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1、植物體細胞雜交,周有文,主要內容,體細胞雜交研究歷程及一般概念,體細胞雜交的一般流程,雜交細胞的鑒定及相關應用領域,細胞雜交的相關文獻,4,1,2,3,我們從以下幾方面來探討植物體細胞雜交技術。,,發(fā)展歷程,70年代，技術建立和完善優(yōu)化 1972年獲得煙草種間體細胞雜種 1975年高Ca高pH加PEG融合方法，電融合法 大量成功報道，不少為異想天開的實驗 80年代初，由模式植物轉向農作物/經(jīng)濟作物，對稱融合到非對稱融合，創(chuàng)造新種質的技術手段 80年代末，大量木本植物細胞融合成功的報道 90年代至今，成為一種育種手段,,植物體細胞雜交的幾個重要進展,1960年，Kocking用酶法制備高等植物原

2、生質體首次獲得成功； 1971年，Takebe首次從離體煙草原生質體培養(yǎng)中獲得再生完整植株； 1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這是第一個植物體細胞雜種； 1974年，Kao將聚乙二醇（PEG）誘導融合法應用于植物細胞融合并建立了相應的融合技術； 1978年，Melchers獲得第一個屬間體細胞雜種（番茄馬鈴薯）； 1981年，Zimmerman發(fā)明了電融合儀，并首次提出了電融合概念； 1987年，Schweiger建立了單對原生質體電融合技術程序。,體細胞雜交的一般概念,體細胞雜交，即原生質體融合，將兩個不同親本的原生質體，經(jīng)人工誘導融合并培養(yǎng)再生成株的過程，統(tǒng)

3、稱為體細胞雜交（A + B）。,,根據(jù)概念，在理論上任何細胞都可能通過體細胞雜交而成為新的生物資源。這對于種質資源的開發(fā)和利用具有深遠的意義。 融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑。 體細胞雜交產生的雜種細胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產生新的核外遺傳系統(tǒng)。,體細胞雜交與有性雜交的異同,幾種不同的表述：,體細胞雜交：Somatic hybridization 細胞融合：Cell fusion 原生質體融合：Protoplast fusion 無性雜交：asexual

4、hybridization 超性雜交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 細胞操作：Cell manipulation 細胞工程（Cell engineering）,體細胞雜交步驟：,1 原生質體的制備 2 原生質體的融合 3 雜種細胞選擇 4 雜種細胞培養(yǎng) 5 由愈傷組織再生植株 6 雜種植株的鑒定,植物體細胞雜交技術的過程：,,,雜交的兩個細胞,,再生細胞壁,雜種細胞,脫分化,再分化,（植物體細胞融合完成的標志）,植物細胞融合,植物組織培養(yǎng),植物細胞A,植物細胞B,,去壁,去壁,原生質體A,原生質體B,,融合,融合的原生質

5、體AB,,再生細胞壁,雜種細胞AB,脫分化,,,愈傷組織,雜種植株,再分化,,,植物細胞融合,,植物組織培養(yǎng),植物體細胞雜交,怎樣才能去除細胞壁但又不破壞細胞的生命活性呢？,酶解法,融合的原理及常用的融合方法？,物理方法：離心、振蕩、電刺激 化學方法：聚乙二醇（PEG）,,融合可能的類型？ 怎樣篩選雜種細胞？,植物體細胞雜交成功的標志是什么？,,利用雜種細胞獲得雜種植株所依據(jù)的原理？,植物細胞具全能性,酶的 專一性,生物膜的 流動性,獲得的雜種植株是否能表現(xiàn)出人們所期望的性狀？,雜種植株的鑒定,雜交細胞的篩選,細胞融合的方法及步驟,,,,聚乙二醇 PEG）,,化學方法,細胞融合流程,,仙臺

6、病毒 (Sendai virus),自發(fā)融合 在酶解細胞壁的過程中，有些相鄰的原生質體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個同核體包含240個核。 形成的原因：由不同細胞間胞間連絲的擴展和粘連造成的。 減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細胞受到強烈的質壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。,,NaNO3處理,高PH-高濃度Ga2+,飛秒激光誘導融合,電融合芯片,空間細胞融合,原生質體融合的有關名詞,對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質均為100%） 非對稱雜種（雙親給雜種貢獻的遺傳物質不等（相對值） 胞質雜種（cytoplasmic hybrid, Cybrid）：細胞質

7、重組，細胞核未重組 對稱融合（symmetric fusion） 也稱標準融合（Standard fusion） 非對稱融合（asymmetric fusion）：融合前對一方進行處理，使其染色體丟失一部分,原生質體融合的有關名詞-II,供-受體融合：Donor-recipient fusion 體配融合（gameto-somatic fusion）（性細胞與體細胞融合） 亞原生質體-原生質體融合： Subprotoplast-protoplast fusion 小原生質體：Miniprotoplast 微原生質體：Microprotoplast 胞質體：Cytoplast 胞質體

8、-原生質體融合: Cytoplast-protoplast fusion,微原生質體融合,植物微原生質體融合是在此基礎上發(fā)展起來的將一種植物的一條或幾條染色體轉移到另一種植物中的新的非對稱原生質體融合的方法。 其原理是采用適當濃度的微核誘導劑，包含DNA合成抑制劑和紡錘體毒素兩大類，常用的如秋水仙素(COL)、安磺靈(oryzalin)、草胺磷除草劑(eremart)、甲基氨草磷(ApM)、甲氨喋吟(MTx)、氯苯胺靈(CIPC)等。 這些藥劑可使正在分裂的植物細胞停留在有絲分裂中期，數(shù)小時后，染色體解開螺旋，形成內含多個微原生質體的微核化細胞，每個微原生質體內含有一條或幾條染色體，由于有絲分

9、裂停留在中期，每條染色體的兩個姐妹染色單體仍在一起，著絲點不分開。通過酶解去掉微核化細胞的細胞壁獲得微核化原生質體，再用離心等技術分離出帶有一條或幾條染色體的微原生質體，誘導其與完整的受體原生質體融合，從而實現(xiàn)部分基因組的轉移。 微原生質體融合主要包括3個步驟:微原生質體誘導、分離以及富集、微原生質體融合和植株再生。,,微核是細胞的染色體發(fā)生斷裂后,細胞進入下一次分裂時,染色體片段不能隨有絲分裂進入子細胞,而在細胞漿中形成直徑小于主核的,嗜色與主核一致,完全與主核分開的圓形或橢圓形微小核 ，位于細胞漿中獨立于主核的核小體，其染色同主核，但比主核淡，其直徑小于主核1/3，主要由外界損害因素(生物

10、、物理、化學)作用細胞后，導致細胞染色體丟失或斷裂，從而在胞漿中形成1個或數(shù)個小核。,根據(jù)融合時細胞的完整程度，原生質體融合可分為兩大方式：,對稱融合（symmetric fusion）即兩個完整的細胞原生質體融合。 非對稱融合（asymmetric fusion）利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再進行融合。,1.PEG誘導融合法 【Polyethylene glycol （PEG）】,PEG誘導融合的特點：優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。 PEG作用機理： Kao等認為，由于PEG分子具

11、有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果使原生質體發(fā)生粘連進而促進原生質體融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。,在細胞工程中普遍認為聚乙二醇（PEG)分子能改變各類細胞的生物膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發(fā)生融合，從而形成雜種細胞，培養(yǎng)該雜種細胞（細胞質雜種）可以獲得一些特殊的雜種植株。,PEG融合所需試劑,融合液：pH 5.6 CaCl2 2H2O 810mmol KH2PO4

12、 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.51.0mol 誘導液：融合液PEG 2045 稀釋液： A液（g/100ml）pH6.0 B液 (g/100ml) pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2 2H2O 0.79 NaOH 0.169,一般PEG融合細胞流程,NaNO3處理,1909年，Kuster在一個發(fā)生了質壁分離的表皮細胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個亞原生質體的融合。 缺點：異核體(heterokaryon)形成頻率不高。,高PH-高濃度鈣離子處理,1973年，Keller和Melchers，用強堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子

13、（50mmol.L-1)溶液在37下處理約30min，兩個品系的煙草葉肉原生質體很容易融合。 但對于有些原生質體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。,電融合儀的結構特點： 交變電場部分 高頻直流電擊部分,電融合的基本過程：,細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串； 膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起并圓球化。,關于融合參數(shù)：,交流電壓 交變電場的振幅頻率 交變電場的處理時間 直流高頻電壓

14、脈沖寬度 脈沖次數(shù),細胞電融合過程中,細胞排隊、電穿孔和電融合過程都是在一定的電壓條件下完成的。因此,選擇合適的電壓信號成為了細胞電融合過程的關鍵所在。與電壓信號相關的參數(shù)有:電壓波形、電壓幅值、電壓頻率和電壓持續(xù)時間。,飛秒激光誘導細胞融合技術,在實驗中,飛秒激光的中心波長為810 nm,脈沖重復頻率100 MHz,脈沖寬度為40 fs,作用在被融合細胞上的平均功率為55 mW。 首先使用葡聚糖酶去掉酵母細胞壁,制成原生質體。在細胞融合之前加入體積分數(shù)為10%的聚乙二醇(PEG)和0.02 mol/L的CaCl2溶液,促使原生質體細胞聚集并緊密接觸。選定緊密接觸的原生質體細胞對,調整載物臺

15、,使飛秒激光聚焦在質膜緊密接觸的區(qū)域,通過光快門控制融合細胞被輻照時間。實驗采用0.25 s的輻照時間,以CCD錄像系統(tǒng)監(jiān)測靶細胞的融合過程。實驗表明,靶細胞被曝光后160 min便可融合成一個細胞。,激光誘導細胞融合技術具有顯著的優(yōu)點，如： 1）高度的選擇性，可以選擇任意的兩個細胞之間進行融合，易于實現(xiàn)特定細胞融合。 2）激光作用于細胞所產生的應力小、定時和定位性強、損傷小，從而提高了融合細胞的生存能力。而且，激光參數(shù)易于控制、操作方便、融合過程利于觀察，實驗重復性好。 3）激光操控時無菌、無毒性。激光誘導細胞融合技術也有自身的缺點，如： a.技術不夠成熟，需要進一步完善。 b.設備非常

16、昂貴。 c.它是一種微操作技術，對實驗人員和操作技術要求高，通常需要專門培訓。 同時，該技術每次只能靠人工操作一對細胞，過程繁瑣，工作效率極差，產量也很低。,細胞電融合芯片,在細胞電融合研究向微芯片技術領域發(fā)展過程中，微電極間距縮小到幾十微米，而電融合中細胞排隊（約100700 V/cm）與電穿孔（約18 kV/cm）所需電場條件基本不變。根據(jù)電場強度與加載電壓的關系式E=V/d（E為電場強度，V為微電極兩側施加的電壓，d為微電極間距），如果電極間距d=1 mm，則排隊電壓需要1070 V，擊穿電壓則高達100800 V。如果電極間距縮小到d=50m，則排隊電壓需要0.52.5 V，擊穿

17、電壓只需要540 V。因此，當通過微加工工藝使微電極間距縮小后，所需電壓信號就會大大降低，使細胞電融合系統(tǒng)成為可用電池供電的便攜式系統(tǒng)。由此可見，融合芯片的研究對細胞電融合微系統(tǒng)整體的實現(xiàn)有極其重要的意義，將是該研究的一個重要內容，也是該系統(tǒng)發(fā)展成微全分析系統(tǒng)（micro total analysis system,-TAS）的基礎。,,,,電融合芯片缺點,常規(guī)電融合系統(tǒng)中異源細胞的準確配型難以實現(xiàn)與生物和化學融合方法相比，電融合方法由于效率較高、操作簡便、對細胞無毒害、便于觀察、適于儀器應用和規(guī)范操作，成為了主要的手段。不過，常規(guī)融合系統(tǒng)中融合配型難以控制，目標配型的產率仍然很低。因此，細胞

18、電融合技術的研究進入微觀層次，希望通過微操作方法來實現(xiàn)精確的細胞操作，從而解決融合配對特異性差的缺陷，同時提高自動化程度和融合效率。目前，顯微操作的應用雖可以提高配型的準確度，但自動化程度和效率都很低。 現(xiàn)有電融合系統(tǒng)中微電極數(shù)目偏少，難以提高細胞融合效率現(xiàn)有的電融合系統(tǒng)中融合電極一般只有少數(shù)幾對，可以同時控制和融合的細胞有限，造成融合效率不高。 常規(guī)融合儀器中融合電壓很高，有潛在安全隱患，也不利于設備微型化現(xiàn)有細胞電融合儀器中電極間距一般為2001000m，細胞電穿孔所需電壓在幾百伏特以上。過高的電壓對實驗者造成不安全因素，同時，對融合后的細胞存活率也帶來不利的影響。另外，所需電壓越高，細胞

19、融合儀設備制造難度也相應提高。設備研制成本很高，體積較大，難以實現(xiàn)便攜化，限制了該技術的廣泛應用。 多核融合細胞比例過高現(xiàn)有細胞電融合方法中，多細胞排列成細胞串的比例很高，由此帶來的一個嚴重問題是融合細胞中多核細胞（多個細胞融合而成）的比例也相當高。這種細胞難以存活和分化，也大大降低了實際融合效率。 電融合芯片技術不甚完善現(xiàn)有電融合芯片技術還處于相當初級的階段，電極數(shù)量少、細胞控制困難、融合配對準確性和融合效率難以同時得到保障，與其它微流控細胞研究技術的集成度也很低。,空間細胞融合技術,植物細胞融合過程中由于地球重力的存在,有無液泡的原生質體密度差很大,異源細胞融合率低。 20世紀80年代以

20、來,在空間材料科學的啟發(fā)下,試圖利用空間微重力條件改進細胞融合技術。 空間細胞融合技術是直接為生物加工服務的,例如將抗藥性或胞質雄性不育等細胞質基因導入另一個體細胞,有可能形成新的核質雜種;通過誘導不同種間、科屬間原生質體融合,可以打破遠源雜交不親和性,廣泛組合各種基因型,形成正常重力下無法獲得的新型雜種植株。,生物誘導融合法仙臺病毒法,仙臺病毒是一類被膜病毒，屬于附黏液病毒族，它是多形性顆粒，直徑為5060 nm，由兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA和蛋白質復合體，外膜上有兩種糖蛋白，一種是HANA蛋白質，一種是F蛋白質，前者具有神經(jīng)氨酸酶和血凝活性（分子量較大），后者具有融合和溶血作用（分子

21、量較?。?。 仙臺病毒誘導細胞融合的機理是：病毒被膜上的兩種糖蛋白可和細胞膜表面的糖蛋白發(fā)生相互作用，從而使兩個細胞可以互相接觸，在電鏡下觀察到在相接觸的相鄰細胞表面之間將產生一些微小的細胞質橋。隨著時間的推移，細胞質橋數(shù)量和橋的體積也在增加，最后相鄰細胞的細胞質就結合在一起了，形成細胞凝集塊再通過膜上蛋白質分子的重新排列，使膜中脂類分子重排而打開質膜，最后導致細胞融合。,,在利用仙臺病毒誘導細胞融合實驗中主要包括以下四個步驟：（1）先將親本細胞（待融合的細胞）分別制成懸浮液、混合離心；（2）將沉積細胞懸于滅活的仙臺病毒懸液里，在4oC低溫下?lián)u動20分鐘，使細胞形成凝集塊；（3）再將溫度升至

22、37oC，間歇搖動30分鐘，使其融合；（4）洗去病毒，將融合細胞浮于選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。由于4oC低溫利于細胞聚集，在融合時需要提高溫度，否則融合不會發(fā)生。,體細胞雜種的鑒定及應用領域,細胞融合產生的雜種及后代需經(jīng)過雜種性質的鑒定，而體細胞雜種用于育種實踐時，則應進行再生植株及后代的遺傳分析，一般包括形態(tài)學標記、細胞學標記、原位雜交分析以及各種生化及分子標記分析。,,形態(tài)標記,形態(tài)標記即植物的外部特征，如花的形狀及顏色、果實(種子)的形狀及顏色、葉型、表皮毛、株型、穗型、千粒重、耐逆性以及對疾病的抗性等。形態(tài)標記簡單直觀，但是標記少、多態(tài)性差、易受環(huán)境條件和其它修飾基因的影響，并且許多性狀為

23、數(shù)量性狀，由幾個位點控制，表現(xiàn)為一個范圍，而不是簡單的性狀差異。,細胞學標記,細胞標記主要包括染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等)和帶型(C帶、N帶、G帶等)。細胞學標記位點較少，而且對于親緣關系較近的物種，由于細胞學標記差別不明顯，所以很難根據(jù)細胞學特征來區(qū)分。,同工酶標記,同工酶為共顯性，父本和母本的基因可以同時在后代中表達，不受環(huán)境因素影響，中僅有相對穩(wěn)定;分析操作簡便，所需材料較少;不足之處是位點數(shù)較少，植物1020種同工酶表現(xiàn)出位點的多態(tài)性，覆蓋的基因組范圍有限。,染色體原位雜交,染色體原位雜交（Genomic in situ hybridization，GISH）是一

24、項利用標記的DNA探針與染色體上的DNA雜交，在染色體上直接進行檢測的分子標記技術。通常用同位素或生物素、地高辛標記的DNA探針與染色體DNA雜交，通過放射自顯影或通過抗原抗體反應，在熒光顯微鏡下觀察DNA探針與其互補的DNA序列結合的位置。最大優(yōu)點是可以顯示在體細胞雜種中哪條染色體來源于這個親本，哪條染色體來源于另一個親本，因而更準確、直觀。,分子生物學標記,植物的分子標記主要有RApD、盯LP、AFLP、SSR、ISSR、EST等。,,下面是研究得出的新品種,植物體細胞雜交方式有對稱體細胞雜交、不對稱體細胞雜交。 對稱體細胞雜交是指雙方原生質體直接進行融合，雙親完整原生質體融合使所有遺傳物

25、質均勻混合和重組形成對稱雜種。利用體細胞雜交可創(chuàng)造新物種，研究物種的起源與進化。Sundberg（1986）在進行蕓薹屬白菜型油菜（Brassica competris）與甘藍（B.oleracea）體細胞雜交時成功地得到與甘藍型油菜（B.napus）十分相似的合成種，為三者之間親緣關系提供了有力的證據(jù)（Sundberg et al,1986）。對稱融合也可能產生非對稱雜種和胞質雜種，非對稱雜種和胞質雜種是由于一方親本染色體被排除而形成，親緣關系較遠的兩個親本進行融合時常出現(xiàn)染色體被消減的現(xiàn)象。 不對稱雜交是在原生質體融合前用物理射線（X、、紫外線）照射其中一個親本使核基因組失活，然后與正常的

26、或經(jīng)化學物質（碘乙酸鹽、若丹明6G）處理的原生質進行融合。物理射線（X、、紫外線）照射可打斷破壞親本一方完整的染色體結構，使部分染色體被破壞失活，通過改變X、、紫外線的劑量可調節(jié)染色體的失活程度，可獲得各種各樣核基因組組成的不對稱雜種?；瘜W試劑主要包括2種，一種是碘乙酰胺或碘乙酸（Iodoacetate，IOA），另一種是若丹明6G。碘乙酰胺或碘乙酸作用機理上不清楚，若丹明6G是細胞線粒體氧化磷酸化的專性抑制劑。,原生質體融合轉移CMS性狀的研究現(xiàn)狀細胞質雄性不育(CMS),在植物有性雜交中，由于胞質基因組一般具有母性遺傳的特點，因此在大多數(shù)情況下得到的后代往往只具有母本的胞質基因組。相對而言，原生質體融合技術能夠創(chuàng)造大量新的胞質基因組和新的核一質互作模式，因此在通過轉移胞質基因組控制的優(yōu)良農藝性狀培育有潛在價值的植物資源方面具有極大的優(yōu)勢。在一些己經(jīng)發(fā)現(xiàn)胞質基因組控制的性狀中，胞質雄性不育(CMS)是最受關注的重要農藝性狀之一。CMS具有使植物產生沒有正常功能花粉的特點，因此在一些作物的制種方面有重要的意義。,謝謝大家，請大家指教,周有文,