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1、1,一、概念、分類及應(yīng)用,2,（一）、 兩 個 概 念,生物芯片 主要指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其它生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。 基因芯片 技術(shù)是通過微陣列技術(shù), 將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。,3,微陣列芯片 （Microarray） 微型實(shí)驗(yàn)室芯片 (Lab-on-a-chip) 液體芯片 (Liquichip),（二）、生物芯片分類及應(yīng)用,4,Lab-on-

2、a-chip,微型實(shí)驗(yàn)室芯片是通過在芯片上刻成微流路徑從而將涉及生物檢測的主要步驟樣品準(zhǔn)備/生化反應(yīng)/結(jié)果檢測整合在一張芯片上。,5,6,7,Liquichip,Bead , Capture molecule , Analyte , Reporter molecule是構(gòu)成liquichip 的4個主要部分。 Bead上帶有兩種熒光，根據(jù)這兩種熒光的比例可以 將bead分為多種。目前已有48種，正在開發(fā)中。 Capture molecule : 作用相當(dāng)于探針，能特異性的與被檢測物結(jié)合。 Analyte: 樣品中被檢測的成分。 Reporter molecule: 帶有熒光的報告分子，能特異性

3、的與被檢測物結(jié)合。,8,Liquichip,反應(yīng)的一般步驟： 1.先將capture molecule 結(jié)合在bead 上， 2.將這種標(biāo)記了的bead與樣品反應(yīng)。Capture molecule 可以與相應(yīng)的 analyte 特異性的結(jié)合， 3.此時再加入熒光標(biāo)記的，特異結(jié)合analyte的reporter molecule。 4.檢測：用liquichip workstation 進(jìn)行檢測。原理是同時對bead和reporter molecule 上的熒光進(jìn)行檢測。從而確定被結(jié)合的analyte的種類和數(shù)量。,,9,Liquichip技術(shù)特點(diǎn)描述,1基于bead的這種固相反應(yīng)技術(shù)，具有 靈

4、敏度高、信號強(qiáng)度高、靈活性好、所需樣品量少的特點(diǎn)。 2與傳統(tǒng)的蛋白芯片相比，有兩大優(yōu)勢，反應(yīng)速度更快，靈活性更好。 3由于檢測方法的特點(diǎn)，在大部分的實(shí)驗(yàn)過程中，都不需要洗脫步驟，省時，且不會破壞反應(yīng)的動態(tài)平衡。 4有配套的蛋白表達(dá)和純化體系。（his-tag）,10,Lquichip應(yīng) 用 領(lǐng) 域：,蛋白質(zhì)定量 蛋白質(zhì)功能研究 蛋白表達(dá)譜分析。 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。包括：免疫分析、酶分析、受體-配基分析、蛋白質(zhì)核酸相互作用分析分析。,11,微陣列芯片,蛋白芯片 基因芯片,12,蛋白芯片(Protein Chips),,高通量微陣列蛋白分析方法,利用抗體抗原結(jié)合原理，采用

5、化學(xué)發(fā)光或熒光檢測 標(biāo)記抗體或抗原，來檢測抗原或抗體。,13,蛋白芯片應(yīng)用,免疫學(xué)分析 蛋白與蛋白之間相互作用 DNA與蛋白質(zhì)分子相互作用,14,基因芯片,基因芯片是通過微陣列技術(shù), 將高密度DNA片段陣列通過高速機(jī)器人以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。 微陣列技術(shù)巨大優(yōu)勢在于它可以并行地宏量獲取生物信息，借助此技術(shù)發(fā)展的生物芯片則提供了以核酸雜交為基礎(chǔ)的基因水平的表達(dá)監(jiān)控，多態(tài)性研究和基因分型。從而使我們對基因表達(dá)調(diào)控有更深入的了解。,15,基因芯片發(fā)展歷史,16,基因芯

6、片,按內(nèi)涵劃分： cDNA芯片 Oligo芯片:25mer(affymetrix), 70mer(Operon)， 80mer（Clontech）, 按功能劃分： 基因組芯片： 檢測某一基因是否存在，若 存在，拷貝數(shù)是多少。探針是DNA. 表達(dá)譜芯片：確定基因表達(dá)的途徑與表達(dá)產(chǎn) 物。探針是RNA或cDNA 測序芯片：通過探針與微陣列的配對分析獲 得探針的序列結(jié)果。,17,基因芯片應(yīng)用,基因表達(dá)檢測 多態(tài)性分析 遺傳圖譜定位 基因分型 通過雜交反應(yīng)測定序列,18,基因芯片應(yīng)用領(lǐng)域,遺傳疾病研究 癌癥 家系遺傳疾病 普通基因突變疾病

7、感染性疾病 藥物篩選 動物植物遺傳篩選育種 個人基因身份證 環(huán)境監(jiān)測,19,（三）、生物芯片應(yīng)用優(yōu)勢,高通量平行分析樣品 自動化程度高省時省力 所需樣品試劑少保護(hù)環(huán)境 成本低,20,生物芯片應(yīng)用優(yōu)勢,生物信息數(shù)據(jù)累積 為生物信息公共數(shù)據(jù)庫添加更多數(shù)據(jù) 有利于研究基因序列與生物表型之間的關(guān)系 有助于理解疾病發(fā)生的機(jī)制,21,二、 生物芯片制作技術(shù)介紹,22,生物芯片制作方法分類,23,原位合成 (In Situ Synthesis),化學(xué)合成 原子印章 原位光刻合成,24,原位光刻合成,美國著名的Affymetrix公司率先開發(fā)的寡聚核苷酸原位光刻專利技術(shù)，是生產(chǎn)高密度寡核苷酸基因芯片的核心關(guān)鍵

8、技術(shù)。,25,原位光刻合成原理,Light directed oligonucleotide synthesis. A solid support is derivatized with a covalent linker molecule terminated with a photolabile protecting group. Light is directed through a mask to deprotect and activate selected sites, and protected nucleotides couple to the activated sites.

9、 The process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary DNA probes to be constructed at each site.,26,預(yù)先合成后點(diǎn)樣(off-chip synthesis),接觸式點(diǎn)樣 非接觸式點(diǎn)樣,27,基因芯片點(diǎn)樣的方式,接觸式點(diǎn)樣---適合于DNA芯片的制作 即點(diǎn)樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上,28,接觸式點(diǎn)樣,Best!,29,ArrayIt ChipMaker Pi

10、ns,帶有細(xì)槽的不銹鋼針尖 載樣能力: 200 to 600 nL 點(diǎn)樣體積: 250 pL to 2.5 nL (pin size) 點(diǎn)樣直徑: 100 m to 500 m (pin size),Dipping of pin for sample pickup Touching of slide with pin to leave spot Control print volume with pin size,30,Stealth and Chipmaker Pin (TeleChem),31,Chipmaker 點(diǎn)樣技術(shù),,,32,Stealth Pins,33,34,TeleChem公

11、司點(diǎn)樣針技術(shù) 不斷發(fā)展的專利針技術(shù) 共有30種針供選擇,與斯坦福大學(xué)共同發(fā)展 專利 pin, 帶樣穩(wěn)定，樣品利用率高 單次帶樣可連續(xù)點(diǎn)樣達(dá)200--1500次 特殊不銹鋼材料，適用于各種溶液 實(shí)際點(diǎn)樣直徑75--250um,可根據(jù)不同樣品選擇相應(yīng)pin 相當(dāng)容易更換pin和pin head以適應(yīng)不同需要,35,基因芯片點(diǎn)樣的方式,非接觸式點(diǎn)樣---適合于蛋白芯片的制作 它是以電磁閥或壓電原理將樣品直接噴至固相支持物表面,36,非接觸式噴點(diǎn)技術(shù),Thermal,Solenoid 螺線管,Piezoelectric,37,Synquad：通過高分辨率注射器泵和微螺線管閥門有機(jī)結(jié)合起來精確控制滴

12、液 Piezoelectric：用壓電晶體將液體從孔中噴出的壓電技術(shù)，兩個壓電晶體同時加脈沖通電觸發(fā)這兩個壓電晶體往噴管中間變形擠壓噴管側(cè)壁，噴管出現(xiàn)收縮壓迫液體從噴嘴噴出。,38,非接觸式點(diǎn)樣：synQUAD Technology,39,,,,,Aspirate and Print for Making Arrays,40,Characteristics of synQUAD Technology,Wide dispense range Low nanoliter to high microliter Excellent linearity Precise and accurate CVs

13、typically less than 10% Precision less than 5% Non-contact dispense mechanism Easier mechanical alignment (384, 1536,) “On-the-fly” printing possible Capable of dispensing onto membranes or slides Multiple liquid handling modes Aspirate/Dispense Continuous Reagent Dispensing,41,synQUAD vs Piezoelect

14、ric Printing,synQUAD / nQUAD Patented by Cartesian Uses commercially available components Robust and reliable delivery mechanism Low nanoliter to low microliter dispense volume maximum density: 200 to 400 spots/cm2 Piezoelectric Abbott holds key patents on technology Dispense susceptible to air bubb

15、les Mid-picoliter dispense volume 2500 spots/cm2,42,三、生物芯片檢測系統(tǒng),CCD掃描儀 非共聚焦激光掃描儀 激光共聚焦掃描儀,43,數(shù)值孔徑與采光效率,NA 0.3 NA 0.8,NA = sin(), where is the angle of the cone,44,激光共聚焦（聚焦）,The fluorescence source is at the objective lens focus Light goes through the pinhole to the detector,45,激光共聚焦（非聚焦）,Fluorescen

16、ce source below focus (e.g. out of focus) Out of focus light is mostly blocked at the pinhole,46,Confocal Artifact RejectionNo Pinhole With Pinhole,Dust artifacts reduced by at least a factor of 10,47,CCD Camera Systems Advantages: Few moving parts Fast scanning of bright samples Disadvantag

17、es: NA limited to about 0.40: Less appropriate for dim samples Optical scatter can limit performance Need to “stitch” together large images Confocal Laser Scanners Advantages Small depth of focus reduces artifacts high light collection efficiency. PMT detectors have the highest sensitivity in the vi

18、sible range,48,DNAscope LM+ 激光共聚焦芯片掃描儀,49,,x,,,,,,,,,,,,,x,y,,z,,,,,,,,,,,,,,,x,,,,,,,MACROscope,Filters,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,50,How the Scan System Works F-theta Telecentric Scan System,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Sample,Scanning Mirror,Laser Scan Lens,,,,,B,A,C,,,,,,,,51,,,,How to scan a whole sampl

19、e,,,,,,,,,,,,,,,,,,Home Sensor,Scanning Mirror,Sample,Laser Scan Lens,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,52,DNAscope LM+ 優(yōu)點(diǎn) 共聚焦面積寬 : 20mm70mm 可以掃描多種介質(zhì) (Images both Glass Slide Microarrays and CLONDIAG AT tubes) 背景噪聲低，信噪比高 全自動成像，分析結(jié)果 Small footprint (W20cm x L30cm x H20cm),53,,Imaging Arrays Both Dry & Wet,Dry PBS

20、 buffer,Cy3 Cy5,Cy3 and Cy5 labeled protein dotted on glass substrate and imaged at 5 micron resolution in both dry and wet formats,54,Tube 1,Tube 2,Cy3 Images of two Clondiag Array Tubes,,55,四、生物芯片技術(shù)思路的比較,56,,Comparison of DNA Chip Technologies,Sensitivity of DNA chip based assays is a

21、 function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise),Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 20n o

22、r 80 n 50,000 n,sequencing,expression,expression,genomic analysis,,,,,57,cDNA芯片的缺點(diǎn),由于不同的基因長短不同，Tm值各異，成千上萬的基因在同一張芯片上雜交，使得雜交條件很難同一。 同一個體中總是存在一些基因家族的同源序列，加上有的物種存在基因重疊序列的相互干擾，使得傳統(tǒng)的cDNA芯片的分辨能力受到限制，結(jié)果的準(zhǔn)確性也受到影響。 有些組織中在DNA雙鏈中的無意義鏈中存在重疊的基因；而且不同RNA的剪切方式等基因表達(dá)方式很難用cDNA芯片來區(qū)分。 PCR產(chǎn)物是結(jié)合穩(wěn)定的DNA雙鏈，加入探針后在雜交中必然存在競爭性

23、抑制，影響探針和模板的結(jié)合能力和穩(wěn)定性，進(jìn)一步影響cDNA芯片的分辨能力和結(jié)果的可信度，這對于低豐度的基因影響尤為明顯。PCR產(chǎn)物濃度不均一也可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)論。,58,寡核苷酸芯片比cDNA芯片的優(yōu)點(diǎn),探針序列經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，減少非特異雜交，能有效區(qū)分有同源序列的基因； 減少二級結(jié)構(gòu) 及其對雜交結(jié)果的影響 雜交溫度均一，提高雜交效率； 合成產(chǎn)物濃度均一，避免因樣品濃度差異而造成點(diǎn)樣量差異 ； 可以設(shè)計檢測不同剪切方式的基因； 無需擴(kuò)增，防止擴(kuò)增失敗影響實(shí)驗(yàn) 。,59,預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本cDNA芯片,60,預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本自己合成寡聚核苷酸芯片,61,預(yù)合成后點(diǎn)樣系統(tǒng)的綜合成本

24、應(yīng)用Operon探針寡聚核苷酸芯片,62,Affymetrix技術(shù)平臺綜合成本,63,總結(jié),采用Affymetrix公司的生物芯片系統(tǒng)平臺比較適合于實(shí)力雄厚的科研實(shí)驗(yàn)室，可以在最短的時間內(nèi)盡快獲得精確可靠的并且可能是前人未曾獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可在國際權(quán)威雜志上獲發(fā)表，盡快在相關(guān)研究領(lǐng)域在國際領(lǐng)域占領(lǐng)一席之地。,64,總結(jié),采用合成后點(diǎn)樣的生物芯片平臺比較適合于目標(biāo)定位于研發(fā)、生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室及生物公司。雖然購買芯片點(diǎn)樣掃描系統(tǒng)的經(jīng)費(fèi)看起來比購買Affymetrix系統(tǒng)的費(fèi)用要低，研發(fā)的方向可以結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的研究特點(diǎn)，比較靈活，但前期研究需要投入較大的人力、物力和時間，綜合成本并不低，而且獲得的芯片信

25、息量小，可靠性較低，使用該系統(tǒng)生產(chǎn)的芯片為材料進(jìn)行的研究一般為驗(yàn)證性工作，且因?yàn)椴牧系目煽啃缘?，很難在國際權(quán)威雜志上獲得認(rèn)可。目前開發(fā)生產(chǎn)的生物芯片尚無獲得醫(yī)療許可的產(chǎn)品。,65,五、生物芯片制作所需耗材,66,Microarraying Accessories（芯片配件）,Pins and Printheads,OmniGrid Slides and Reagents OmniGrid Epoxy(環(huán)氧基修飾) OmniGrid Amine(氨基修飾) OmniGrid Aldehyde(醛基修飾) Complete line of associated reagents,Hybridiza

26、tion Chambers HybChamber HybChamber Mica,67,Slides: Epoxy Aldehyde Amine,Buffers: Spotting Blocking Hybridization,OmniGrid Slides & Reagents芯片研究片基和試劑,68,Substrates,膜： S & S NC膜及Supercharge尼龍膜 玻璃片： S & S FAST CEL 醛基化、氨基化玻片 DAKO玻片 Telechem SuperClean/SuperAmine/SuperAldehyde,69,Hybridization Cassete,1

27、. Telechem,2. Clontech Plastic Hybridization Cassete,,70,Wash Station,71,基因公司芯片系統(tǒng)客戶,72,完善的售后服務(wù)體系,基因公司在全國各主要地區(qū)設(shè)有7處維修站，其中直接為生物芯片設(shè)備提供維護(hù)、維修服務(wù)的工程師有4人，主要集中在上海和北京。這些工程師都具有多年的生物芯片相關(guān)設(shè)備的安裝、調(diào)試、維護(hù)、維修經(jīng)驗(yàn) 。 上海晶泰生物技術(shù)有限公司作為基因有限公司的全資子公司，該公司的生物芯片實(shí)驗(yàn)室擁有目前國內(nèi)領(lǐng)先的生物芯片點(diǎn)樣、掃描設(shè)備，以及相關(guān)的如雜交爐、洗滌工作站等全套的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。同時，公司目前擁有生物芯片領(lǐng)域的大量專業(yè)技術(shù)人才，目前，生物芯片實(shí)驗(yàn)室擁有本科以上20人，碩士5人、博士5人。該公司對外提供涉及生物芯片領(lǐng)域的各項商業(yè)服務(wù)：點(diǎn)樣、掃描、芯片設(shè)計制作等全方位的服務(wù)。,73,謝謝各位老師 ！,