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1、熒光定量PCR技術在 臨床檢測中的應用,黃少軍 市中心醫(yī)院,PCR與基因診斷技術,基因診斷即通過核酸的分子生物學檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個小時內把特定的DNA片段擴增1000萬倍。 九十年代中期PCR臨床應用在國內全面開展，1998年，熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4 基因診斷,3 免疫學診斷,臨床診斷,細胞膜,細

2、胞核,DNA,轉錄,mRNA,翻譯,蛋白質,1 形態(tài)學診斷,2 生化診斷,,概念,基本原理,以DNA為例 （1）DNA變性： （2）降溫退火： （3）引物延伸：,原理 第一步 加熱變性,預處理,第二步 引物與靶序列退火,,第三步 - 引物延伸,第1個 PCR 循環(huán)完成后 得到兩個拷貝的靶序列,PCRPCR.exe動畫,30次循環(huán)后靶序列擴增的數量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,熒光PCR的原理,PCR技術的特點,靈敏度高 特異性強 快速簡便 應

3、用范圍廣,Ct值的意義,Ct值與重復性 同一樣本在相同條件下同時進行96次擴增,FQ-PCR,Ct值與濃度 不同的模板達到熒光域值時的Ct值不同,,感染性疾病的診斷 母嬰傳播的控制與觀察 遺傳疾病的診斷 腫瘤的診斷 法醫(yī)學鑒定,熒光定量PCR的臨床應用,早期診斷 病情評估和預后判斷 抗病毒藥物療效的觀察、指導 新藥驗證,一 感染性疾病 1. 病原體含量與病情之間的關系 2. 病原體含量與用藥之間的關系 3. 藥物及療法的研究與開發(fā) 4. 新的病原體分子診斷標準 5. 新的愈后指標 6. 傳染病發(fā)病的監(jiān)控、預測與預防,臨床應用,臨床應用,,二 腫瘤 1. 腫瘤標志物：癌胚抗原、同功酶、抗體、激素

4、、細胞因子、受體等 2. 腫瘤相關基因表達的檢測：包括癌基因抗癌基因、腫瘤轉移基因及轉移抑制基因,三 遺傳病 1. 等位基因檢測 2. 多基因遺傳病的突變檢測 3. 基因表達異常所致遺傳病檢測,1.親子鑒定 2.法醫(yī)物證 3.PCR-RFLP技術的法醫(yī)學應用 4.罪犯鑒定,法醫(yī)鑒定,免疫學診斷主要是抗原抗體反應，應用于臨床通常在體內產生抗體以后，而許多病原體的免疫學檢測存在較長的“窗口期”，不利于對疾病的早期診斷；PCR方法直接檢測病原體的DNA/RNA，能大大縮短“窗口期”，其高靈敏度的檢測顯然也有利于疾病的早期診斷。,疾病的早期診斷,熒光定量PCR在病原體檢測中的應用,一 肝炎病毒定

5、量檢測 二 性病病原體檢測 三 結核桿菌及呼吸道病原體檢測 四 優(yōu)生優(yōu)育(TORCH)相關項目檢測,臨床應用,肝炎病毒定量檢測 HBV HCV,臨床應用,（一） 乙型肝炎病毒結構及特點,HBsAg：是HBV感染的主要標志 HBsAb：保護性抗體 HBcAg：僅存于感染的肝細胞核內， 一般不存在于血循環(huán)中 HBcAb: 非保護性抗體，HBcAb-IgM 提示HBV處于復制狀態(tài) HBeAg：HBV復制及強感染性的指標 HBeAb：有一定的保護作用，預后良好,HBV,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,1. “兩對半” ：機體的免疫反應狀態(tài)；,2. “攜帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學

6、指標不能 反應體內病毒復制水平與感染程度。,FQ-PCR：檢測的是HBV本身的遺傳物質DNA，是 病毒存在和復制的最可靠、最直接的指標。,3. 血清學指標()不能排除HBV感染。,HBV,（二） HBV-DNA與“兩對半”,,4. 也可能出現HBsAg()，HBV-DNA()。,5. HBsAb () 、 HBcAb () 、 HBeAb ()三抗體陽性 與HBV DNA 2.5 103 copy /ml 結果解釋。,HBV,(三)HBV-DNA定量檢測的臨床意義,3. HBV-DNA定量與預后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌變的幾率明顯高于含量低者,1. HBV-

7、DNA定量與HBV復制水平及傳染性,2. HBV-DNA定量與乙肝藥物療效 a. 專家提出<103 copy /ml做為陰性或臨床治愈標準 b. HBV-DNA定量分析與干擾素治療(前、中、后) c. 拉咪呋啶,HBV,(三)HBV-DNA定量檢測的臨床意義,4. HBV-DNA定量有助于指導懷孕與孕期，哺乳期檢查,6. 血液制品和獻血員的篩選,HBV DNA檢測的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據 HBV DNA是HBV復制的標志 HBV DNA是患者具有傳染性的標志 HBV DNA對乙肝兩對半起補充作用 HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標

8、HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,病毒特點： 1. 單正鏈RNA病毒 2. E1和E2區(qū)基因高度變異性,（一）丙型肝炎病毒特點,HCV,感染特點： HCV在血中含量極微 輸血后肝炎主要致病因子 免疫學標志僅有抗-HCV，非中和抗體，產生時間不一 有一部分人感染HCV后，不產生抗-HCV 感染易于慢性化(50-85%) 疫苗研制尚不成功,單鏈RNA,,(二)HCV-RNA定量檢測的臨床意義,1. 早期診斷 a. 臨床以< 80 copy/ml做為無感染或治愈標準。 b. HCV感染1-3W，即可檢出HCV-RNA的存在。 c. 嚴格篩選獻血員 ,提高對窗口期感染者的檢出率。,H

9、CV,HCV,(二)HCV-RNA定量檢測的臨床意義,2. HCV-RNA載量與抗-HCV滴度、ALT水平之間的相關性。 抗-HCV滴度和ALT異常率隨著HCV-RNA載量升高而增加。,3. HCV-RNA是評價抗病毒治療效果的重要指標。,4. 慢性丙型肝炎長期抗-HCV陽性，這時如果進行HCV-RNA 定量檢測可以鑒別活動性、復制程度。,二常見性傳播疾病病原體,一淋球菌（NGH） 二沙眼衣原體（ CT ） 三解脲脲原體（UU） 四梅毒螺旋體（TP） 五單純庖疹病毒（HSV） 六乳頭瘤病毒（HPV） 七人類免疫缺陷病毒（HIV）,STD,NGH,淋球菌感染與致病,1. 人是淋球菌的惟一宿主

10、。,2. 發(fā)病率最高，在所STD疾病中，高達60%左右。,3. 發(fā)病趨勢： a. 男性多于女性。 b. 城市走向農村， c. 高收入階層向低收入階層擴展,4. 人對淋球菌感染無天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。,5. 如母親為淋病患者，嬰兒出生時易患上淋球菌性結膜炎,CT,沙眼衣原體感染與致病,1. 嚴格的細胞內寄生。,2. 不僅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原體。,3. 近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害 性已超過淋球菌而居STD之首。,4. 在我國，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。,5. 泌尿生殖道感染，妨礙妊娠。,6

11、. 盆腔感染，可致生殖能力損害。,UU,解脲脲原體感染與致病,合成尿素酶，分解尿素,2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率僅次于衣原 體感染，居第二位。,3. 流產超過4次以上者，檢出率高達80%。,4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。,5. 與男性不育相關。男性不育患者精液中，脲原體檢出率高達66.6。檢出率隨精子數減少和精子活動力下降而升高。,1. 非培養(yǎng)或形態(tài)學檢查的診斷技術，快速、特異、敏感。 2. 對無癥狀或癥狀輕者，可以早期確診。 3. 對NGH、CT、UU 等混合感染者，診斷和鑒別診斷。 4. 指導用藥、考核療效。,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,NGH/CT

12、/UU,NGH/CT/UU,熒光定量PCR診斷NGH/CT/UU的意義,5. 不孕不育、優(yōu)生優(yōu)育。 6. 流行病學調查，為性傳播疾病的監(jiān)控提供依據。,,CT、UU、NGH、 HPV、 TP 除NGH可培養(yǎng)外，其余難培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)。 即使能培養(yǎng)，所需時間長48小時。,人乳頭瘤病毒感染與致病,1. HPV具有宿主和組織特異性，只能感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，人是HPV的惟一宿主。 2. 有100多個型。 3. 低危型：HPV 6、11引起良性病變 (尖銳濕疣、喉乳頭瘤等),HPV,人乳頭瘤病毒感染與致病,HPV,4. 高危型：HPV 16、18引起惡性腫瘤 (宮頸癌、 肛門癌、口腔癌等) 5.

13、 免疫原性低，易形成持續(xù)性感染。 6. 新生兒產道感染。,看看這些英年早逝的藝人，她們死于宮頸癌宮頸癌的知曉率在不斷提高。,梅艷芳(40歲),國家一級演員 李媛媛(41歲),HPV,1. 對典型病例可以明確診斷。 2. 對臨床表現和組織病理改變都不典型的病例同樣可以做出診斷。 3. 對亞臨床和隱性HPV感染做出診斷。 4. 基因分型。 5. 考核療效與預后。 6. 病毒載量與患癌癥風險。,HPV,,熒光定量PCR檢測HPV的意義,HPV,三結核桿菌與呼吸道病原體檢測,TB：Tubercle bacilli CP：Chlamydia pneumonia MP：Mycoplasmal pneumo

14、nia SARS：severe acute respiratory syndrome,結核桿菌流行現狀（1）,羅伯特科赫（），德國細菌學家，結核桿菌發(fā)現者 結核病是一個全球性的問題，近年來在世界范圍內出現流行，且呈增長的趨勢,TB,結核桿菌流行現狀（2）,我國結核病的疫情僅次于印度而居世界第二位 2000年，全國人口結核感染率為44.5%，其中1544歲人群占了53 ，每年約有25萬人死于結核病,結核桿菌引起的感染,肺部感染：原發(fā)性肺結核，開放性肺結核。 肺外感染：腦、腎、骨、關節(jié)、生殖結核、腸結核、結核性腹膜炎、全身性結核。,常規(guī)結核病實驗室診斷方法及不足,1. 痰涂片作抗酸染色：陽性率低

15、、費時 2. 細胞培養(yǎng)“金標準”：周期太長(3-4W) 3. 血清學診斷： a. 接種BCG可出現陽性 b. 不能區(qū)分活動性結核病和治愈后留下?lián)p傷灶的病人 c. 交叉反應，假陽性 不能早期診斷！容易漏診、誤診！,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,1. 能穩(wěn)定檢測10copy的TB-DNA ，靈敏度高 ，特異性強 2. 早期、快速、準確地診斷結核病。 痰液、肺及支氣管灌洗液肺結核 血液播散性結核和各臟器的結核病 腦脊液中樞神經系統(tǒng)結核病 宮頸拭子、尿道拭子泌尿生殖道結核病,TB,3. 熒光定量PCR檢出結核桿菌陽性率顯著高于痰涂片抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)法。 4

16、. TB-DNA濃度可用于判斷療效： 痰標本中結核桿菌的數量呈逐漸下降趨勢 ，TB-DNA拷貝數下降。根據病原體DNA濃度，對藥物治療及療效觀察提供參考依據,TB,熒光定量PCR檢測TB-DNA的意義,四TORCH感染特點與檢測,TOX : Toxoplasma gondii RV: Rubella virus CMV: Human cytomegalovirus HSV: Herpes simplex virus,TORCH,TORCH感染特點,1. 母-胎傳播的主要病原體 2. 引起胎兒畸形新生兒缺陷的重要原因 3. 自然狀態(tài)下呈隱性感染 4. 懷孕、多次輸血、AIDS等易

17、發(fā)生顯性感染 5. 可致多發(fā)性、全身性感染 6. 只有風疹可獲得長久的免疫力，可用疫苗預防,TORCH,(一) 弓形蟲感染與致病,滋養(yǎng)體如弓形 ，廣泛分布，人獸共患。 寄生在有核細胞中，貓和貓科動物是終宿主 易感者多，免疫者少 我國智力低下兒的弓形蟲感染率28 畸形兒的弓形蟲抗體IgM陽性率12.25 艾滋病患者約有2080合并弓形蟲感染 ，造成艾滋病死亡的一個重要并發(fā)病,TORCH TOX,人群自然感染率達到60-90%，多為隱性感染 免疫功能低下(懷孕、多次輸血、器官移植、AIDS)發(fā)生顯性感染 可發(fā)生垂直傳播，是宮內感染和胎兒畸形的主要病毒之一 圍生期感染 血、尿、乳汁、精液、分

18、泌物中都可檢出病毒,(二) 人巨細胞病毒感染與致病,TORCH-CMV,風疹是一種世界性的病毒傳染病， 是造成畸胎及先天性疾病的病毒之一 出疹前1周至出疹后5天均有傳染性 人是風疹病毒的唯一宿主 風疹感染后可獲得持久的免疫力，臨床顯性再感染并不多見。,(三) 人風疹病毒感染與致病,TORCH-RV,先天性風疹感染往往發(fā)生在母體初次感染之時，可致先天性風疹綜合癥(CRS) 三聯(lián)癥：白內障、耳聾、心臟病。 妊娠時體內皮質類固醇激素的增加以及細胞免疫功能的減弱，這種對正常人無害的再感染有可能造成病毒蔓延以至影響胎兒。,TORCH-RV,(三) 人風疹病毒感染與致病,HSV原發(fā)感染多為隱性，大多無臨床

19、癥狀或呈亞臨床表現 HSV-1主要引起口唇皰疹，皰疹性結膜炎、腦炎，皮膚性皰疹 HSV-2主要引起原發(fā)性生殖器皰疹 (80%) 。 HSV感染后大多數個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復發(fā)，病毒以潛伏狀態(tài)長期存在宿主體內。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感染與致病,妊娠期婦女因HSV-1被激活，可通過胎盤感染胎兒，引起胎兒畸形、智力低下、流產等。 圍產期感染可引發(fā)新生兒皰疹，死亡率高達50%以上。 HSV常與HIV-1同時感染，并能促進病情發(fā)展，引起嚴重的局部和播散性感染。目前認為HSV是一種調節(jié)因素，能激活HIV復制 與宮頸癌關系密切。,TORCH-HSV,(四) 人單純皰疹病毒感

20、染與致病,常規(guī)TORCH檢測方法與不足,組織培養(yǎng)或病原體分離：慢，費力，陽性率低。 血清學診斷： IgG： 人群自然感染率高達60-90%。 IgG()不能區(qū)別既住感染與現癥感染； 新生兒IgG()不能說明有感染。 IgM： IgM()可能是原發(fā)性感染； IgM()不能排除感染。,TORCH,局限性： 1. 不能定量分析 2. 抗體的產生受多種因素的影響 3. 交叉反應，假陽性,熒光探針檢測TORCH的優(yōu)勢,原理：直接檢測TORCH病原體的核酸 優(yōu)點：靈敏、快速，特異 意義：早期診斷，婦幼保健、優(yōu)生優(yōu)育 1. 篩選TORCH患者，提高出生人口素質。 2. 有利于預測胎兒宮內感染狀況及

21、妊娠結局。 3. TORCH感染孕婦的治療效果觀察。 4. 器官移植、免疫系統(tǒng)疾病等病人監(jiān)控。 5. 建立TORCH的分子診斷標準,TORCH,TORCH,,TORCH檢測核酸與檢測標本的比較,檢驗結果解析,HBV--DNA定量結果 定量測定，測定的是病毒量的“多”或“少”； 結果報告方式： 多少？，<多少？具體值？,舉例,例如：試劑盒檢測范圍是103108IU/ml,我們測定的陰性結果應報告 103 IU/ml；（無、含量低）。中間值報告具體數據；當含量高于最高檢測限時，報告108 IU/ml。 （ 108 IU/ml； 109 IU/ml ..） 參考范圍?,,IU/ml與COP/m

22、lD的換算---咨詢廠家 3.5E+05 IU/ml----表示一毫升血清中有350，000個HBV病毒微粒。,HBVDNA的變化,在患者治療過程中檢測HBVDNA定量，一般認為：其結果相差5倍屬正常波動，結果相差降低10倍以上才算治療有效。,例如1,有一患者治療前檢測HBV-DNA定量為8.8E+06 IU/ml，治療一月后復查為2.3E+07 IU/ml，兩結果相差2.6倍。（不一定是高了？） 如何向病人解釋： 屬正常波動或者檢測誤差（允許誤差）,例如2,一患者治療前檢測HBV-DNA定量為9.2E+06 IU/ml；治療一月后復查為2.8E+06 IU/ml，兩結果相差3.3倍，不能說明治療有效，需要繼續(xù)觀察。要有明顯的下降趨勢。,檢驗報告單結果讀取,3.637E+06 檢測下限: 1000拷貝/毫升 3.637106 1.000E+03 copy/ml,如果是標本量是可以定量的，如血液、腦脊液等，則檢測結果報告為：copy/ml 如果是標本量不能定量，如分泌物等，則結果只能報告為：copy,Thank You !,