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1、遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 第九章 體細(xì)胞雜交 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 二、促進(jìn)細(xì)胞融合方法 1.1 生物融合（病毒法）biological fusion 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 1.2 化學(xué)融合 聚乙二醇（PEG）、硝酸鹽、磷酸鹽、丙 三醇、膜動劑（AZC） 聚乙二醇作為融合劑是加拿大科學(xué)家高國楠 等發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)胞融合技術(shù)的另一突破。聚乙二 醇是一種促進(jìn)細(xì)胞融合能力很強(qiáng)的化學(xué)融合劑之 一，溶于水。,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 一、體細(xì)胞雜交的定義 體細(xì)胞雜交，

2、就是采用細(xì)胞融合的方法， 使原來不能或很難進(jìn)行有性雜交的兩種生 物，通過體細(xì)胞融合將它們的染色體核基 因共存于一個(gè)雜交細(xì)胞。 體細(xì)胞雜交屬于生物技術(shù)中細(xì)胞工程學(xué)的 一個(gè)分支，與染色體工程、染色體組工程 和細(xì)胞質(zhì)工程等有所區(qū)別。 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 金魚囊胚細(xì)胞的病毒融合 取囊胚期的胚胎用尖鑷子剝?nèi)ヂ涯?，放入盛有Holtfreter 液的培養(yǎng)皿，用發(fā)圈把胚盤從卵黃上切割下來，再用嘴控 移液管把胚盤轉(zhuǎn)移到含有EDTA的缺鈣、缺鎂的holtfreter 液（分離液），在室溫下放置2-3min，再用微吸管吹打， 使其分散成單個(gè)囊胚細(xì)胞，用Holtfreter液洗兩

3、次，然后 挑選大小一致的圓形囊胚細(xì)胞，雙雙放在盛有-丙內(nèi)酯 滅火的仙臺病毒液體的多孔血凝板或96孔板的培養(yǎng)板里。 每孔2個(gè)細(xì)胞，使彼此粘連在一起，在37下孵育15- 20min，再在解剖鏡下檢查融合情況。把融合的囊胚細(xì)胞 選出，放在Holtfreter液里。然后轉(zhuǎn)移到含有15%小牛血 清的MEM培養(yǎng)液里培養(yǎng) 。 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 機(jī) 理 在高濃度(40以上)的聚乙二醇溶液 中，由于PEG與水之間的氫鍵作用，使 溶液中自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā) 生膜結(jié)構(gòu)的變化，由此形成膜蛋白質(zhì)的 外殼，引起細(xì)胞融合。,1,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatol

4、ogy 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology PEG法對海藻種間原生質(zhì)體的融合也有效。近 幾年，PEG法已使三組種間海藻原生質(zhì)體融合成 功，它們是：雙星藻和纖細(xì)水綿、長石莼和囊礁 膜、條斑紫菜和腸滸苔。 張大力用PEG誘導(dǎo)長石莼和囊礁膜原生質(zhì)體的 融合研究中觀察到，原生質(zhì)體的質(zhì)且好壞直接 影響融合率的高低，甚至決定融合的成敗，只有 用幼嫩新鮮的藻體制備的原生質(zhì)體進(jìn)行融合才能 成功。 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 聚乙二醇化

5、學(xué)融合法特點(diǎn) 聚乙二醇具有廣泛的適應(yīng)性、簡便、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)： PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的有效濃度范圍很窄，最適濃度為50- 55%，此時(shí)對細(xì)胞毒性很大 PEG誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞的融合率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于誘導(dǎo)同樣細(xì)胞單層培 養(yǎng)時(shí)的融合率。 PEG誘導(dǎo)產(chǎn)生的雜交細(xì)胞頻率仍在10-5較這一很低水平。 容易形成多細(xì)胞融合體，不容易在顯微鏡下觀察細(xì)胞融 合的過程。 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology,1.3 物理融合 優(yōu)點(diǎn)：,1.3.1 電融合法 自從Zimmermann（1978）等和Senda （1979）等報(bào)道應(yīng)用脈沖電流誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體 融合取得成功以來，為電融合技術(shù)發(fā)展奠定了基 礎(chǔ)

6、。,誘導(dǎo)率較高：是PEG的100倍 操作簡單、快速，不存在細(xì)胞毒性問題 可以顯微鏡觀察融合過程 缺點(diǎn)：采用高壓電脈沖，使細(xì)胞內(nèi)部某些低電 離電位分子可能發(fā)生離解而造成“電損傷”，影 響融合細(xì)胞的存活,2,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 電融合實(shí)例 劉沛霖以大鱗副泥鰍的囊胚細(xì)胞為材料，在 915室溫下，電場液用0.02mol/L甘露醇加 1mmol/L氯化鈣配成，細(xì)胞密度為（2.5 3）X 104，細(xì)胞膜緊密接觸2 5min，脈沖處理13 次，時(shí)間常數(shù)10 50us，融合率為46.72%，細(xì)胞 存活率達(dá)88.6% 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology

7、,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 電融合裝置電路方框原理圖 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology,1.3.2 激光融合 優(yōu)點(diǎn)：無毒，融合體成活率高，能保證只 有所選擇的細(xì)胞或原生質(zhì)體得到融合。 缺點(diǎn)：每次只能產(chǎn)生一個(gè)融合體，激光微 束系統(tǒng)的設(shè)備昂貴。,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 三、細(xì)胞融合過程 1. 點(diǎn)接觸：2個(gè)細(xì)胞表面結(jié)合在一起的凝集狀態(tài)。 2. 面接觸：加入PEG等融合物質(zhì)，則進(jìn)入面融,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 異核體 同核體,合狀態(tài)，細(xì)胞呈斜球形。 3. 融合：雙方的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)

8、胞膜完全合并，結(jié) 果形成一個(gè)圓球形或卵圓形融合細(xì)胞，即異 核體。 3,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology,遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology,四、體細(xì)胞雜交應(yīng)用 4.2、植物育種,4.1 微生物育種 我國的邢孔昭等(1988)將巴龍霉素產(chǎn) 生菌與新霉家產(chǎn)生菌的高產(chǎn)變異株進(jìn)行了 種間原生質(zhì)體融合，獲得了比區(qū)龍霉素產(chǎn) 生菌原始菌株單依產(chǎn)量(300ugmL)高5-6 倍的重組體菌株。 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 4.3 水產(chǎn)生物方面的應(yīng)用 張大力等將長石莼與囊礁膜原生質(zhì)體融 合，并將其融合體培養(yǎng)了20天，形成自養(yǎng)細(xì) 胞團(tuán)。 Fujita將淡紅紫色的野生型條斑紫菜與綠 色突變型的條斑紫菜的原生質(zhì)體融合，培育 出長達(dá)60cm左右的嵌合葉狀體。,馬鈴薯與番茄、擬南芥菜與本油菜 等是些屬間有性不親和的組合，經(jīng)細(xì)胞 融合技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)，已培養(yǎng)出前 所未有的再生植株 遺傳育種學(xué) Genetic thremmatology 在魚類，易泳蘭等把大鱗副泥瞅鰻尾泥 鰍雜交囊胚細(xì)胞與大鱗副泥鰍卵融合，培育 了15.7(6尾)的融合魚。 將鯉魚囊胚細(xì)胞與紅鯽魚卵融合，培育了 3.5%融合魚苗，工作還表明，魚類囊胚細(xì)胞 與末受精卵的電融合可以簡化細(xì)胞核移植操 作過程，一次可以處理卵數(shù)相當(dāng)于一次核移 植卵數(shù)的2-3倍。,4,