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1、檸條酶解糖化的預(yù)處理方法 檸條酶解糖化的預(yù)處理方法 2015/04/23 1材料與方法 1.1試驗材料(1)原料原料來自于寧夏固原的5年生檸條的平茬廢棄物，經(jīng)自然曬干、粉碎后過10目與20目標(biāo)準(zhǔn)篩，選擇粒徑介于0.85～2mm之間的粉末作為實驗材料。(2)菌種微生物菌種選用模式菌黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，屬絲狀白腐真菌。(3)纖維素酶纖維素酶(固體)由寧夏夏盛實業(yè)集團(tuán)有限公司惠贈，經(jīng)測

2、定其總纖維素酶活性(以濾紙為底物測定，pH4.8)約為64FPU/g。(4)培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基。檸條培養(yǎng)基按檸條︰自來水為1︰1.5(質(zhì)量/體積比，m/v)的比例向檸條中加入自來水?dāng)嚢杈鶆蛑瞥?，?21℃滅菌30min。 1.2試驗方法(1)堿處理堿處理采用0.1%～5%的NaOH溶液以1︰20固液比在100℃下處理15min，用蒸餾水對照。處理后用200目濾布過濾，收集濾液用H2SO4調(diào)節(jié)pH值至中性并測定濾液中還原糖含量，濾渣用自來水沖洗至中性后烘至恒重。(2)酸處理酸處理采用0.025%～1%的硫酸以1︰20固液比在120℃下處理1h，用蒸餾水做對照。處理后用200目濾布過濾，收集濾液

3、用NaOH調(diào)節(jié)pH至中性并測定濾液中還原糖含量，濾渣用自來水沖洗至中性后烘至恒重。(3)微生物處理將菌種接種至PDA培養(yǎng)基上于28℃活化5～7天，活化后采用固體接種的方法挑取直徑為2～3mm的菌苔接種到檸條培養(yǎng)基上，每瓶接10塊。接種后置于28℃培養(yǎng)，分別在第3～6周取樣，于105℃干燥4h。(4)酶解糖化采用醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.8)于50℃溶解固體纖維素酶，酶濃度為1.25g/mL。稱取0.160g預(yù)處理前后的樣品，按每克生物質(zhì)20FPU加入纖維素酶酶液，并用于pH值為4.8的醋酸－醋酸鈉緩沖液補(bǔ)充至反應(yīng)體系總體積為8mL，于48℃靜置酶解48h后用定性濾紙過濾，棄濾渣，采用DNS法

4、［13］測定濾液中還原糖含量。(5)木質(zhì)纖維素含量測定參照NＲEL的方法［14］測定纖維素、酸不溶木質(zhì)素(AIL)、酸溶性木質(zhì)素(L)和木質(zhì)素(AIL+L)含量，半纖維素含量采用中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維法［15］測定。(6)轉(zhuǎn)化率與總還原糖得率的計算濾渣酶解糖化情況用轉(zhuǎn)化率表示，以酶解轉(zhuǎn)化出的還原糖質(zhì)量占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示，轉(zhuǎn)化率/%=酶解轉(zhuǎn)化的還原糖質(zhì)量酶解前稱取的樣品質(zhì)量100%總還原糖包含酸/堿水解出的還原糖及酶解產(chǎn)糖，以酸/堿水解產(chǎn)生的還原糖與酶解轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量之和占酶解前生物質(zhì)質(zhì)量百分比表示，總還原糖利率/%=(酸/堿水解產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量+酶解轉(zhuǎn)化的還原糖質(zhì)量)酶解前

5、稱取的樣品質(zhì)量100% 1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法采用Excel和SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(MSE)表示，對不同預(yù)處理的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)Duncan檢驗比較差異，不同處理間的差異(p＜0.05)以小寫字母表示。 2結(jié)果與分析 2.1不同預(yù)處理后樣品質(zhì)量損失和酶解轉(zhuǎn)化效率變化預(yù)處理是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用的必要手段，其主要目的是通過預(yù)處理破壞木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，降低纖維素結(jié)晶度，提高纖維素酶的效率［16］。預(yù)處理過程中，不同方式對酶的催化作用有著不同的效果，酶解轉(zhuǎn)化效率能有效表征不同樣品對纖維素酶的敏感程度。轉(zhuǎn)化率反映了單位質(zhì)量生物質(zhì)酶解釋放可發(fā)酵糖的能力，因

6、此以轉(zhuǎn)化率表示不同預(yù)處理方法對生物質(zhì)的改性程度。為了評價3種預(yù)處理方法對檸條酶解效果的差異，比較了預(yù)處理前后檸條的轉(zhuǎn)化率變化情況，同時考查了預(yù)處理對樣品重量的影響，結(jié)果見圖1～3。經(jīng)不同濃度稀H2SO4處理的樣品失重率與酶解轉(zhuǎn)化率如圖1所示。由圖1可以看出，稀硫酸處理導(dǎo)致檸條重量損失顯著，樣品失重率隨稀H2SO4濃度增加呈上升趨勢，硫酸處理后固體殘渣的酶解轉(zhuǎn)化率與硫酸濃度無顯著相關(guān)性。稀硫酸能夠有效去除木質(zhì)纖維素中的半纖維素成分，因此0.1%H2SO4處理即可引起檸條失重率達(dá)15.1%，處理程度增加也會導(dǎo)致部分纖維素組分的水解，1%硫酸處理時失重率達(dá)到40.8%。從酶解轉(zhuǎn)化率來看，一定濃度的稀

7、硫酸預(yù)處理雖然能夠促進(jìn)檸條酶解糖化，但對檸條酶解效率的提高幅度不大，小于0.5%的硫酸處理時，酶解效率隨硫酸濃度增加而升高;經(jīng)0.5%H2SO4處理后的固體殘渣酶解效率提高最顯著，酶解轉(zhuǎn)化率比對照提高了20.3%;但隨著硫酸濃度進(jìn)一步提高，半纖維素被消化的越多，固體殘渣中木質(zhì)素含量相對升高，不利于酶解，酶解效率反而降低。因此，0.5%H2SO4是檸條酸法預(yù)處理的適宜濃度。經(jīng)不同濃度NaOH處理的樣品失重率與酶解轉(zhuǎn)化率變化如圖2所示。從失重率的變化可以看出，隨著NaOH濃度的升高檸條失重率逐漸升高，當(dāng)NaOH濃度提高至2.5%時，繼續(xù)提高NaOH處理的濃度，檸條的失重率基本維持不變。轉(zhuǎn)化率隨Na

8、OH處理濃度的變化顯示，堿處理能夠顯著提高檸條酶解轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率隨堿用量增加而持續(xù)升高，5%NaOH處理后的檸條酶解轉(zhuǎn)化率最高，比未經(jīng)處理的原材料提高了147.3%，達(dá)13.6%。經(jīng)黃孢原毛平革菌處理不同時間的樣品失重率與酶解后還原糖轉(zhuǎn)化率如圖3所示。由圖3可知，白腐真菌處理后檸條平茬廢棄物的失重率持續(xù)升高，最高為處理6周的樣品，失重率達(dá)42.4%;酶解轉(zhuǎn)化率也均顯著高于對照，最高的是處理6周的樣品，比未經(jīng)處理的原料提高了48.6%，其次是處理3周的樣品提高了38.1%。因此，白腐真菌處理6周是檸條平茬廢棄物微生物法預(yù)處理的適宜時間。綜合比較圖1～3可以發(fā)現(xiàn)，從處理后固體殘渣的酶解轉(zhuǎn)化效率來看

9、，三種預(yù)處理方法對酶解效率的影響程度順序是:堿＞白腐真菌＞酸;其中，5%NaOH處理后樣品的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)13.6%，比原材料提高了147.3%。 2.2預(yù)處理前后檸條的木質(zhì)纖維素含量為探究各樣品酶解轉(zhuǎn)化率提高的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步測定了原料和經(jīng)不同預(yù)處理后樣品的木質(zhì)纖維素成分，各組成分含量見圖4。從圖4可以看出，檸條平茬廢棄物的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素等3種主要成分占90%以上，近似于木材，其中半纖維素含量最高達(dá)34.1%，其次是木質(zhì)素32.7%。檸條中的可轉(zhuǎn)化底物(纖維素與半纖維素)含量略高于玉米(Zeamayz)秸稈［17］，具有潛在的能源化利用價值。檸條為多年生灌木樹種，其木質(zhì)素含量遠(yuǎn)高

10、于1年生的玉米秸稈，也高于多年生常綠樹種毛竹(Phyllostachysheterocyclacv.pubescens)［18］，不利于可轉(zhuǎn)化底物的釋放和利用，這是檸條作為飼料的利用率低下的關(guān)鍵原因。檸條的高木質(zhì)素含量可能與檸條生長在干旱半干旱的環(huán)境有關(guān)，研究表明干旱脅迫時植物可以通過提高木質(zhì)素含量來減少水分損失，抵御干旱帶來的不利影響。2#和3#為硫酸處理后的樣品，硫酸處理后檸條中的纖維素和木質(zhì)素含量升高，而且隨著處理強(qiáng)度增加，硫酸對纖維素的水解程度增加，半纖維素含量顯著降低，其中樣品3#的半纖維素含量最低，為2.4%，比對照降低了93.0%，說明0.5%硫酸處理已經(jīng)基本完全除去了檸條中的半

11、纖維素，進(jìn)一步增加硫酸濃度對預(yù)處理效果影響不大。4#～6#為堿處理的樣品，經(jīng)堿處理后，檸條中纖維素含量顯著升高，酸不溶性木質(zhì)素AIL含量顯著降低，其中，樣品6#的纖維素含量最高，達(dá)50.2%，AIL木質(zhì)素含量最低，為21.0%，說明2.5%NaOH處理能夠有效去除檸條中木質(zhì)素，導(dǎo)致纖維素含量相對增加。經(jīng)白腐真菌處理后，纖維素和半纖維素含量均降低，說明白腐真菌降解檸條中的纖維素與半纖維素來獲得營養(yǎng)物質(zhì);L含量顯著高于所有處理后樣品及原料，說明白腐真菌能使檸條木質(zhì)素顯著改性，該過程主要是以微生物胞外酶為主導(dǎo)的酶促反應(yīng)，條件溫和，速度緩慢。不同預(yù)處理后檸條中的半纖維素含量均顯著降低，L含量均有所增加

12、，說明檸條中的半纖維素比較容易被破壞，不同預(yù)處理均能改性木質(zhì)素。結(jié)合不同預(yù)處理后酶解轉(zhuǎn)化率和主要成分的變化情況可以發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理后木質(zhì)素的脫除與改性是提高檸條酶解效率的關(guān)鍵因素。 2.3不同預(yù)處理樣品的總還原糖得率除酶解轉(zhuǎn)化率外，樣品的質(zhì)量損失在預(yù)處理方法評價中也是需要考慮的重要因素，因為幾乎所有的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法都無法避免樣品質(zhì)量損失，造成可轉(zhuǎn)化底物的流失?？傔€原糖得率以預(yù)處理前生物質(zhì)質(zhì)量為基礎(chǔ)，綜合考慮預(yù)處理后從液體部分和固體部分酶解所獲取的總還原糖量?？傔€原糖得率的計算過程引入了預(yù)處理引起的質(zhì)量損失，能夠從可轉(zhuǎn)化物質(zhì)產(chǎn)出的角度綜合評價不同預(yù)處理方法。稀硫酸處理樣品后，半纖維素(主要多

13、糖是木聚糖)被水解生成單糖和可溶性低聚糖［20］，因此水解液中會含有木糖等還原糖，經(jīng)稀H2SO4處理后總還原糖得率需要同時考慮水解液中糖得率和濾渣經(jīng)酶解后糖得率。收集水解液用DNS法測其中還原糖含量并根據(jù)處理前樣品質(zhì)量計算水解液中還原糖得率，結(jié)果見圖5(A)。由圖5(A)可知，稀硫酸處理水解液中還原糖得率也隨H2SO4濃度增大而增加。H2SO4濃度從0.1%增加到0.5%時，水解液中還原糖得率增加顯著;當(dāng)H2SO4濃度達(dá)到0.5%以后，繼續(xù)增加其濃度，水解液中還原糖得率提高不大。結(jié)果表明，當(dāng)H2SO4濃度達(dá)到0.5%時，增大其濃度樣品中基本無還原糖繼續(xù)釋放，可能是因為在此處理濃度下半纖維素已經(jīng)

14、基本水解完全，繼續(xù)增加處理強(qiáng)度只能引起部分纖維素非結(jié)晶區(qū)的水解。合并H2SO4處理后水解液中還原糖得率和濾渣經(jīng)酶解后的還原糖得率，即為不同濃度稀H2SO4處理后的總還原糖得率，結(jié)果見圖5(B)。由圖5(B)可知，當(dāng)H2SO4濃度在0～0.5%之間時，增加其濃度，所對應(yīng)的總還原糖得率也隨之增大而且增加速度較快;當(dāng)H2SO4濃度大于0.5%時，繼續(xù)增加H2SO4濃度，總還原糖得率變化不顯著。H2SO4濃度為0.5%時總還原糖得率最高，為17.9%，是未處理原料的3.3倍。經(jīng)NaOH處理后，濾液中主要為木質(zhì)素水解的產(chǎn)物，經(jīng)測定其中基本不含有糖類物質(zhì)，因此，堿處理樣品的總還原糖全部來源于處理后濾渣用纖

15、維素酶水解產(chǎn)生的糖，總還原糖得率見圖6。由圖6可知，0.5%～5.0%NaOH處理能有效提高檸條的總還原糖得率，濃度為0.5%和1%NaOH處理后樣品的總還原糖得率最高，達(dá)8.5%，比對照提高了55.6%;其次是經(jīng)濃度為5%和2.5%NaOH處理后的樣品。白腐菌處理后樣品總還原糖得率變化情況見圖7。由圖7可以看出，白腐菌處理3周的樣品總還原糖得率最高，為5.8%，但與對照相比沒有顯著性差異;延長生物處理時間到4～6周后，總還原糖得率降低且顯著低于未經(jīng)處理的對照樣品。這可能是由于白腐菌在破壞生物質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中，通過分泌胞外纖維素酶水解其中的纖維素，獲得葡萄糖作為碳源和能源，導(dǎo)致處理后樣品的可水解

16、底物減少，致使總還原糖得率不斷降低。綜合分析比較圖5～7可知，3種預(yù)處理方法對于檸條平茬廢棄物總還原糖得率的影響程度排序是，酸＞堿＞白腐真菌;其中，0.5%H2SO4處理后總還原糖得率最高，可達(dá)17.9%，比未處理原料提高2.3倍。 3結(jié)語 檸條是適宜于北方和西北干旱半干旱地區(qū)培育的灌木樹種［2］，富含纖維素和半纖維素，具有較高的飼用價值，亦可作為干旱地區(qū)的特色能源原料。但是，檸條中木質(zhì)素含量高，對外界因素的抗逆性強(qiáng)，不利于可轉(zhuǎn)化底物的釋放和充分利用，需要尋求有效的方式進(jìn)行預(yù)處理以提高檸條的利用率，拓展其應(yīng)用范圍。本項研究表明，稀硫酸處理后檸條的總還原糖得率是原料的3.3倍，預(yù)處理效果最好

17、，顯著高于堿法和微生物法。硫酸處理后水解液中釋放出大部分的半纖維素來源的糖，固體殘渣的酶解效率亦有所提高，酶解后殘渣主要為木質(zhì)素，熱值高，可作燃料，也可開發(fā)出其它高附加值產(chǎn)品。此外，測試表明檸條偏酸性，有利于酸處理過程中減少酸用量，但堿處理時用堿量大。因此，從可轉(zhuǎn)化底物的獲取來看，稀硫酸處理是檸條平茬廢棄物最佳的預(yù)處理方式。本研究從能源底物釋放方面比較了幾種預(yù)處理方式并獲得了最適宜的方法為稀硫酸預(yù)處理，但尚未涉及其工藝條件的優(yōu)化，后續(xù)稀硫酸預(yù)處理的工藝優(yōu)化及復(fù)合預(yù)處理方式促進(jìn)檸條能源化利用的研究正在進(jìn)行。在飼料領(lǐng)域，消化率低下是導(dǎo)致檸條作為飼料利用量小的直接原因［6］，堿處理和白腐真菌預(yù)處理均能有效提高檸條的酶解效率，因此可以考慮在檸條貯存過程中引入微生物和堿來提高檸條的利用效率。采用微生物處理通過菌種酶系的作用降解與改性檸條中木質(zhì)纖維素成分，結(jié)合堿法處理能夠有效地脫除檸條中的木質(zhì)素，不但能夠提高檸條在動物體內(nèi)的消化率，而且有利于改善檸條的適口性，增加其營養(yǎng)價值。 作者：徐春燕姚福軍張娜單位：寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室 上一個文章： 紅蠟蚧風(fēng)險探析下一個文章： 典型植被林冠結(jié)構(gòu)比較思考