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1、發(fā)酵車間消毒培訓,焦江濤,車間培訓課件 焦江濤,一、消毒與滅菌,消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均廣泛應用。 1、消毒：。是指用物理或化學的方法殺死物體上的病原微生物，一般只能殺死營養(yǎng)細胞而不能殺死細菌芽孢。 2、滅菌：是指用物理或化學的方法殺滅或除掉傳播媒介上的所有微生物（包括芽孢），使之達到無菌程度。在生產上習慣叫做消毒但它與消毒是的嚴格意義上的區(qū)別。,車間培訓課件 焦江濤,二、滅菌方法 滅菌的方法主要有：干熱滅菌法、濕熱滅菌法、化學藥品滅菌法、過濾除菌法、過濾除菌法。根據(jù)滅菌的對象和要求選用不同的方法。 1 干熱滅菌法 干熱滅菌法是指在干燥高溫條件下，將微生物殺死。干熱對微生物有氧化、蛋白質

2、變性和電解質濃縮引起中毒的作用，其中氧化作用是主要的。干熱滅菌必須高溫，工業(yè)生產中采用的條件是攝氏160，1h。主要使用于需要保持干燥的器械、容器的滅菌。生產實例：在接種操作和鏡檢涂片時用的灼燒滅菌法就是最簡單的干熱滅菌法，在投罐前的空消（125、30min)也屬于干熱滅菌，,車間培訓課件 焦江濤,所以在空消之前必須先把PH、溶氧電極拔掉，否則會大大削減其使用壽命。 濕熱滅菌法 濕熱滅菌是借助蒸汽釋放的熱能和水的參與，能使微生物細胞中蛋白質、酶、核酸分子內部的化學鍵（特別是氫鍵）受破壞，特別是蛋白質發(fā)生不可逆的凝固性變性，使微生物死亡。蒸汽在冷凝時釋放出大量潛熱，具有強大的穿透力，尤其適用

3、于大量培養(yǎng)基及發(fā)酵設備的滅菌。 溫熱滅菌與干熱滅菌相比具有以下特點： (1)濕熱滅菌時，菌體蛋白質吸收熱量容易變性凝固； (2)濕熱的穿透力比干熱大（如表1所示） (3)蒸汽冷凝時放出大量潛熱，溫度上升快； (4)蒸汽制取簡便、成本低、數(shù)量大，適于工業(yè)生產。,車間培訓課件 焦江濤,,,,高溫滅菌也會給培養(yǎng)基帶來一些不利影響，所以在生產中就要求我們在實消時一定要嚴格按工藝要求來控制實消的溫度和時間。超溫超時對培養(yǎng)基的破壞主要有兩種情況：一造成培養(yǎng)基成分相互作用；二造成熱穩(wěn)定性差的原材料嚴重破壞。前者在降低培養(yǎng)基質量的同時還會引起培養(yǎng)基褐變、沉淀，褐變反應包括類黑色素褐變 （主要是氨基化合物與羰

4、基化合物在加熱條件下生成棕紅色的色素），焦糖化褐變（糖在沒有含氨基化合物存在下，加熱到其熔點逐步形成焦糖），糖類破壞后易和有機氮源結合，產生氨基糖，,車間培訓課件 焦江濤,對微生物產生一定的毒性，嚴重時將抑制微生物的生長發(fā)育破壞整個發(fā)酵所以在一、二步種子罐時，一旦發(fā)現(xiàn)料液發(fā)黑會發(fā)現(xiàn)其菌量很少，產糖或產酸會大受抑制甚至造成代謝停滯，嚴重時不得不倒罐。沉淀主要是在加熱情況下，培養(yǎng)基中的鈣鐵離子等成分易與磷酸鹽碳酸鹽發(fā)生反應生成無機物沉淀和無機物如多肽類沉淀。后者會使玉米漿和酵母膏中的微量元素、蛋白質及糖類遭到破壞，通常解決方案 如下：分開滅菌。對培養(yǎng)基中糖類等不耐高溫的成份與培養(yǎng)基其它成分分開滅菌

5、，冷卻后再混合比如我們的二步糖采取流加而不是放在一起實消；將培養(yǎng)基中的鈣鐵等離子成分與磷酸鹽分別滅菌可以避免發(fā)生沉淀反應低溫滅菌，低溫滅菌幾乎對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分沒有破壞。如我們一步的糖。培養(yǎng)基在達到完全滅菌時，滅菌溫度和滅菌時間對維生素C培養(yǎng)基養(yǎng)分破壞的比較：,車間培訓課件 焦江濤,,車間培訓課件 焦江濤,3 化學藥品滅菌法 一些化學藥品易與微生物細胞中的某種成分產生化學反應，如使蛋白質變性、酶類失活，破壞細胞膜透性而殺死微生物。根據(jù)滅菌對象不同有浸泡、添加、擦拭、噴灑、氣態(tài)熏蒸等。如我們車間環(huán)境消毒用的濃度為1%--0.25%的高錳酸鉀溶液或0.25%的漂白粉，發(fā)酵罐發(fā)酵至終點前加入0.

6、25%的新潔爾滅和染菌后加入0.15%--0.17%的甲醛熏蒸、加入5%的氫氧化鈉浸泡，進入無菌室操作前人雙手用75 %的酒精消毒。 三 投罐前的幾點注意事項 發(fā)酵是否成功，很大程度上決定于準備工作，以下幾點須注意： 1、清洗發(fā)酵罐，特別要注意死角的洗刷和與外界接觸的零部位的清洗，清除罐底上批料的堆積物。 2、檢查取樣閥的密閉性有無關不嚴或滑絲現(xiàn)象，罐體、法蘭、軸封、移種閥、移糖閥、視鏡等有無滲漏、穿孔、堵塞、死角等情況，并用肥皂水或洗衣粉水嚴格試漏。隔膜閥更是要定期拆檢。,車間培訓課件 焦江濤,3、有機械攪拌裝置的發(fā)酵罐一定要擦干軸封支承內的積水，氣升式發(fā)酵罐的罐頂部和視鏡處要經常保持干燥清

7、潔。 4、檢查沖視鏡管是否暢通，沖視鏡閥是否內漏，發(fā)現(xiàn)問題要徹底處理。 5、檢查罐上的儀表指針的靈敏度，是否歸零顯示有無偏差。 6、檢查與罐上相連接的螺絲是否有脫絲現(xiàn)象，破舊的及時換新 四消毒過程中的注意事項 1、首先要結合配料工共同確認本批罐所用的原料為合格品，發(fā)現(xiàn)有結塊、變質的原料拒絕使用。,車間培訓課件 焦江濤,2、在用泵向罐中打配制好的培養(yǎng)基時要注意保持稍開些進氣，讓料翻騰，以防（前期）培養(yǎng)基濃度過大沉淀粘附在罐底。 3、打完料后首先調至適宜的PH，再確認一下所有的培養(yǎng)基都已加入后封住罐口，開始從進氣口、放料口、取樣口等分路進入蒸汽。各路保持均衡進汽，防止短路 和堵塞，排氣要暢通，排

8、汽量不宜過大，以節(jié)約蒸汽。 4、在實消過程中要保持壓力的穩(wěn)定，不宜突然卸壓升壓以防造成大量泡沫冒頂或逃料。 5、在實消控制時原則上以溫度為準，壓力為輔。但是在保壓時可能出現(xiàn)壓力表與溫度計不對應的情況， 在不能確定到底是溫度計還是壓力表失靈時，當壓力表顯示壓力大于等于0.1Mpa,而溫度,車間培訓課件 焦江濤,不到121時，以溫度計為準；反之，則以壓力表為準 ，總之要確保壓力與溫度都達到滅菌要求。 6、如遇蒸汽壓力突然升高，罐溫超過規(guī)定，可適當縮短滅菌時間；如遇蒸汽壓力突然下跌，一時上不來，溫度下降到規(guī)定范圍以下，可適當延長滅菌時間，以確保滅菌徹底。嚴防高溫高壓悶罐，否則容易造成培養(yǎng)基成分破壞和

9、PH值升高。 7、在實消結束降溫時在確定空氣過濾器的壓力大于罐壓時，可以先打開空氣進氣閥，再開冷卻水閥以防外界空氣倒吸進去。 8、在降溫過程中嚴防大開排氣閥使罐壓幾乎跌零，特別是種子罐裝料系數(shù)較大，這樣做會使料液翻騰劇烈產生大量的泡沫，易出現(xiàn)冒頂或逃料。 9、在消移種管道時要確保整個管道打氣暢通，嚴防堵塞,車間培訓課件 焦江濤,或排氣不暢。在消好后，通入無菌空氣（即給管道降溫又能使管道內保持正壓）。 10、移種結束后要把發(fā)酵罐調至正常培養(yǎng)狀態(tài)并交給看罐工，打掃完現(xiàn)場衛(wèi)生后方可離開。 五、染菌原因分析 發(fā)酵工業(yè)自從采用純種培養(yǎng)以后，產率有了很大提高，然而防止染菌的要求也更高了。染菌是發(fā)酵工業(yè)的

10、致命傷，輕者影響產率、提取收率、產品質量和三肇廢治理，嚴重者造成倒罐，浪費大量原材料，造成嚴重經濟損失，而且擾亂生產秩序，破壞生產計劃。 在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結發(fā)酵染菌的經驗教訓，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重要措施。 （一）不同染菌時間對發(fā)酵的影響 1、種子培養(yǎng)期染菌,車間培訓課件 焦江濤,種子培養(yǎng)主要是生長繁殖菌體，菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，比較容易染菌，帶進發(fā)酵罐中危害極大，應嚴格控制種子污染。當發(fā)現(xiàn)種子染菌均應滅菌后倒入地溝，并對種子罐、管道進行檢查和徹底滅菌。 2、發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前期主要是菌體生長繁殖，代謝產物較少，這個時期容易

11、染菌，一旦污染雜菌會迅速繁殖，與生產菌爭奪營養(yǎng)成分和氧分，嚴重干擾生產菌的生長繁殖和產物的生成，要特別防止發(fā)酵前期染菌。緊急處理措施：如果污染危害較大的雜菌不能繼續(xù)運轉，必須重新滅菌。重滅前可適當放出部分發(fā)酵液，并補入適量的培養(yǎng)基特別是氮源使消后的培養(yǎng)基符合發(fā)酵要求，低滅后調節(jié)好PH后重新移種或倒種。,車間培訓課件 焦江濤,如果污染的雜菌無大的影響，可以繼續(xù)運轉，但要密切注意發(fā)酵過程的代謝情況和雜菌的變化，必要時可適當降低罐溫、空氣流量、和控制補料量進行發(fā)酵。 3、發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌將嚴重干擾生產菌的代謝，影響產物的生成。有些雜菌繁殖后產生酸性或堿性物質，使PH值異常變化加堿突增或驟減

12、，糖、氮消耗迅速，菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘或渾濁，產生大量泡沫，代謝產物的積累迅速減少或停止或下降，有的發(fā)酵液發(fā)臭。發(fā)酵中期染菌，由于營養(yǎng)成分大量消耗，一般挽救處理困難，危害性很大常用的方法有：降低罐溫，控制殘?zhí)橇浚档涂諝饬髁炕蚶渲么?。對于這種罐批在核算提取成本和一定濾速（一般不低于5ml/5min)時放罐，否則難以過濾，增大提取工作量甚至無法過濾而放棄。如果中期染的某些,車間培訓課件 焦江濤,雜菌不太嚴重情況，可以采取補加抑菌劑的辦法控制雜菌的生長繁殖，如二步發(fā)酵染酵母菌可加4--5.6kg的硫酸銅抑止酵母生長，革蘭氏陽性菌對青霉素和磺胺類抗生素敏感而陰性菌則不敏感，革蘭氏陰性菌對鏈霉素、氯

13、霉素和四環(huán)素等敏感而陽性菌則不敏感。霉菌發(fā)酵中染細菌可加入適量的青霉素來殺滅細菌。 4、發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期產物積累較多，糖等營養(yǎng)物質接近耗盡，如果染菌不太多，可繼續(xù)進行發(fā)酵；如污染嚴重，破壞性較大，可以采取提前放罐。,車間培訓課件 焦江濤,（二）不同染菌規(guī)模的原因分析 1、當發(fā)酵出現(xiàn)連續(xù)染菌或大面積染菌，一般是公用系統(tǒng)有問題，特別是空氣系統(tǒng)?？偪者^濾器失效可效率下降，新裝的空過要避免因為介質移位或翻動而造成空氣走短路。 接種和中間補糖設備系統(tǒng)有滲漏和死角，也會造成大面積染菌因此要按時檢查維修相關設備。 2、部分發(fā)酵罐染菌，發(fā)生在前期可能是滅菌不徹底或種子罐帶菌所致，同時也與公用接種設備系

14、統(tǒng)有關；染菌發(fā)生在中后期，一般與補料、加堿有關。 3、個別罐連續(xù)染菌時要檢查該罐設備的各個部件，查找有無滲漏和死角，如降溫盤管穿孔是造成染菌的多見原因之一。個別罐批偶爾染菌，原因比較復雜，要針對具體情況，視染菌時間和染菌類型，從操作到設備作具體分析。,車間培訓課件 焦江濤,（三）從染菌類別上分析原因 1、染革蘭氏陽性桿菌、酵母菌等其它雜菌多是由空氣系統(tǒng)中帶入而造成污染也有可能是種子帶菌 2、染革蘭氏陰性桿菌、特別是球菌大多數(shù)因設備滲漏所致，帶菌的冷卻水或污水，從冷卻盤管、連接法蘭、襯里焊縫中滲漏進入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。 3、染耐熱的芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底但并不是絕對的，空氣帶菌也常

15、引起染芽孢桿菌； 4、染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題 六、染菌的途徑和防治 （一）種子帶菌及其防治 種子帶菌的原因： 1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底 菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進行，造成滅菌不徹底主要是滅菌時鍋內空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時溫度還達不到要求。,車間培訓課件 焦江濤,2、菌種在移種過程中受污染 菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進行的。當菌種移接操作不當或管理不嚴，就可能引起污染。 3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染 菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進入，也使雜菌進入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應有一定的緊密度，不宜太松，且有一定的長度，培

16、養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。在放入搖床后要經常去檢查種母搖瓶的狀況。 （二）無菌空氣帶菌及防止 空氣凈化系統(tǒng)失效或空氣精過、預過減效是發(fā)酵染菌的主要原因之一。具體防止措施：定期更新主空氣系統(tǒng)的過濾介質，加強平時系統(tǒng)的排污除水,車間培訓課件 焦江濤,特別是在多雨或潮濕的天氣。確保進入車間之前的空氣升溫至35--45，使相對 濕度下降，定時拆檢空氣精過、預過。 （三）培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底帶菌及防止 培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個方面有關 1、原料形狀 一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而含有固體顆?；蛘吵頎钗锪蠒r容易由于滅菌不徹底而造成染菌。這就要求在投料時確保攪拌混合均勻。 2、實消時

17、未充分扣除罐內空氣 實消時罐內空氣未完全排除造成假壓，使罐頂空間局部溫度達不到滅菌要求，導致滅菌不徹底而污染。因此在實消升溫時，應打開排氣閥門及有關,車間培訓課件 焦江濤,連接管的邊閥、罐頂部的接管邊閥，使蒸汽通過達到徹底滅菌。 3、設備管道存在死角染菌及防止 由于操作、設備結構、安裝或人為造成的屏障等原因，引起蒸汽不能到達預定部位，這就是死角。所以發(fā)酵罐要合理簡化安裝管、閥。凡不合理的管、閥、開孔都要堅決去掉，遺留的孔眼要焊平，消除隱患。管道之間盡可能用焊接來代替法蘭，不能用直角彎頭，要保持管道暢通、光滑、密封。主要閥門及其墊應經常檢查更換。 4、設備滲漏引起染菌及防止 發(fā)酵設備、管道、閥門

18、的長期使用，由于腐蝕、摩擦、振動或憋壓等原因，往往會造成滲漏。例如：,車間培訓課件 焦江濤,設備的表面或焊縫處有砂眼，由于腐蝕逐漸加深，最終導致穿孔；冷卻管受攪拌器作用，長期磨損，焊縫處受冷熱和振動產生裂縫而滲漏。防止措施：要選用優(yōu)質材料并經常檢查，小滲漏不易發(fā)現(xiàn)時可壓入堿性水，在可疑的地方用浸濕的酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時白布顯紅色。 5、操作問題 在發(fā)酵過程中如操作不當也引起染菌，如移種時或發(fā)酵培養(yǎng)時罐內壓力跌零，使外界空氣進入而染菌；泡沫冒頂而造成染菌；壓縮空氣壓力突然下降使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成染菌等等；防止措施：加強對一線操作人員的無菌操作培訓和始終貫徹無菌操作制度及責任心

19、教育，加強管理措施。,車間培訓課件 焦江濤,（四）、環(huán)境衛(wèi)生 發(fā)酵車間和菌種室的內外環(huán)境，必須保持干凈整潔，定期清掃和消毒，車間周圍不得堆放廢棄物，不允許有活菌排放，有異味或易飛揚的物料的貯存，應遠離發(fā)酵車間和菌種室。 七、染菌的檢查 （一）感官檢查 1、大部分染菌的發(fā)酵液可以從發(fā)酵的異常情況來檢出，如色澤、異味、變稠或變稀、加堿速率、菌絲變形產酸不正?；虿划a酸或倒酸而糖卻消耗很快。 2、借助顯微鏡，常用梅蘭染色、結晶紫染色和革蘭氏染色來判斷。 （二）、無菌平皿劃線檢查 平板檢查法既可檢查出雜菌污染，又可以檢查出有無噬菌體污染。檢查雜菌時，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒入已經滅,車間培訓課件 焦江濤,菌的培養(yǎng)皿內，冷卻后置于37恒溫箱內培養(yǎng)24小時，進行鏡檢。或者將待檢樣品置于37培養(yǎng)6小時，使細菌生長，增加數(shù)量，然后再劃線接種培養(yǎng)。這樣可以提高平板法的靈敏度。 （三）肉湯培養(yǎng)檢查法 主要用于空氣系統(tǒng)和培養(yǎng)基染菌的檢查。具體的做法是將培養(yǎng)液裝在吸所瓶中，滅菌30分鐘后，置于37培養(yǎng)24小時，如無混濁即可用于上述兩項的檢查。將無菌空氣或滅菌后的培養(yǎng)基引入后保溫培養(yǎng)，觀察有無混濁現(xiàn)象發(fā)生，如呈現(xiàn)渾濁說明染菌 八、染菌的后續(xù)處理 染菌查找到原因后，對罐徹底清洗干凈，加入甲醛,車間培訓課件 焦江濤,空消,