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1,第四章,基因工程的工具酶 及其應(yīng)用,2,TOOLS FOR GENE CLONING SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS,,,3,,,基因工程的工具酶 定義 用于DNA和RNA切割和連 接的各種酶叫做工具酶。,4,,,“分子剪刀”的發(fā)現(xiàn)者,5,第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶 (restriction endonuclease，RE) 是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的一種能識(shí)別雙鏈 DNA中的特定序列，并以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。,6,在細(xì)菌體內(nèi)，這種內(nèi)切酶可以分解外源性的DNA物質(zhì)，例如病毒等；而細(xì)菌本身的DNA同一識(shí)別序列中的某些堿基被甲基化所保護(hù)。這種細(xì)菌內(nèi)部的限制與修飾作用分別由核酸內(nèi)切酶和甲基化酶完成，構(gòu)成了類似免疫的防御系統(tǒng)。,7,解釋 何謂內(nèi)切酶 -o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o- 紅色為外切酶的作用位點(diǎn)， 藍(lán)色為內(nèi)切酶的作用位點(diǎn),,,,,,8,限制性核酸內(nèi)切酶的分類,目前已發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶600余種，可分為三大類。 Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶廣泛用于基因工程； 特點(diǎn)：識(shí)別切割位點(diǎn)比較專一，只有切割作用。無(wú)甲基化修飾作用。 Ⅰ類和Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶同時(shí)具有內(nèi)切活性和甲基化修飾活性，且識(shí)別位點(diǎn)復(fù)雜，特異性差，不適用于基因工程。,9,一.限制性內(nèi)切酶的命名,Hind Ⅲ H in d Ⅲ,細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母,細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母,細(xì)菌菌株的第一個(gè)字母,同一菌株中發(fā) 現(xiàn)的第三種酶,10,EcoRI E co R I,細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母,細(xì)菌種名的前兩個(gè)字母,該酶的基因位于R質(zhì)粒上,該菌株發(fā)現(xiàn)的 第一種內(nèi)切酶,11,,,12,二. II型限制酶的識(shí)別特點(diǎn),識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序的固定位置切割，識(shí)別順序?yàn)榛匚慕Y(jié)構(gòu)。（Palindrome）,客上天然居 居然天上客,13,14,,EcoRI,PstI,HpaI,5' sticky end 5'粘末端,3' sticky end 3'粘末端,blunt end 平末端,三. 限制性內(nèi)切酶的切割方式,15,四.識(shí)別位點(diǎn)與切割方式,限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列一般為6個(gè)核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多數(shù)。 也有少數(shù)限制性內(nèi)切酶，識(shí)別序列為4個(gè)、5個(gè)、或更多的核苷酸如8個(gè)及8個(gè)以上，當(dāng)識(shí)別序列核苷酸數(shù)為單數(shù)時(shí)，則以中間的核苷酸作為對(duì)稱軸。如GTNAC（N 代表四種核苷酸）。,,16,一般說(shuō)來(lái)，在DNA分子中，識(shí)別序列短的出現(xiàn)概率大，識(shí)別序列長(zhǎng)的出現(xiàn)概率小。有N個(gè)核苷酸的識(shí)別序列出現(xiàn)概率為1/4n。如識(shí)別4個(gè)核苷酸Sau 3A，則間隔256（4×4×4×4）個(gè)核苷酸就有一次機(jī)會(huì)出現(xiàn)識(shí)別位點(diǎn)。如識(shí)別8個(gè)核苷酸的Not I，則需間隔65536個(gè)核苷酸才有一次機(jī)會(huì)出現(xiàn)識(shí)別位點(diǎn)。,17,稀切酶：有些酶的識(shí)別位點(diǎn)在核苷酸序列中出現(xiàn)的幾率很小，可稱為稀切酶。 為了獲得大的DNA片段，需用稀切酶切割。 個(gè)別限制性內(nèi)切酶可識(shí)別兩種以上的核苷酸序列，如Acc I既可識(shí)別GTATAC，又可識(shí)別GTCGAC。,18,位點(diǎn)偏愛(ài)：限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列兩側(cè)的核苷酸組成與酶切效率有關(guān)，比如Nae I在pBR322質(zhì)粒上有4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)，其中兩個(gè)位點(diǎn)可迅速被Nae I切割。第三個(gè)位點(diǎn)稍慢。而位于1285處的第四個(gè)識(shí)別序列，切割的效率只有其他位點(diǎn)的1/15。,19,同尾酶：兩種酶識(shí)別不同的順序，但切割 產(chǎn)生的粘末端相同，叫做同尾酶。 同尾酶產(chǎn)生的粘末端，可通過(guò)堿基互補(bǔ)連接，形成的位點(diǎn)稱為“雜種位點(diǎn)”，該位點(diǎn)不能再被原來(lái)的兩種酶切割。,20,例：AGATCT GGATCC TCTAGA CCTAGG,,,Bgl Ⅱ,BamH Ⅰ,A TCTAG,GATCC G,,,,連接酶,AGATCC TCTAGG,21,同位酶:識(shí)別相同的序列,但切割位點(diǎn)不同. 同裂酶: 又稱異源同工酶，來(lái)源不同,但識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)相同. 切割位點(diǎn)也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和Xma I(C↓CCGGG),22,五.限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件,反應(yīng)溫度 一般為37oC 反應(yīng)體積20μl DNA含量 0.5－1μg 酶含量 1－2u DNA純度：OD260/280nm1.7 陽(yáng)離子 Mg2+ 反應(yīng)時(shí)間 1-1.5h pH7.5,23,限制性核酸內(nèi)切酶的反應(yīng)條件,各種限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)條件相似，主要區(qū)別是對(duì)鹽濃度的需求不同。據(jù)此可分為三組 低鹽組 0～50mmol/L NaCl 中鹽組 50～100mmol/L NaCl 高鹽組 100～150mmol/L NaCl,24,限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性,當(dāng)酶切條件發(fā)生變化時(shí)，限制性核酸內(nèi)切酶的專一性可能會(huì)降低，導(dǎo)致同種酶識(shí)別多種序列，這種現(xiàn)象稱作限制性核酸內(nèi)切酶的星號(hào)活性。,25,例如 EcoR I在正常條件下識(shí)別GAATTC,但在低鹽（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在時(shí)，識(shí)別序列增加了AAATTC、GAGTTC,導(dǎo)致EcoR I在DNA分子上的切割位點(diǎn)大大增加。,26,第二節(jié) 其他工具酶,一.DNA聚合酶 作用: 依據(jù)模版,連接游離的單核苷酸,形成與 模版互補(bǔ)的新鏈。,27,1.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ 該酶具有三種酶活性 5’→3’ DNA聚合活性 3’→5’ 外切酶活性 識(shí)別切除錯(cuò)配的核苷酸 5’→3’ DNA外切酶活性,28,5′CCGATA-OH 3′ 3′GGCTATCGGA 5′CCGATAGCCT 3′ 3′GGCTATCGGA 5’→3’ DNA聚合酶活性,,DNA聚合酶Ⅰ,dNTP,29,5′CCGATA-OH 3′ 3′GGC DNA聚合酶Ⅰ 5′CCG 3′GGC ＋dA,dT 3’→5’ 外切酶活性,,30,2.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段,該酶是用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ ，從全酶中切去 5‘ → 3’ 外切活性的肽段后產(chǎn)生的一條多肽鏈，保留了5’→3’聚合和3’→5’外切活性。 該酶稱為Klenow酶。也稱為 Klenow 片段（Klenow fragment）。,31,3.T4噬菌體DNA聚合酶,來(lái)源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，具有 5’→3’ DNA聚合酶活性 3’→5’ 外切酶活性,32,4.TaqDNA聚合酶,耐熱的 DNA聚合酶。最適反應(yīng)溫度75 ～80oC，主要用于聚合酶鏈反應(yīng)。,33,5.逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase ）,作用：以RNA為模版，合成 cDNA (Complementary DNA) 該類酶有三種活性 ① RNA依賴的DNA聚合酶活性 ② DNA依賴的DNA聚合酶活性 ③ 外切RNA的活性,34,常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種： AMV－來(lái)自于鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒 M-MLV－來(lái)自于莫絡(luò)尼鼠的白血病病毒,35,二 . T4DNA連接酶,催化兩個(gè)DNA片段的3’-OH和5’-P末端 形成磷酸二酯鍵 該酶是大腸桿菌T4噬菌體的DNA30編碼的產(chǎn)物，分子量68kd?，F(xiàn)已由基因工程菌表達(dá)。,36,DNA 連接酶,“分子針線”,,37,DNA連接酶,連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）。,,,38,主要功能 降解RNA 由于RNA酶分布廣泛，如唾液、皮膚分泌物中都含此酶，在涉及RNA的實(shí)驗(yàn)中謹(jǐn)防RNA酶污染。,三.RNA酶,39,四.核酸酶SI,降解單鏈 DNA 或 RNA，形成5’-P的單核苷酸或寡核苷酸片段 對(duì)DNA的活性比對(duì)RNA的強(qiáng) 產(chǎn)生平末端,40,五 .堿性磷酸酶,切除DNA或RNA的5‘-P 防止DNA自身環(huán)化,,5’ p－ TTAGCTAGGCCC … TCAATCGGTACG －OH 3’ 3’ HO-AATCGATCCGGG … AGTTAGCCATGC－p 5’,