注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見(jiàn)附錄A 9其他 本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定，分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。 本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目批準(zhǔn)件（批準(zhǔn)件編號(hào)2009024）》和《保健食品中75種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)BJS 201710》。  附錄A 定性方法性能計(jì)算表 表A.1 性能指標(biāo)計(jì)算方法 樣品情況a 檢測(cè)結(jié)果b 總數(shù) 陽(yáng)性 陰性 陽(yáng)性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽(yáng)性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對(duì)準(zhǔn)確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果或者樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果； b由待確認(rèn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。 本方法負(fù)責(zé)起草單位：山西省食品藥品檢驗(yàn)所。 驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、河北省藥品檢驗(yàn)研究院。 主要起草人：王子龍、董培智、裴曉芬、楊國(guó)偉、劉春霖、馬春艷。 4