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1、實時定量PCR（qRT-PCR）,實時定量PCR（qRT-PCR）,Polymerase Chain Reaction（PCR）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),偉大的天才發(fā)現(xiàn)！,Kary B. Mullis,,1989年美國Science雜志列PCR 為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。,,PCR的基本原理,PCR的基本原理,,模板DNA,,引物1,引物2,PCR的基本原理,,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,第1輪結(jié)束,第2輪開始,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程

2、PCR的特點,,,,,,,,,,,,Taq,Taq,Taq,Taq,,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,,,,,,,,,,,,第2輪結(jié)束,PCR基本原理,,,,,,,,,,,,Mg2+,模板,引物,dNTP,DNA 聚合酶,PCR,PCR反應(yīng)基本要素,1、單、雙鏈DNA，cDNA均可 2、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑DNA結(jié)合蛋白類 3、一般100ng DNA模板/100L,模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加,（1）模板,1、引物濃度一般為0.1-0.5 mol/L，濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降 2、引物的設(shè)計,（2）引物,（

3、3）Taq DNA聚合酶,1、酶的用量一般為0.5-2.5 U/50 l， 2、酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。,（4）Mg2+,1、Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，一般用量為0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。 2、Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 3、Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,1、dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 2、四種dNTP濃度應(yīng)相等 3、濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量 4、dNTP可與Mg2+結(jié)合，使

4、游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,（5）dNTP,變性 使雙鏈DNA解鏈為單鏈,94 30-40s 退火 溫度由引物長度和GC含量決定。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。,循環(huán)參數(shù),（3）延伸 68-75,一般為72 延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定 （4）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度,一般為25-35次 次數(shù)過多,擴(kuò)增效率降低,錯誤摻入率增加,常用PCR反應(yīng)體系 (以HiFi Taq為例),模板 1.0 L 上游引物 0.5 L 下游引物 0.5 L 10X HiFi Buffer（+Mg2+） 2.

5、5 L dNTPs 2.0 L HiFi Taq酶 0.2-0.3 L ddH2O 補(bǔ)足25 L 共 25 L,常用PCR反應(yīng)條件,94 2-5min 94 30-40s Tm 30-45s 72 1min/1kb 72 10min 12 +,,25-35個循環(huán),幾種常用PCR技術(shù),RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 反向PCR (Reverse PCR) RACE (Rapid-Amplification of cDNA Ends) qRT-PCR (Quantitative Real Time

6、 PCR),,,,,基因,,,,,mRNA,,,蛋白質(zhì)多肽鏈,RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄PCR),DNA水平,RNA水平,蛋白水平,RT-PCR基本原理,TTTTTTTTTTT,,,Reverse Transcription,,TTTTTTTTTTT,,cDNA,RT-PCR一般步驟,1、RNA提取,RNA質(zhì)量的檢測 一般RT-PCR要求提取的RNA要有較高的完整性和純度,完整性檢測（1%瓊脂糖膠電泳） 純度檢測（OD260/280） OD260/280一般介于1.9-2.1之間，小于1.9時蛋白污染；大于2.1時RNA發(fā)生降解,2、反轉(zhuǎn)錄,RT-PCR一般步驟,在冰盒上加入以下試劑：,,體系配

7、制完成后瞬時離心，70反應(yīng)5min,然后迅速轉(zhuǎn)移至冰盒，冰浴2-5min,此步驟的作用是去除mRNA的二級結(jié)構(gòu)。,RT-PCR一般步驟,1、混勻，42，90min 2、70，10min，終止反應(yīng) 3、A3檢測,在冰盒上加入以下試劑：,反向PCR (reverse） PCR),,,,已知序列,未知序列,未知序列,,,反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,,,,,,已知序列,未知序列,未知序

8、列,,,限制酶,限制酶,,,,,,,,連接酶,,反向PCR原理,cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)是一種基于PCR技術(shù)從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA 的5和3末端的有效方法,以其簡單、快速、廉價等優(yōu)勢而受到越來越多的重視。,RACE (rapid-amplification of cDNA ends),,RACE,3RACE原理,,Oligo dT,,,,,5RACE原理,qRT-PCR (Quantitative Real Time PCR),通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控

9、反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進(jìn)行分析,計算待測樣品的初始模板量。,內(nèi)摻式染料 SYBR Green I 序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET),引物特異性探針 Amplifluor (Intergen),1、SYBR Green 法,SYBR Green 工作原理,SYBR Green法優(yōu)缺點,融解曲線（dissociation curve）,正常,有非特異性擴(kuò)增,2、TaqMan探針法,,作用機(jī)理,TaqMan,TaqMan法與SYBR Green I的比較,,幾個重要概念,,,,基線（Baseline）,熒光閾

10、值（threshold）,熒光閾值（threshold）是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。熒光域值是PCR315個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。,Ct值（ threshold value ）,每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 Ct 值。 研究表明，各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。反之亦然。,定量PCR的數(shù)學(xué)原理,熒光定量PCR的解析方法,相對定量,內(nèi)參基因,,,目的基因,,,1

11、,2,0.2,內(nèi)參基因,內(nèi)參基因：qRT-PCR時，每個標(biāo)本都要做對應(yīng)的內(nèi)參，而且每次都是管家基因，一般用-actin，有時也用GAPDH。 管家基因：又稱持家基因(house-keeping genes)生物體各類細(xì)胞中都表達(dá)，其產(chǎn)物是對維持細(xì)胞基本生命活動所必需的蛋白質(zhì)編碼的基因。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因與核糖體蛋白基因等。是為維持細(xì)胞基本生命活動所需而時刻都在表達(dá)的基因。,內(nèi)參基因的選擇,理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件： 1、不存在假基因，以避免基因 DNA的擴(kuò)增 2、高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá) 3、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞），而且其表達(dá)量是近似的，無顯著

12、性差別 4、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān) 5、其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似 6、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響,常用內(nèi)參基因,家蠶常用內(nèi)參基因,Actin3 GAPDH sw22934,數(shù)據(jù)處理（Ct法）,qRT-P C R的優(yōu)點及限制因素,qRT-PCR不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有操作簡便、快速高效、敏感性高、特異性強(qiáng)、有效解決了PCR污染的問題、自動化程度高等特點,優(yōu)點,qRT-PCR限制因數(shù),實驗費用昂貴，需要設(shè)置多組重復(fù)和對照 怎樣避免擴(kuò)增基因組DNA、如何消除和評定由于樣品處理、儀器的差異和個人操作而帶來

13、的誤差以及如何更準(zhǔn)確定量基因？ 值得指出的是，qRT-PCR只能定量mRNA水平，但mRNA水平可能不能反映細(xì)胞中蛋白水平，因為在轉(zhuǎn)錄后還有諸多調(diào)節(jié)因素。 要準(zhǔn)確而全面的了解機(jī)體的表達(dá)水平，除了分析mRNA水平外，還需要免疫組織化學(xué)和生物化學(xué)實驗的數(shù)據(jù)。,更多關(guān)于qRT-PCR的信息，請參照：,引物設(shè)計,常用引物設(shè)計軟件：primer Premier，Oligo 序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無同源序列 引物長度：17-25bp 堿基盡可能隨機(jī)分布, GC%：40%-60% 盡量避免錯配（False Priming)、引物二聚體(Dimer)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）,常規(guī)PCR引物設(shè)計,引物設(shè)計,qRT-PCR引物設(shè)計,引物長度：17-25bp GC%: 40-60% Tm:60（Primer Premier 5.0） 產(chǎn)物長度：80-300bp,100-200bp最佳,