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DNA的粗提取與鑒定,問題1：構(gòu)成生物體的主要遺傳物質(zhì)是什么？,問題2：如何證明它是遺傳物質(zhì)？,問題3：怎樣才能將細(xì)胞內(nèi)的這些物質(zhì)分離出來？,基礎(chǔ)知識(shí),1、提取生物大分子的基本思路 選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子,2、提取DNA的基本思路 利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分,一、提取DNA的原理,1、DNA的溶解性 ①DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同,①根據(jù)DNA在NaCl溶液中的溶解度曲線圖，思考在什么濃度下，DNA的溶解度最??？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？,②如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？,②、DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離,一、提取DNA的原理,2、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性 ①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響 ②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80度的高溫，而DNA在80度以上才會(huì)變性 ③洗滌劑可以瓦解細(xì)胞的細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì),但對(duì)DNA沒有影響,一、提取DNA的原理,3、DNA的鑒定： DNA與二苯胺（沸水?。?huì)染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),1、材料：魚卵、豬肝、菜花、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、菠菜、在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的大腸桿菌。（從中選取2～3種實(shí)驗(yàn)材料） 2、原則：凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大,（一）實(shí)驗(yàn)材料的選取,,本節(jié)課以雞血細(xì)胞為例來講述DNA的粗提取與鑒定,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),（二）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液,思考①：為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？,使雞血細(xì)胞吸水漲破，釋放DNA,思考②：加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？,洗滌劑含一些離子去污劑，能瓦解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放,食鹽的主要成分是氯化鈉，有利于DNA的溶解,思考③：如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生怎樣的影響？,DNA釋放不完全，提取的DNA偏少，二苯胺鑒定顏色不明顯,二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),討論：此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì),（三）去除濾液中的雜質(zhì),----這是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,（四）DNA析出與鑒定,三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,1.制備雞血細(xì)胞液：,在雞血中加入質(zhì)量濃度為0．1g/mL的檸檬酸鈉溶液，離心或靜置處理；除去血漿，留雞血細(xì)胞備用。,思考：加入檸檬酸鈉的作用是什么？,防止血液凝固,2.提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)：,向雞血細(xì)胞液中加入蒸餾水，用玻璃棒沿一個(gè)方向快速攪拌5min、用3-4層紗布過濾，取其濾液。,思考：如果是植物細(xì)胞，如何獲取植物細(xì)胞的核物質(zhì)？,去梗、剪碎、加洗滌劑和食鹽，充分研磨，過濾收集濾液,三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,3. 溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA：,加入2mol/L的氯化鈉溶液，用玻璃棒沿一個(gè)方向輕輕攪拌，使DNA呈溶解狀態(tài)。,4．析出含DNA的黏稠物：,沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒沿一個(gè)方向不停地輕輕攪拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)。當(dāng)黏稠物不再增加時(shí)時(shí)停止加入蒸餾水。,思考：此時(shí)加入蒸餾水的目的是什么？,降低氯化鈉溶液的濃度，析出DNA,三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,5. 濾取含DNA的黏稠物：,用3-4層紗布過濾，取紗布上的黏稠物。,6. 將DNA的黏稠物再溶解：,加入2mol/L的氯化鈉溶液，沿一個(gè)方向輕輕攪拌，使DNA呈溶解狀態(tài)。,7. 過濾含有DNA的氯化鈉溶液：,用放有2層紗布的漏斗過濾以上溶液，取其濾液。,三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì),三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,8. 提取含雜質(zhì)較少的DNA：,在上述濾液中，加入冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為95％的酒精溶液50 mL，并用玻棒沿一個(gè)方向攪拌，當(dāng)玻棒上的絲狀物不再增加時(shí)，卷起絲狀物，用濾紙吸取上面的水分。,思考：為什么加入的酒精需要冷卻的？,一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解； 二是降低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出； 三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂,思考：95%的酒精的作用是什么？,凝集DNA，溶解細(xì)胞中其他物質(zhì)，提純DNA,9. DNA的鑒定：,三、實(shí)例：用雞血細(xì)胞液提取DNA并鑒定,取兩支的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為0.015mol/L的氯化鈉溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4 mL的二苯胺試劑。將試管置于沸水中加熱5min，等試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化。,2次,3次,第1次和第三次取濾液，第二次取黏稠物,始終沿一個(gè)方向 除第一次外，其余都要輕輕攪拌，防止DNA斷裂,總結(jié),