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1、EBV LMP2 B細胞表位的預測、克隆、表達及其融合蛋白免疫原性的初步研究,溫州醫(yī)學院2004級碩士學位論文答辯,答辯人：歐 琴 導 師：張麗芳 教授 夏克棟 教授 專 業(yè)：病原生物學 2007.5.17,主 要 內(nèi) 容, 研究背景 研究目的 研究方案 結(jié) 果 分析與討論 結(jié) 論,,,,,,,,研 究 背 景,,EB病毒(Epstein-Barr virua,EBV)屬于皰疹病毒科。引起的主要疾病包括傳染性單核細胞增多癥、移植后淋巴細胞增多癥(PTLD)、霍奇金病、Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌(NPC)。,研 究 背 景,,,,腫瘤 亞型 EBV陽

2、性率,表1 EBV相關(guān)的增生性疾病,Burkitt淋巴瘤 E-BL 100% S-BL 15%-85% AIDS-BL 100% NPC 低分化或未分化 100 霍奇金病 mc/ld 80%-90% ns 30 T細胞淋巴瘤 fatal IM 100% AILD 40% 淋巴母細胞瘤 fatal IM 100% 與器官移

3、植相關(guān) 100 與AIDS相關(guān) 70-80%,,,研 究 背 景,,LMP2不是轉(zhuǎn)化基因，維持EBV潛伏感染。 LMP2成為NPC等EBV相關(guān)腫瘤治療的理想 靶抗原之一。,研 究 背 景,表位疫苗是目前研制感染性疾病與惡性腫瘤疫苗的方向。 多表位疫苗能選擇性誘導多價、多特異性應答和控制免疫應答類型。,,研 究 背 景,,NPC患者血清中能檢測LMP2抗體。 B細胞表位的研究為單克隆抗體的制備提 供更充分的依據(jù)，以B細胞表位為基礎(chǔ)的多肽 抗原可用于血清學檢測。,研 究 目 的,,1. 預測EBV LMP2的B細胞表位，可為其單克隆抗體的制備及表位疫苗

4、設(shè)計等研究提供理論依據(jù)。 2. 分別構(gòu)建含預測B細胞表位多肽的原核重組質(zhì)粒，采用6個組氨酸標簽(His.tag)表達表位融合蛋白，并用Ni-NTA樹脂親和層析法分別純化表位融合蛋白。 3. 將純化的蛋白分別免疫小鼠，檢測其誘導小鼠產(chǎn)生的特異性IgG抗體；選擇抗原性強的融合蛋白作包被抗原，用ELISA檢測NPC組、CA疾病對照組和健康對照組的血清特異性抗體。為B細胞表位多肽的免疫原性和抗原性及其在NPC血清學診斷中的應用價值進行初步探討。,研 究 方 案,,一、EBV LMP2的二級結(jié)構(gòu)分析 和B細胞表位預測,研 究 方 案,,,采用EXPASY服務器提供的SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

5、檢索 LMP2完整蛋白質(zhì)的氨基酸序列 (http://www.expasy.org/sprot/); 采用EXPASY服務器提供的SOPMA、GOR、nnPredict、HNN方法 預測LMP2二級結(jié)構(gòu)(http://www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服務器提供的SOSUI方法預測LMP2跨膜區(qū)域 (http://www.expasy.ch/tools) ； 采用EXPASY服務器提供的Hopp 2. pET32a/ozlf-67; 3:pET32a/ozlf-67/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,圖5 重組質(zhì)粒pET

6、32a/ozlf-69酶切鑒定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-69; 3:pET32a/ozlf-69/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,圖6 重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-71酶切鑒定 1:DNA/Hind DNA Marker; 2. pET32a/ozlf-71; 3:pET32a/ozlf-71/EcoR I; 4:pET32a(+); 5:pET32a(+)/EcoR I,重組質(zhì)粒酶切鑒定,結(jié) 果,,測序結(jié)果,圖7 3個重組的目的基因的測序圖,結(jié) 果,,B細胞表位融合蛋白鑒定,圖8 B細胞表

7、位融合蛋白表達產(chǎn)物 SDS-PAGE和Western-Blot分析 1:蛋白分子標準物； 2:IPTG誘導重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-67蛋白表達；3:IPTG誘導重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-69蛋白表達；4:IPTG誘導重組質(zhì)粒pET32a/ozlf-71蛋白表達；5:IPTG誘導重組質(zhì)粒pET32a蛋白表達； 6: BL21,結(jié) 果,,ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71融合蛋白和His蛋白的純化,圖9 純化的ozlf-67蛋白SDS-PAGE電泳分析 1：蛋白分子標準物； 2：樣品穿透液； 3：Buffer B液濾液； 4：Buffer C液濾液； 5-7：Buffer

8、 E液濾液,圖10 純化的ozlf-69蛋白SDS-PAGE電泳分析 1：蛋白分子標準物； 2：樣品穿透液； 3：Buffer B液濾液； 4：Buffer C液濾液； 5-8：Buffer E液濾液,圖11 純化的ozlf-71蛋白SDS-PAGE電泳分析 1：蛋白分子標準物； 2：樣品穿透液； 3：Buffer B液濾液； 4：Buffer C液濾液； 5-6：Buffer E液濾液,圖12 純化的His蛋白SDS-PAGE電泳分析 1：蛋白分子標準物； 2：樣品穿透液； 3：Buffer B液濾液； 4：Buffer C液濾液； 5：Buffer E液濾液,結(jié) 果,,結(jié) 果,,三、EB

9、V LMP2 B細胞表位融合 蛋白免疫原性的初步研究,結(jié) 果,,圖13 不同免疫原在不同時間的抗體均值（XSD）,分別包被3種表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69和ozlf-71，分別 檢測3種表位融合蛋白的免疫血清與His蛋白免疫血清的抗體效 價差異。,結(jié) 果,,圖14 多肽表位誘導鼠免疫血清的抗體效價的ELISA檢測結(jié)果,*,* ：與His蛋白免疫組比較,*,*,結(jié) 果,,B95.8細胞作為包被抗原，ELISA檢測3種表位融合 蛋白免疫小鼠制備的鼠血清抗體效價。,,圖15 B95.8細胞包被ELISA檢測鼠免疫血清抗體效價,* ：與His蛋白免疫組比較,*,*,*,結(jié) 果,,選用O

10、zlf-67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測NPC組、 CA疾病對照組及健康對照組血清特異性IgG抗體。,圖16 ozlf-67蛋白包被ELISA檢測病人血清抗體效價,* ：與正常組比較,*,結(jié) 果,,表5 ozlf-67蛋白包被ELISA檢測病人血清抗體陽性率,*,*與正常組比較,*,分 析 與 討 論,,預測的B 細胞表位是線性B 細胞表位，主要 的參數(shù)有二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及 性、抗原性以及柔韌性等，抗原性和親水性是形 成表位的首要條件，因而優(yōu)勢表位的形成是多種 因素綜合作用的結(jié)果。,分 析 與 討 論,,采用分子生物學方法分別得到了包含預測 表位片段的重組質(zhì)粒，并得到了融

11、合蛋白，為 進一步表位融合蛋白的免疫學檢測奠定基礎(chǔ)。,分 析 與 討 論,3種表位融合蛋白均具有良好的免疫原性 B細胞表位多肽均能誘導產(chǎn)生特異性抗體 以B95.8細胞作為抗原包被酶標板， B細胞表位 融合蛋白誘導的小鼠免疫血清與EBV抗原特異 性結(jié)合，但抗體效價較低，可能是由于單個表位 肽的結(jié)合能力較弱。,,分 析 與 討 論,,選用Ozlf67融合蛋白為診斷抗原，ELISA檢測NPC患者血清特異性抗體，用于NPC的血清學診斷試劑的研制具有臨床應用價值。,結(jié) 論,,1.預測EBV LMP2的B細胞表位可能位于其N端199209、318322和381391區(qū)段； 2. 分別成功構(gòu)建了含B

12、細胞表位的重組質(zhì)粒pET32a(+)/ozlf-67、pET32a(+)/ozlf-69和pET32a(+)/ozlf-71；在原核表達系統(tǒng)內(nèi)分別高效表達了表位融合蛋白ozlf-67、ozlf-69、ozlf-71；通過親和層析法得到了純化的表位融合蛋白。 3. 表位融合蛋白免疫小鼠血清學檢測，表明3個B細胞表位融合蛋白均能刺激機體產(chǎn)生抗體，具有較強的免疫原性，抗體效價隨免疫次數(shù)增加而升高；表位融合蛋白誘導所產(chǎn)生的抗體均能與EBV抗原結(jié)合。 4.Ozlf67蛋白作為診斷抗原，具有較強的抗原性，用于NPC的血清學診斷試劑的研制具有臨床應用價值。,首先我要衷心感謝我的導師張麗芳教授、夏克棟教 授三年來對我的悉心指教和無私關(guān)懷。本文是在導師的 悉心指導和嚴格要求下得以完成。在此向?qū)熤乱宰钫\ 摯的敬意和感謝！ 感謝基礎(chǔ)醫(yī)學院微免教研室和基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗平臺 全體老師給予的幫助和支持！感謝附一和附二檢驗科老 師給予實驗的幫助！感謝師姐、師弟、師妹及我的同學 等對我實驗的幫助及生活的關(guān)心！ 我要衷心感謝我的家人，他們的關(guān)心和鼓勵給予我 強大的精神動力。他們?yōu)槲宜龅臒o私奉獻將使我終生 感激！ 最后感謝評審委員和參與本人論文答辯的各位專家 教授在百忙之中對本文的指導！,致 謝,,謝謝！,