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1、生物芯片原理 principle of biochip,醫(yī)學(xué)院病毒所,本章提綱,生物芯片簡介 生物芯片的分類 基因芯片基本原理、流程與應(yīng)用 蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用,第一節(jié) 生物芯片簡介,一、 什么是生物芯片 生物芯片主要指通過平面微細加工技術(shù)，在固體芯片等載體上的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測,芯片上每平方厘米可密集排列成千上萬個生物分子，能快速準(zhǔn)確地檢測細胞、蛋白質(zhì)、DNA及其他生物組分，并獲取樣品中的有關(guān)信息，其效率是傳統(tǒng)檢測方法的成百上千倍。,生物芯片分析過程,基因芯片的最大優(yōu)點在于其高通量。傳統(tǒng)方法檢測眾多基因要經(jīng)歷多次實驗

2、而且自動化程度低，因而每次實驗之間是存在系統(tǒng)誤差的。基因芯片可以克服這個缺點，眾多基因的探針的標(biāo)記、雜交等過程是在一次實驗過程中完成的，而且自動化程度高，數(shù)據(jù)客觀可靠,1996年美國Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于藥物篩選和實驗室試驗用的生物芯片，并制作出相應(yīng)的芯片系統(tǒng)。此外，美國的Hyseq公司、Aurora公司、Nanogen公司、Incyte公司等也在積極開展DNA芯片研究工作。近二年，摩托羅拉、惠普、IBM等跨國公司也相繼投以巨資加入生物芯片的研究開發(fā)。,我國是從一九九七年開始對生物芯片研究。 中國醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會生物芯片分會2006年在北京成立。 中國在北京、上海、

3、陜西、天津、南京建立了五大生物芯片研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化基地 。 我國生物芯片產(chǎn)業(yè)尚未形成統(tǒng)一的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，不規(guī)范。在產(chǎn)品認證認可方面也存在與國際慣例不接軌的情況。,生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來，影響最為深遠的重大科技進展。它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學(xué)技術(shù)革命。 該技術(shù)被評為1998年度世界十大科技進展之一。,發(fā)展趨勢,縮微芯片實驗室 生物芯片研究領(lǐng)域的一個熱點，它是將傳統(tǒng)的生物化學(xué)樣品制備、生化反應(yīng)、檢測三個步驟集于一體，縮小構(gòu)成芯片上的實驗室系統(tǒng),第二節(jié) 生物芯片的分類,一般分類,信息生物芯片和功能生物芯片,第三節(jié)基因芯片的基本原理與流程,基因芯片技術(shù)是指通過微陣列(Mic

4、roarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及檢測等研究的技術(shù)。,基因芯片發(fā)展歷史,Southern and Northern Blot,,,Dot Blot,Macroarray,Macroarray,,,,,,RNA,DNA1,DNA2,Probe,Southern hybridization,Northern hybridization,,,,,,,Hybridization of Nucleic Acids,,,,Synthesizing oli

5、gonucleotide,PROBE GGGGACGAGTCCTCCGTTCT,,The nucleic acid sequence is Deduced from amino acid sequence,Chemical synthesis,Preparation of Traditional Nucleic Acid Probe,基因芯片分類,按芯片制備方法分類 原位合成芯片（synthetic genechip） DNA微陣列芯片（DNA microarray） 按探針分類 寡核苷酸陣列 DNA陣列 基因芯片 cDNA芯片 RNA芯片,Types of DNA

6、 Chips,生物芯片的原理,生物芯片利用空間位置固定事先已知的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物分子 芯片技術(shù)對固定相分子的要求較高，要求生物分子固定在芯片基質(zhì)上之后仍要保持生物活性的穩(wěn)定。 在分子雜交反應(yīng)和洗片等處理過程中能穩(wěn)定結(jié)合所親和的分子，防止其在雜交洗滌過程中被沖洗掉，保證檢測信息的準(zhǔn)確可靠。,制作芯片片基的材料首先必須有很好的光學(xué)性質(zhì)，能利用光進行透射和反射的檢測 芯片表面具有可以進行化學(xué)反應(yīng)的活性基團，方便生物分子的偶聯(lián)而固定 芯片表面的活性化學(xué)基團有足夠的吸附能力，要能結(jié)合最佳容量的生物分子 芯片要有很好的穩(wěn)定性，具有一定的抗壓能力，并且在生物分子雜交反應(yīng)過程中要處于惰性狀態(tài)，不

7、會發(fā)生其他化學(xué)反應(yīng)或其他物質(zhì)吸附 生物芯片要有很好的兼容性，可以廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和研究,芯片片基,生物分子與芯片的結(jié)合,生物芯片表面的活性基團形成特異親和生物分子的位點，用來吸附和固定生物活性分子，例如多肽、核酸、酶、抗體或抗原等 根據(jù)芯片基片表面的活性基團的類型，芯片可以分為氨基片、醛基片、環(huán)氧乙基片和N一羥基琥珀酰亞胺酯片 根據(jù)不同的需要來選用芯片，如對大分子DNA的吸附要用氨基片，對寡聚核苷梭或小片段DNA要用醛基片,a. 氨基片 表面為氨基，直接與核酸分子的磷酸基團靠電荷作用相結(jié)合 b. 醛基片 表面的醛基直接與生物分子的氨基共價結(jié)合,c. 環(huán)氧已基片 表面的環(huán)氧已基直接與生物分子

8、的氨基共價結(jié)合； d. N-羥基琥珀酰亞胺酯片 表面的N-羥基琥珀酰亞胺酯基直接與生物分子的氨基共價結(jié)合。,DNA Chip Technology,Solid support. glass, plastic, metal, silicon. Miniaturized array of DNA (genetic material) Work on the biochemical principle of DNA/DNA hybridization Hybridized probes(DNA molecules)are fluorescently labeled,,,,,,,,Comparison

9、 of DNA Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip assays Probe and target DNA/RNA Complexity Chip surface (autofluorescence and non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, nois

10、e),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,,基因芯片的原理,依據(jù)雙螺旋原理，核酸分子雜交技術(shù)，在靶標(biāo)樣品與探針之間進行選擇性反應(yīng)，將反應(yīng)一方，探針固定在芯片上，另一方，熒光標(biāo)記制備好的cDNA，分別標(biāo)記綠色的Cy3和紅色的Cy5通過流路或加至芯片上。,基 因 芯 片 流 程,樣品制備,芯片制備,,,雜交,雜交信號檢測,數(shù)據(jù)分析,,,,,,,Each spot contains known DNA,Complemen

11、tary DNA hybridize,Signal appears,Biochip Based on Hybridization,實驗流程,影響雜交反應(yīng)的因素 1 探針濃度 其濃度差異對信號有影響，濃度高信號強。 2 陽離子 陽離子存在可提高異源雜交雙鏈的生成速度。 3 溫度 ONA2542C，cDNA 5570 C 4 序列組成 芯片上一次產(chǎn)生上萬個異源雜交反應(yīng)，應(yīng)選擇最協(xié)調(diào)條件。 5 高靈敏度監(jiān)測系統(tǒng)，閱讀儀。,基因芯片檢測原理,熒光掃描成像用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴(yán)格配對的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強；而不完全雜交的分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號弱；不雜交的無熒光。

12、不同位點的信號被掃描后由計算機軟件處理，并對每個點的熒光強度數(shù)字化后進行分析。,基因芯片數(shù)據(jù)分析,圖像分析，Ratio值分析，基因聚類分析 圖像分析 激光掃描儀得到的掃描圖像文件通過劃格，確定雜交斑點的位置，然后經(jīng)過過濾背景噪音，提取得到熒光信號強度值，最后以數(shù)據(jù)列表的形式輸出。這一系列的工作都是依靠軟件來完成，如Biodiscovery， Imagene 7.0分析軟件。,Ratio值分析 在常用的雙色熒光芯片系統(tǒng)下，各雜交斑點的兩色熒光cy3cy5的比值又稱R/G值。一般認為RG值在0.52.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達差異，該范圍之外則認為基因的表達出現(xiàn)顯著改變。 由于實驗條件

13、的不同，該域值范圍會根據(jù)置信區(qū)間進行調(diào)整。處理后得到的信息可以根據(jù)需要以各種形式輸出，如柱形圖、餅形圖、點圖、原始匡像拼圖等。將每個信號斑點的所有相關(guān)信息如位標(biāo)、基因名稱、克隆號、PCR結(jié)果、信號強度、Ratio值等自動關(guān)聯(lián)并根據(jù)需要篩選數(shù)據(jù)。,聚類分析 clustering analysis 從生物芯片的圖像分析中可得到大量的數(shù)據(jù)，要從中提取所需要的信息就必須對這些數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。通過建立各種數(shù)學(xué)模型，分析芯片圖像數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義。 聚類分析是利用大量相關(guān)數(shù)據(jù)對事物進行分類處理，其方法為直接比較樣本中各種特征數(shù)據(jù)，將特征相近的歸為一類，差別較大的歸為不同的類。,四 生物芯片的制作,基

14、本方法 點樣法和原位合成法 原位合成法 原位光刻合成 壓電打印法,點樣法 這一方法相對技術(shù)要求不高，是最常用的方法。點樣法是將預(yù)先合成好的探針、PCR產(chǎn)物、蛋白或多肽、抗原或抗體等經(jīng)純化、定量分析后，通過由陣列復(fù)制器或陣列點樣機準(zhǔn)確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或玻片等相應(yīng)位置上，再進行固定處理，如紫外線交聯(lián)固定。,點樣的方式分接觸式點樣與非接觸式點樣兩種。接觸式點樣是點樣針直接與固相支持物表面接觸，將生物分子樣品留在固相支持物上。非接觸式點樣以壓電原理將樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1平方厘米可打印2 500個探針；缺點是定

15、量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。,原位合成法,原位合成法 該方法技術(shù)比較復(fù)雜，除了Affymetrix 等少數(shù)實力雄厚的生物芯片公司可以用該技術(shù)外，其他的公司和實驗室都是采用點樣法制作芯片。 原位合成方法有兩種途徑，一種是原位光刻合成，該技術(shù)是由Affymerix公司的Fodor實驗室開發(fā)。該方法的主要優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的多肽或寡聚核苷酸陣列。,另一種原位合成是壓電打印法，主要用于合成寡聚核苷酸探針，其原理與普通的彩色噴墨打印機相似，所用技術(shù)為常規(guī)的固相合成方法。根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置，沖洗、去保護、偶聯(lián)等與一般的

16、固相合成技術(shù)相同。 該技術(shù)采用的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，不需要特殊制備的化學(xué)試劑，可以合成出長度為4050個堿基的探針。,一個實例,基因芯片篩選宮頸癌相關(guān)基因的研究 摘要 本研究中采用細胞原癌、抑癌基因分類芯片對原發(fā)性宮頸癌標(biāo)本進行分析，以期探討宮頸癌基因組中存在的癌基因表達的變異，確定與宮頸癌相關(guān)的候選原癌或抑癌基因，為宮頸癌的診斷和治療提供新的線索和依據(jù)。,實驗結(jié)果,1 組織總RNA制備 本實驗中共收集到宮頸癌組織0.96g，正常對照宮頸組織0.56g，分別提取總RNA。兩種宮頸組織的總RNA提取的質(zhì)量見表1 表1 總RNA提取結(jié)果 樣品類型 編號 總R

17、NA量 OD260 OD280 OD260/OD280 熒光標(biāo)記 正常宮頸組織 N 706.8g 0.592 0.289 2.059 Cy3 對照組 宮頸癌組織 C 1200.0g 1.015 0.488 2.114 Cy5 實驗組,,,,芯片掃描結(jié)果,Cy3 Cy5,宮頸組織/對照組織雙色熒光標(biāo)記芯片掃描疊加圖,圖中X軸、Y軸分別以cy3熒光強度值(前景值背景值)和 cy5熒光強度值為坐標(biāo)，每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上一個基因點的雜交信號；數(shù)據(jù)點若為紅色，則代表Y值與X值的比值在0.5至2.0之間，屬非差異表達；數(shù)據(jù)點若為黃色，則代表Y值

18、與X值的比值在0.5到2.0范圍之外，表明所代表的基因存在表達差異。,,通過對基因芯片結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)BLACP，bladder cancer related protein基因即膀胱癌相關(guān)蛋白基因的表達下調(diào)最為明顯，提示BLACP基因與宮頸癌之間存在著聯(lián)系。很可能是一個宮頸癌相關(guān)的候選抑癌基因。該基因在包括人在內(nèi)的多種動物中已有發(fā)現(xiàn)。尚未發(fā)現(xiàn)與人類其它的基因有任何的同源性。鑒于此，在本實驗中BLACP 基因克隆到真核表達載體上，轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞系HeLa，發(fā)現(xiàn)它的確可以抑制HeLa細胞的生長及增殖。,Genomic chip,Screen specimens to determine gene

19、 copy number changes Establish correlations between gene copy number changes and disease biology Determine the interaction of multiple genes on the initiation and progression of disease Accelerate development of products for genomic disease management to guide therapeutic intervention Combined with

20、expression chips, gives full understanding of disease process,三、芯片技術(shù)的應(yīng)用,1 基因表達分析 分析基因表達時空特征 檢測基因差異表達 發(fā)現(xiàn)新基因 大規(guī)模測序,DNA序列測定 人類基因組計劃 鑒別和測定人類基因的DNA序列, 雜交測序 sequencing by hybridization, SBH 建立在特定序列的DNA與特定長度的寡核苷酸集合的雜交的基礎(chǔ)之上。未知DNA序列可以通過鑒定與靶DNA序列形成完整的雙鏈體寡核苷酸的重疊區(qū)域來確定；65536個八核苷酸點陣可測定約200個核苷酸的序列；一百萬個十二核苷酸

21、點陣可測定約1000個堿基對。,2 基因型、基因突變和多態(tài)性分析 分析基因組中不同基因與性狀或疾病的關(guān)系 3 疾病的診斷與治療 遺傳病相關(guān)基因的定位，產(chǎn)前篩查與診斷 腫瘤診斷 感染性疾病的診斷 基因突變檢測與遺傳病和腫瘤診斷的大量 平行測定,4. 藥物研究中的應(yīng)用 新藥開發(fā) 發(fā)現(xiàn)藥物的新功能 調(diào)查藥物處理細胞后基因的表達情況 對藥物進行毒性評價 在基因水平上尋找藥物靶標(biāo)，毒性對 基因的影響。,其它 病原體的檢出 腫瘤相關(guān)基因表達譜 位點突變 耐藥基因檢測 疾病的分子分型 HLA分型,基因芯片的缺點 不能對待檢測基因在組織中的精確定位進行判斷。另外很多蛋白質(zhì)功能不是主要依

22、賴是否表達或表達量高低，而是依賴蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化等方式。在這種情況下，用核酸類生物芯片就沒有什么意義，蛋白類芯片可能會有所作為。 不能盲目崇拜高精尖端的技術(shù)和儀器設(shè)備。實事求是，定位明確，按規(guī)律辦事。,生物芯片的未來,您只需提供保存完好的組織或細胞標(biāo)本，公司的芯片技術(shù)服務(wù)人員就可替您完成實驗操作與數(shù)據(jù)分析，向您提供由您所選的任何一個芯片的實驗結(jié)果，可以為您節(jié)省大量的時間與精力。 客戶樣品RNA抽提RNA質(zhì)量檢測cDNA模板制備實時定量PCR芯片數(shù)據(jù)處理提供實驗報告,細胞凋亡PCR芯片細胞周期PCR芯片血管生成PCR芯片腫瘤轉(zhuǎn)移PCR芯片癌通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片DNA損傷信號通路PCR芯片

23、 氧化應(yīng)激與抗氧化PCR芯片應(yīng)激和毒性通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片腫瘤藥物耐受和代謝PCR芯片細胞因子PCR芯片,乳腺癌和雌激素受體信號通路PCR芯片藥物代謝PCR芯片內(nèi)皮細胞生物學(xué)功能研究PCR芯片骨再生PCR芯片干細胞PCR芯片動脈粥樣硬化PCR芯片糖尿病PCR芯片趨化因子與受體PCR芯片,生長因子PCR芯片 炎癥細胞因子與受體PCR芯片 干擾素及其受體PCR芯片 Th1-Th2-Th3PCR芯片 Toll樣蛋白受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)PCR芯片 細胞外基質(zhì)與粘連分子PCR芯片 神經(jīng)營養(yǎng)素與受體PCR芯片 低氧信號通路PCR芯片,胰島素信號通路PCR芯片 JAK / STAT信號通路PCR芯片 MAPK信號轉(zhuǎn)

24、導(dǎo)通路PCR芯片 NF-kB信號通路PCR芯片 一氧化氮PCR芯片 Notch信號通路PCR芯片 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者PCR芯片 TGFb / BMP信號通路PCR芯片 TNF配體及受體PCR芯片 Wnt信號通路PCR芯片 管家PCR芯片,第四節(jié) 蛋白質(zhì)芯片及應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片 是指以蛋白質(zhì)分子作為配基，將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列，用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。 又稱為蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列（protein microarray）,根據(jù)其固定生物分子的不同，

25、可以分為受體配體檢測芯片，抗原芯片，抗體芯片 根據(jù)芯片載體的不同，分為普通玻璃載玻片，多孔凝膠覆蓋芯片和微孔芯片3種主要形式。普遍應(yīng)用的是玻璃片，另外也可以應(yīng)用PVDF膜，聚丙烯酰氨凝膠，硝化纖維素膜，聚苯乙烯微珠，磁性微珠等,蛋白質(zhì)芯片的分類,,蛋白質(zhì)檢測芯片,蛋白質(zhì)功能芯片,與基因芯片的比較,蛋白質(zhì)是基因表達的最終產(chǎn)物, 接近生命活動的物質(zhì)層面 探針蛋白特異性高、親和力強, 可簡化樣品前處理，甚至可直接利用生物材料，血樣、尿樣、細胞及組織等進行檢測 適合高通量篩選與靶蛋白作用的化合物 有助于了解藥物或毒物與其效應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的相互作用,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的原理,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)主要包括四個基本要點

26、 芯片陣列的構(gòu)建 樣品的制備 芯片生化反應(yīng) 信號檢測及分析,,提出生物學(xué)問題 （實驗?zāi)康模?樣品預(yù)處理 （重組蛋白， 制備一、二級抗體， 熒光標(biāo)記）,生化反應(yīng) 化學(xué)偶合，加底物， 反應(yīng)溫度和時間， 沖洗條件,檢測 （熒光和比色掃描或拍照， 參數(shù)設(shè)置）,數(shù)據(jù)分析和建模 圖象量化，標(biāo)準(zhǔn)化 建立模型）,1,2,3,4,5,蛋白質(zhì)芯片制備,6,首先將蛋白按設(shè)計的陣列方式點印在介質(zhì)上，樣品蛋白質(zhì)與芯片反應(yīng)，然后用經(jīng)過可以是酶、熒光、同位素、生物素等標(biāo)記的蛋白質(zhì)與芯片-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，通過激光共聚焦顯微鏡和CCD照相機對標(biāo)記信號進行掃描分析,蛋白質(zhì)芯片的核心技術(shù)是蛋白芯片的制備和反應(yīng)信號的檢測分析。因

27、此蛋白質(zhì)的純度, 蛋白質(zhì)的固定是蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的重點和難點。 由于蛋白質(zhì)分子的活性依賴于不同的折疊方式，因此對芯片的表面修飾至關(guān)重要，要保證被點在芯片上的蛋白質(zhì)不失活而又能牢固的固定在芯片上。,對最普遍應(yīng)用的玻璃片而言，用于制備蛋白質(zhì)芯片的方法主要有戊二醛修飾法、聚賴氨酸修飾法、巰基修飾法和多糖修飾法等,面臨的問題,成本過高, 需一系列昂貴的尖端儀器，芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題，提高芯片的特異性、簡化樣品制備和標(biāo)記操作程序、增加信號檢測的靈敏度和消除芯片背景對于結(jié)果分析的影響等,Protein chip的應(yīng)用,Diagnostic immunoassay simultaneous high-throughput analysis of known auto-antigens. Protein-Protein Interaction. DNA- Protein Interaction,Protein chip的應(yīng)用,微生物感染病原體抗原、抗體的檢測 自身抗體的檢測 特定蛋白的檢測 HLA分型 過敏原檢測 腫瘤標(biāo)志的檢出,結(jié)語新技術(shù)的啟示,“自強” 語出周易“天行健、君子以自強不息”。 “求是” 語出漢書“修學(xué)好古，實事求是”。 “拓新”意為創(chuàng)新，不斷進取。,Thank you!,