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目的與要求,,實驗二 原代細胞培養(yǎng)與觀察,掌握無菌操作技術(shù)。 了解小鼠解剖操作技術(shù)。 了解原代細胞培養(yǎng)的一般方法與步驟。 了解培養(yǎng)細胞的消化分散。,1,1. 儀器與備品：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃）、培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、 小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血細胞計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）。 2. 材料：胎鼠或新生鼠。 3.試劑：1640培養(yǎng)基（含10%）小牛血清）、0.25%胰 蛋白酶、Hank，s液、碘酒、75%的酒精。,實驗用品,2,原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織或器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到第一次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官）經(jīng)消化，分散成為單個游離的細胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。,原 理,3,,實驗步驟,（一）胰酶消化法 將孕鼠或新生小鼠引頸處死，置75%酒精泡2～3min（時間不能過長，以免酒精從口和肛門進入體內(nèi)），再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶進工作臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取腎臟，置平皿中； 2. 取Hank，s液洗滌三次，并剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物； 3. 用手術(shù)剪將腎臟剪成小塊（1mm2），再用Hank，s液洗三次，轉(zhuǎn)移至離心管中； 4.視組織塊量加入5～10倍的0.25%胰酶液，37℃水浴中消化20min，每隔5min震蕩一次，使細胞分離；,4,5.待組織變得疏松，顏色略微發(fā)白時，加入3～5ml培養(yǎng)液（含10%小牛血清）以終止胰蛋白酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）； 6.把消化后的懸液轉(zhuǎn)移到有紗布的小玻璃漏斗上,過濾后的溶液放入離心管中,1000r/min離心8min棄上清液； 7. 加入Hank，s液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上液； 8. 加入培養(yǎng)液1～2ml（視細胞量），細胞計數(shù)板計數(shù)； 9.將細胞調(diào)整到5×105個細胞/ml左右，轉(zhuǎn)移至10ml細胞 培養(yǎng)瓶中，37℃條件下培養(yǎng)。,,實驗步驟,5,1.自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。 2. 在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。 3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。 4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后手要用75%的酒精擦拭。試劑等瓶口也要擦拭。 5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不要太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具能再燒灼，以免燒焦變成碳膜。 6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防止空氣流動，增加污染機會。 7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 8. 瓶子開口后要盡量保持45o斜位。 9. 吸溶液的吸管等不能混用。,,注 意 事 項,6,實驗報告,記錄實驗過程和細胞生長情況，分析防止污染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。,7,,The End,8,