《《蛋白質(zhì)化學(xué)》總復(fù)習(xí)》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《蛋白質(zhì)化學(xué)》總復(fù)習(xí)（82頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

1、 蛋 白 質(zhì) 化 學(xué) 總 復(fù) 習(xí) 課 程 內(nèi) 容 第 二 章 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 、 轉(zhuǎn) 運 、 加 工 與 修 飾 第 三 章 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 第 四 章 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 純 化 第 五 章 蛋 白 質(zhì) 定 性 定 量 檢 測 第 六 章 蛋 白 質(zhì) 的 生 物 信 息 學(xué) 第 七 章 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 理 論 與 進(jìn) 展 第 八 章 蛋 白 質(zhì) 芯 片 理 論 與 進(jìn) 展 第 二 章 蛋 白 質(zhì) 的 合 成 、 轉(zhuǎn) 運 、 加工 與 修 飾 基 本 概 念l SD序 列 /核 糖 體 結(jié) 合 位 點 （ RBS）l 信 號 肽l 分 子 伴 侶 回 答 問

2、 題 ：l 1 蛋 白 質(zhì) 在 生 物 體 內(nèi) 合 成 時 所 涉 及 的 幾 個 重 要 元 素是 什 么 ？ 它 們 的 結(jié) 構(gòu) 特 征 及 其 在 蛋 白 質(zhì) 生 物 合 成 中 的作 用 如 何 ？l 2 原 核 生 物 中 蛋 白 質(zhì) 合 成 過 程 分 哪 幾 個 階 段 ？ 對 每個 階 段 的 過 程 描 述 ； 每 個 階 段 所 涉 及 的 輔 助 因 子 及 其功 能 ？l 3. 原 核 細(xì) 胞 與 真 核 細(xì) 胞 的 核 糖 體 理 化 性 質(zhì) 比 較l 4 蛋 白 質(zhì) 在 細(xì) 胞 內(nèi) 跨 膜 位 移 過 程 中 所 涉 及 的 重 要 元素 有 哪 些 ？ 它 們 的

3、 結(jié) 構(gòu) 特 征 及 其 在 蛋 白 跨 膜 機 制 中 的作 用 如 何 ？ （ 簡 述 分 泌 性 蛋 白 質(zhì) 跨 膜 移 位 的 信 號 假 說 ） l 5 蛋 白 質(zhì) 合 成 后 一 級 結(jié) 構(gòu) 上 和 高 級 結(jié) 構(gòu) 上 的 修 飾 有哪 些 ？ 理 解 分 子 伴 侶 的 概 念 及 其 在 蛋 白 折 疊 中 的 作 用 。（ 蛋 白 質(zhì) 合 成 后 的 加 工 與 修 飾 ） 第 二 章 主 要 內(nèi) 容1 蛋 白 質(zhì) 在 生 物 體 內(nèi) 合 成 時 所 涉 及的 幾 個 重 要 元 素2 原 核 生 物 中 蛋 白 質(zhì) 合 成 過 程3 蛋 白 質(zhì) 在 細(xì) 胞 內(nèi) 跨 膜 位

4、移 過 程4. 蛋 白 質(zhì) 合 成 后 的 修 飾 1 蛋 白 質(zhì) 在 生 物 體 內(nèi) 合 成 時 所 涉及 的 幾 個 重 要 元 素 （ 1） 信 使 RNA（ messenger RNA, mRNA） （ 2） 遺 傳 密 碼 （ 3） 核 糖 體 （ 4） 轉(zhuǎn) 運 RNA（ transfer RNA, tRNA） （ 1） 信 使 RNA（ messenger RNA, mRNA） SD序 列 /核 糖 體 結(jié) 合 位 點 （ RBS） ： 原 核 細(xì) 胞 mRNA的 翻 譯 起始 密 碼 子 AUG的 上 游 相 距 8 13個 核 苷 酸 處 有 一 段 由 6 8個 核苷 酸 組

5、 成 的 富 含 嘌 呤 的 序 列 ， 以 5-AGGAGG-3為 核 心 ， 它 與核 糖 體 小 亞 基 上 的 16S-rRNA 的 近 3末 端 處 的 一 段 短 序 列 互 補 。 （ 2） 遺 傳 密 碼 三 聯(lián) 體 密 碼 （ triplet code） /密 碼 子 （ codon） ：mRNA采 用 每 三 個 相 鄰 堿 基 編 碼 一 個 氨 基 酸 。 61個 密 碼 分 別 代 表 各 種 氨 基 酸 （ amino acid， aa） 。一 種 aa少 的 只 有 1個 密 碼 （ 色 氨 酸 和 蛋 氨 酸 ） ， 多 的 可有 6個 ， 但 以 2個 和 4

6、個 居 多 。 終 止 密 碼 子 ： UAA、 UGA和 UAG。 起 始 密 碼 子 /蛋 氨 酸 密 碼 子 ： AUG（ 91 ） /GUG（ 8 ） 。 遺 傳 密 碼 的 特 點 ： 遺 傳 密 碼 的 連 續(xù) 性 、 通 用 性 、 簡 并性 、 擺 動 性 、 不 重 疊 性 （ 3） 核 糖 體 核 糖 體 上 的 4個 活 性 部 位 ：l 受 位 /A位 ： 氨 酰 基 位 點 。 即 接 受 氨 酰 -tRNA的 部 位 。l 供 位 /P位 ： 肽 酰 基 位 點 。 肽 基 -tRNA移 交 肽 鏈 后 ， tRNA被 釋放 的 部 位 。l 肽 基 轉(zhuǎn) 移 酶 /

7、轉(zhuǎn) 肽 酶 位 ： 肽 鏈 合 成 過 程 中 催 化 形 成 肽 鍵 的 酶 活性 部 位 。l GTP酶 位 ： 可 水 解 GTP， 為 催 化 肽 基 -tRNA由 A位 轉(zhuǎn) 到 P位 提供 能 量 的 酶 活 性 部 位 。 核 糖 體 的 存 在 形 式 ： l 核 糖 體 單 體 無 蛋 白 合 成 功 能l 多 聚 核 糖 體 ： 與 mRNA結(jié) 合 具 有 蛋 白 合 成 功 能 游 離 核 糖 體 結(jié) 合 核 糖 體 （ 與 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 膜 結(jié) 合 ） 原 核 細(xì) 胞 與 真 核 細(xì) 胞 的 核 糖 體 理 化 性 質(zhì) 比 較 （ 見 課 件 ） （ 4） 轉(zhuǎn) 運 RNA（

8、 transfer RNA, tRNA） 特 點 ： 分 子 量 較 小 ， 沉 降 系 數(shù) 約 為 4S， 約 占 細(xì) 胞 中 RNA總 含量 的 10 15 ， 在 蛋 白 質(zhì) 合 成 時 起 搬 運 氨 基 酸 的 作 用 。 它 對不 同 的 氨 基 酸 有 特 異 性 ， 一 種 tRNA只 能 搬 運 一 種 氨 基 酸 。 與 蛋 白 質(zhì) 合 成 有 關(guān) 的 位 點l 氨 基 酸 （ aa） 結(jié) 合 位 點l 反 密 碼 子 位 點l 識 別 aa-tRNA合 成 酶 的 位 點 。 翻 譯 過 程 中 行 使 “ 起 動 ” 作 用 的 tRNA： 能 特 異 地 識 別起 始

9、 密 碼 子 AUG蛋 氨 酰 -tRNA（ 真 核 細(xì) 胞 ） ； 甲酰 蛋 氨 酰 -tRNA（ 原 核 細(xì) 胞 或 線 粒 體 ） 氨 酰 -tRNA合 成 酶 的 專 一 性 ：l 對 aa有 極 高 的 專 一 性 ， 每 種 aa都 有 一 個 專 一 的 酶 。l 只 作 用 于 L-氨 基 酸 ， 不 作 用 于 D-氨 基 酸 。l 有 的 酶 對 aa的 專 一 性 并 不 很 高 ， 但 對 tRNA卻 有 極 高 的 專 一 性 。 2 原 核 生 物 中 蛋 白 質(zhì) 合 成 過 程 （ 1） 起 始 過 程 （ 4） 原 核 生 物 中 蛋 白 質(zhì) 合 成 過 程 所

10、 涉 及的 蛋 白 因 子 （ 1） 起 始 過 程 大 小 亞 基 分 開 （ 在 IF-3作 用 下 ） ； mRNA與 小 亞 基 結(jié) 合 形 成 30S起 始 復(fù) 合 物 ：在IF-2作用下，fMet-tRNAt與mRNA分子中的AUG相結(jié)合（在P位上），即密碼子與反密碼子配對，形成30S起始復(fù)合物） 大 小 亞 基 結(jié) 合 ， 形 成 有 生 物 學(xué) 功 能 的 70S起 始 復(fù) 合 物 。 此時核糖體的位被fMet-tRNA和占據(jù)；而A位則空著，有待于對應(yīng)mRNA中第二個密碼的相應(yīng)氨基酰tRNA進(jìn)入，從而進(jìn)入延伸階段。 進(jìn) 位 ： Tu-GTP與 aa2- tRNA2結(jié) 合 成 復(fù)

11、 合 物 ； aa2- tRNA2與 A位點 上 mRNA密 碼 子 結(jié) 合 ； 重 新 生 成 Tu-GTP。 肽 鍵 形 成 ： 在 轉(zhuǎn) 肽 酶 作 用 下 ， 形 成 肽 鍵 ， 成 2肽 ； P位 點 上 fMet與 tRNA脫 離 ； 此 時 ， P位 空 出 。 移 位 ： 在 移 位 酶 (G)作 用 下 ， 消 耗 1個 GTP,核 糖 體 沿 mRNA 5 3 移 動 了 1個 密 碼 子 的 距 離 .； A位 上 的 肽 酰 - tRNA到 P位 ，原 來 P位 上 無 負(fù) 載 的 tRNA離 開 核 糖 體 。 (此時核糖體的A位空著， 有待于接受下一個aan- tRN

12、An) 重 復(fù) 至 肽 鏈 必 需 長 度 。 RF與 mRNA終 止 信 號 結(jié) 合 ， 激 活 轉(zhuǎn) 肽 酶 ； 水 解 肽 鏈 和 tRNA間 的 鍵 ， 新 合 成 肽 鏈 、 tRNA、mRNA離 開 核 糖 體 ， 后 者 即 解 離 成 大 、 小 亞 基 ， 進(jìn) 入下 一 輪 反 應(yīng) 。 （ 4） 原 核 生 物 中 蛋 白 質(zhì) 合 成 過 程 所 涉及 的 蛋 白 因 子 起 始 因 子 （ IF1、 IF2、 IF3）l IF1： 無 專 門 功 能 ， 協(xié) 助 IF2和 IF3的 作 用 。l IF2： IF2先 與 GTP結(jié) 合 ， 再 結(jié) 合 fmet-tRNA， 形

13、成 fmet-tRNA-IF2-GTP復(fù) 合 物 ， 同 時 推 動 mRNA在 30S亞 基 上 移 動 ， 使 fmet-tRNA到達(dá) P位 。l IF3： 翻 譯 起 始 時 結(jié) 合 于 核 糖 體 30S亞 基 靠 近 50S亞 基 的 邊 界 ， 使 大小 亞 基 拆 離 。 延 長 因 子 （ EF）l EF-Tu： 按 mRNA編 碼 序 列 攜 帶 氨 酰 -tRNA進(jìn) 入 A位 。 l EF-Ts： 使 EF-Tu和 GTP再 生 ， 參 與 肽 鏈 延 長 。l EFG： 具 有 轉(zhuǎn) 位 酶 活 性 。 使 肽 酰 -tRNA從 A位 轉(zhuǎn) 移 到 P位 。 釋 放 因 子

14、（ RF， RR）l RF： 辨 認(rèn) 終 止 密 碼 子 和 促 進(jìn) 肽 鏈 C端 與 tRNA 3-OH酯 鍵 的 水 解 ， 使肽 鏈 從 翻 譯 中 的 核 糖 體 上 釋 放 下 來 。 RF1： 辨 認(rèn) UAA和 UAG， 進(jìn) 入 A位 。 RF2： 辨 認(rèn) UAA和 UGA， 進(jìn) 入 A位 。 RF3： 激 活 核 糖 體 上 的 轉(zhuǎn) 肽 酶 。 轉(zhuǎn) 肽 酶 受 RF3作 用 后 發(fā) 生 變 構(gòu) ， 表 現(xiàn) 出 酯 酶的 水 解 活 性 ， 水 解 肽 酰 -tRNA之 間 的 酯 鍵 ， 使 P位 上 的 肽 與 tRNA分 離 。l RR： 使 tRNA、 mRNA及 RF均

15、從 核 糖 體 脫 落 。 3 蛋 白 質(zhì) 在 細(xì) 胞 內(nèi) 跨 膜 位 移 過 程 （ 1） 信 號 假 說 中 涉 及 的 幾 個 重 要 元 素l 信 號 肽 l 信 號 識 別 顆 粒 （ SRP）l SRP受 體 （ SRP-R） l 移 位 子 （ 易 位 子 ） （ 2） 蛋 白 質(zhì) 跨 膜 位 移 的 機 制 4. 蛋 白 質(zhì) 合 成 后 的 加 工 與 修 飾 （ 1） 一 級 結(jié) 構(gòu) 的 加 工 與 修 飾 -共 價 修 飾l 蛋 白 質(zhì) 前 體 的 剪 切 。 包 括 信 號 肽 、 前 導(dǎo) 肽 或 插 入 肽 的 剪 切 。l 氨 基 酸 側(cè) 鏈 的 共 價 修 飾 。

16、糖 基 化 、 羧 基 化 、 磷 酸 化 、 乙 酰 化 、甲 基 化 、 二 硫 鍵 的 形 成 （ 多 肽 鏈 內(nèi) 或 鏈 間 ） 和 脂 基 化 等 。l 去 除 N-甲 酰 基 或 N-蛋 氨 酸 。l 水 解 修 飾 。 指 一 條 多 肽 鏈 經(jīng) 翻 譯 后 加 工 產(chǎn) 生 多 種 不 同 活 性 的蛋 白 質(zhì) 或 肽 。 （ 2） 高 級 結(jié) 構(gòu) 的 加 工 與 修 飾l 蛋 白 質(zhì) 亞 基 的 聚 合 具 有 四 級 結(jié) 構(gòu) 的 蛋 白 質(zhì) 由 兩 條 以 上 的肽 鏈 通 過 非 共 價 鍵 聚 合 ， 形 成 寡 聚 體 蛋 白 質(zhì) 。 l 輔 基 鏈 接 形 成 結(jié) 合

17、 蛋 白 質(zhì) 。l 分 子 伴 侶 （ molecular chaperones ） ： 一 類 參 與 蛋 白 質(zhì) 的轉(zhuǎn) 運 、 折 疊 、 聚 合 和 解 聚 、 錯 誤 折 疊 后 的 重 新 折 疊 、 水 解 以及 原 始 蛋 白 質(zhì) 活 性 的 調(diào) 控 等 一 系 列 功 能 的 保 守 蛋 白 質(zhì) 家 族 。 第 三 章 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 基 本 概 念l 氨 基 酸 （ aa） 的 結(jié) 構(gòu)l 物 質(zhì) 的 構(gòu) 型 和 構(gòu) 象l 肽 鍵 與 異 肽 鍵l 肽 單 元 /肽 鍵 平 面l 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu)l 蛋 白 質(zhì) 的 二 級 結(jié) 構(gòu)l 蛋 白 質(zhì)

18、 的 超 二 級 結(jié) 構(gòu)l 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 域 l 蛋 白 質(zhì) 的 三 級 結(jié) 構(gòu)l 蛋 白 質(zhì) 的 四 級 結(jié) 構(gòu)l 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué)l 蛋 白 質(zhì) 工 程 回 答 問 題 ：l 1 蛋 白 質(zhì) 的 各 種 結(jié) 構(gòu) 層 次 的 基 本 概 念 和 特 點 ？l 2. 肽 鍵 和 異 肽 鍵 的 區(qū) 別 ？ 肽 鍵 的 結(jié) 構(gòu) 特 征 。l 3. 二 級 結(jié) 構(gòu) 的 分 類 及 其 形 成 的 內(nèi) 在 原 因 ？ -螺 旋 的結(jié) 構(gòu) 特 點 ?-折 疊 /-片 層 的 結(jié) 構(gòu) 特 點 ?-轉(zhuǎn) 角 的 結(jié) 構(gòu)特 點 ?l 4. 蛋 白 質(zhì) 的 超 二 級 結(jié) 構(gòu) 及 其 組 合 方 式

19、 ； 超 二 級 結(jié) 構(gòu)和 結(jié) 構(gòu) 域 的 區(qū) 別 與 聯(lián) 系 。l 5. 維 系 蛋 白 三 級 結(jié) 構(gòu) 的 主 要 作 用 力 有 哪 些 ？ 什 么 情況 下 蛋 白 質(zhì) 存 在 四 級 結(jié) 構(gòu) ？l 6 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué) 的 基 本 概 念 ？ 蛋 白 質(zhì) 工 程 的 基 本 概 念 ？蛋 白 質(zhì) 工 程 與 基 因 工 程 的 區(qū) 別 與 聯(lián) 系 ？ 第 三 章 主 要 內(nèi) 容1 蛋 白 質(zhì) 的 各 種 結(jié) 構(gòu) 層 次2 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué) 1 蛋 白 質(zhì) 的 各 種 結(jié) 構(gòu) 層 次 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 氨 基 酸 和 肽 鍵 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 蛋

20、 白 質(zhì) 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 質(zhì) 的 超 二 級 結(jié) 構(gòu) ： 在 多 肽 鏈 內(nèi) 順 序 上 相 互 鄰 近 的 二 級 結(jié) 構(gòu)常 常 在 空 間 折 疊 中 靠 近 ， 彼 此 相 互 作 用 ， 形 成 規(guī) 則 的 二 級 結(jié) 構(gòu)組 合 體 。 它 們 可 直 接 作 為 三 級 結(jié) 構(gòu) 的 “ 建 筑 塊 ” 或 結(jié) 構(gòu) 域 的 組成 單 位 ， 是 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 中 二 級 結(jié) 構(gòu) 與 三 級 結(jié) 構(gòu) 之 間 的 一 個 層 次 ，故 稱 超 二 級 結(jié) 構(gòu) 。l 目 前 發(fā) 現(xiàn) 的 超 二 級 結(jié) 構(gòu) 有 三 種 組 合 方 式 ： -螺 旋 組 合 ()； -折 疊

21、組 合 ()和 -螺 旋 -折 疊 組 合 ()， 其 中 以 組 合 最 為常 見 。 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 域 ： 是 蛋 白 質(zhì) 構(gòu) 象 中 二 級 結(jié) 構(gòu) 與 三 級 結(jié) 構(gòu) 之 間 的一 個 層 次 。 在 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 ， 由 于 多 肽 鏈 上 相 鄰 的 超 二級 結(jié) 構(gòu) 緊 密 聯(lián) 系 ， 形 成 二 個 或 多 個 在 空 間 上 可 以 明 顯 區(qū) 別 它 與蛋 白 質(zhì) 亞 基 結(jié) 構(gòu) 的 區(qū) 域 。 一 般 每 個 結(jié) 構(gòu) 域 約 由 100 200個 氨 基酸 殘 基 組 成 ， 各 有 獨 特 的 空 間 構(gòu) 象 ， 并 承 擔(dān) 不 同 的

22、生 物 學(xué) 功 能 。 蛋 白 質(zhì) 的 蛋 白 質(zhì) 的 2 酶 的 催 化 機 械 支 持 運 輸 和 儲 存 協(xié) 調(diào) 動 作 免 疫 保 護(hù) 生 長 和 分 化 的 控 制 神 經(jīng) 沖 動 的 傳 遞 細(xì) 胞 內(nèi) 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 跨 膜 運 輸 電 子 傳 遞 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué) ： 以 分 子 生 物 物 理 學(xué) 為 基 礎(chǔ) ， 結(jié) 合 化 學(xué) 和 分 子 生物 學(xué) 方 法 測 定 生 物 大 分 子 復(fù) 合 體 的 空 間 結(jié) 構(gòu) 、 精 細(xì) 結(jié) 構(gòu) 以 及結(jié) 構(gòu) 的 運 動 ， 闡 明 其 相 互 作 用 的 規(guī) 律 和 發(fā) 揮 生 物 功 能 的 機 制 ，從 而

23、 揭 示 生 命 現(xiàn) 象 本 質(zhì) 的 科 學(xué) 。 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 生 物 學(xué) 的 研 究 方 法l 借 助 現(xiàn) 代 分 析 手 段 （ X線 晶 體 學(xué) 、 核 磁 共 振 及 電 子 晶 體 學(xué) 等 ） 直 接 得到 蛋 白 質(zhì) 三 維 構(gòu) 象 的 信 息 ；l 借 助 數(shù) 學(xué) 模 型 、 計 算 機 軟 件 等 工 具 ， 根 據(jù) 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 來 預(yù) 測其 空 間 結(jié) 構(gòu) 。l 利 用 蛋 白 質(zhì) 工 程 的 技 術(shù) 手 段 ， 得 到 非 天 然 存 在 的 蛋 白 質(zhì) 。 蛋 白 質(zhì) 工 程 是 指 通 過 蛋 白 質(zhì) 化 學(xué) 、 蛋 白 質(zhì) 晶 體 學(xué) 和

24、 蛋 白 質(zhì) 動力 學(xué) 等 研 究 獲 取 關(guān) 于 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 和 物 化 性 質(zhì) 等 方 面 的 信 息 ，在 此 基 礎(chǔ) 上 對 編 碼 該 蛋 白 的 基 因 進(jìn) 行 有 目 的 的 設(shè) 計 改 造 ， 并通 過 基 因 工 程 等 手 段 將 其 進(jìn) 行 表 達(dá) 和 分 離 純 化 ， 最 終 將 其 投入 實 際 應(yīng) 用 。 它 以 現(xiàn) 有 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 為 基 礎(chǔ) ， 以 制 造具 有 新 性 能 的 新 型 蛋 白 質(zhì) 為 最 終 目 的 。 第 四 章 蛋 白 質(zhì) 的 分 離 純 化 基 本 概 念l 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點l 蛋 白 質(zhì) 的

25、變 性 、 蛋 白 質(zhì) 的 復(fù) 性l 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 、 鹽 析 法l 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 絮 作 用 、 蛋 白 質(zhì) 的 凝 固l 蛋 白 質(zhì) 的 紫 外 吸 收 、 蛋 白 質(zhì) 的 呈 色 反 應(yīng)l 差 速 離 心 、 密 度 梯 度 離 心l 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 （ PAGE） 、 SDS-PAGEl 梯 度 膠 電 泳 l 等 電 聚 焦 電 泳 （ IEF）l IEF/SDS-PAGE聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 雙 向 電 泳 （ 2-DE） l 毛 細(xì) 管 電 泳l 回 答 問 題 ：l 1 蛋 白 質(zhì) 有 哪 些 理 化 性 質(zhì) ？ 等 電 點 、 酸 性

26、 蛋 白 、 堿 性蛋 白 的 概 念 ？ 可 逆 沉 淀 和 不 可 逆 沉 淀 、 可 逆 變 性 和 不可 逆 變 性 的 概 念 ？l 2 蛋 白 質(zhì) 分 離 純 化 的 常 用 方 法 有 哪 些 ？ 理 解 每 種 方 法的 基 本 原 理 和 分 類 分 離 純 化 蛋 白 質(zhì) 樣 品 的 常 用 沉淀 法 有 哪 幾 種 ？ 膜 分 離 法 的 分 類 。 SDS在 SDS-PAGE中 的 主 要 作 用 。 l 4. IEF/SDS-PAGE與 其 單 相 電 泳 具 體 操 作 的 差 別 ； 電泳 后 蛋 白 質(zhì) 的 回 收 方 法 。 第 四 章 主 要 內(nèi) 容1. 蛋

27、 白 質(zhì) 的 理 化 性 質(zhì)2. 蛋 白 質(zhì) 分 離 純 化 的 常 用 方 法3. 電 泳 技 術(shù) 1 蛋 白 質(zhì) 的 理 化 性 質(zhì) （ 1） 蛋 白 質(zhì) 的 兩 性 電 離 特 性 （ 2） 蛋 白 質(zhì) 的 膠 體 性 質(zhì) （ 3） 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 特 性 （ 4） 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 （ 5） 蛋 白 質(zhì) 的 紫 外 吸 收 特 性 （ 6） 蛋 白 質(zhì) 的 顯 色 反 應(yīng) （ 1） 蛋 白 質(zhì) 的 兩 性 電 離 特 性 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點 ： 當(dāng) 蛋 白 質(zhì) 溶 液 處 于 某 一pH時 ， 蛋 白 質(zhì) 解 離 成 正 、 負(fù) 離 子 的 趨 勢相 等 ， 即

28、成 為 兼 性 離 子 ， 凈 電 荷 為 零 ， 此時 溶 液 的 pH值 稱 為 蛋 白 質(zhì) 的 等 電 點 。 酸 性 蛋 白 （ pI7） 當(dāng) 蛋 白 質(zhì) 溶 液 的 pH大 于 等 電 點 時 ， 該 蛋白 質(zhì) 帶 負(fù) 電 荷 ， 反 之 則 帶 正 電 荷 。 （ 2） 蛋 白 質(zhì) 的 膠 體 性 質(zhì) 由 于 蛋 白 質(zhì) 屬 高 分 子 物 質(zhì) （ 分 子 量 范 圍 101000 kDa） ， 它 在 水 中 的 顆 粒 大 小 約 1100nm， 能 夠 形 成 膠 體 溶 液 。 蛋 白 質(zhì) 形 成 親 水 膠 體 溶 液 的 穩(wěn) 定 因 素 ： 分 子表 面 的 水 化 層

29、 和 電 荷 層 。 蛋 白 質(zhì) 溶 液 具 有 膠 體 溶 液 的 典 型 性 質(zhì) ， 如 擴散 慢 、 黏 度 大 、 不 能 透 過 半 透 膜 等 應(yīng) 用 ： 由 于 膠 體 溶 液 中 的 蛋 白 質(zhì) 不 能 通 過 半透 膜 ， 因 此 可 以 應(yīng) 用 透 析 法 將 非 蛋 白 的 小 分子 雜 質(zhì) 除 去 。 （ 3） 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 特 性 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 ： 蛋 白 質(zhì) 分 子 凝 聚 而 從 溶 液 中 析出 的 現(xiàn) 象 。l 可 逆 沉 淀 ： 在 沉 淀 過 程 中 ， 結(jié) 構(gòu) 和 性 質(zhì) 都 沒 有 發(fā)生 變 化 ， 在 適 當(dāng) 的 條 件 下 ，

30、可 以 重 新 溶 解 形 成 溶液 ， 所 以 這 種 沉 淀 又 稱 為 非 變 性 沉 淀 （ 或 可 逆 沉淀 ） 。l 不 可 逆 沉 淀 ： 在 強 烈 沉 淀 條 件 下 ， 不 僅 破 壞 了 蛋白 質(zhì) 膠 體 溶 液 的 穩(wěn) 定 性 ， 而 且 也 破 壞 了 蛋 白 質(zhì) 的結(jié) 構(gòu) 和 性 質(zhì) ， 產(chǎn) 生 的 蛋 白 質(zhì) 沉 淀 不 可 能 再 重 新 溶解 于 水 。 由 于 沉 淀 過 程 發(fā) 生 了 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 和 性質(zhì) 的 變 化 ， 所 以 又 稱 為 變 性 沉 淀 。 （ 4） 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 ： 在 某 些 物 理

31、或 化 學(xué) 因 素 作 用 下 ， 蛋 白 質(zhì) 的 空 間 構(gòu) 象破 壞 （ 不 包 括 肽 鏈 的 斷 裂 等 一 級 結(jié) 構(gòu) 變 化 ） ， 導(dǎo) 致 蛋 白 質(zhì) 若 干 理 化性 質(zhì) 和 生 物 學(xué) 活 性 的 改 變 。l 可 逆 變 性 ： 蛋 白 質(zhì) 在 變 性 后 ， 除 去 變 性 因 素 仍 可 恢 復(fù) 其 活 性 ， 稱 為可 逆 變 性 （ 可 逆 變 性 也 是 蛋 白 純 化 中 常 用 的 一 種 手 段 ） 。l 不 可 逆 變 性 ： 蛋 白 質(zhì) 變 性 時 其 空 間 結(jié) 構(gòu) 嚴(yán) 重 破 壞 ， 除 去 變 性 因 素 后不 能 恢 復(fù) 其 生 物 學(xué) 活 性

32、， 稱 為 不 可 逆 變 性 。 蛋 白 質(zhì) 變 性 的 因 素 ：l 物 理 因 素 ： 高 溫 、 高 壓 、 紫 外 線 、 X射 線 照 射 、 超 聲 波 、 劇 烈 震 蕩 和劇 烈 攪 拌 等 。 l 化 學(xué) 因 素 ： 強 酸 、 強 堿 、 重 金 屬 鹽 、 有 機 溶 劑 、 尿 素 和 十 二 烷 基 磺酸 鈉 （ SDS） 等 。 生 物 學(xué) 活 性 的 喪 失 并 不 一 定 完 全 是 變 性 的 結(jié) 果 ， 如 蛋 白 質(zhì) 肽 鏈 水 解斷 裂 、 去 除 輔 基 和 應(yīng) 用 抑 制 劑 等 ， 均 可 導(dǎo) 致 蛋 白 質(zhì) 失 活 。 蛋 白 質(zhì) 的 復(fù) 性

33、： 若 蛋 白 質(zhì) 變 性 程 度 較 輕 ， 去 除 變 性 因 素 后 ， 有 些 蛋白 質(zhì) 仍 可 恢 復(fù) 或 部 分 恢 復(fù) 其 原 來 的 構(gòu) 象 及 功 能 。 蛋 白 質(zhì) 變 性 的 發(fā) 展l 結(jié) 絮 作 用 ： 通 過 強 酸 /強 堿 變 性 后 的 蛋 白 ， 當(dāng) 溶 液 的 pH調(diào) 到 其 等 電 點時 ， 蛋 白 質(zhì) 會 形 成 絮 狀 的 不 溶 物 ， 稱 為 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 絮 作 用 。l 凝 固 作 用 ： 結(jié) 絮 后 的 蛋 白 進(jìn) 行 加 熱 后 會 變 為 比 較 堅 固 的 凝 塊 ， 稱 為蛋 白 質(zhì) 的 凝 固 作 用 。 如 ： 煮 熟 的

34、雞 蛋 、 豆 腐 的 形 成 等 。 （ 5） 蛋 白 質(zhì) 的 紫 外 吸 收 特 性 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 有 含 有 共 軛 雙 健 的 酪 氨 酸 、 色氨 酸 等 殘 基 在 280nm波 長 下 具 有 最 大 光 吸 收 。因 此 280nm的 光 吸 收 度 是 蛋 白 質(zhì) 的 一 種 普 遍性 質(zhì) 。 在 一 定 波 長 范 圍 內(nèi) ， 蛋 白 質(zhì) 溶 液 在280nm吸 光 度 與 其 濃 度 成 正 比 ， 故 可 作 定 量測 定 。 （ 6） 蛋 白 質(zhì) 的 顯 色 反 應(yīng) 茚 三 酮 反 應(yīng) ： 還 原 型 的 茚 三 酮 可 與 氨 基酸 加 熱 分 解 產(chǎn) 生

35、 的 氨 結(jié) 合 ， 再 于 另 一 分子 茚 三 酮 縮 合 成 為 藍(lán) 紫 色 的 化 合 物 。 此化 合 物 的 最 大 吸 收 峰 在 570 nm波 長 處 。由 于 此 吸 收 峰 值 的 大 小 與 氨 基 酸 釋 放 出的 氨 量 成 正 比 ， 因 此 可 作 為 氨 基 酸 定 量分 析 方 法 。 雙 縮 脲 反 應(yīng) ： 蛋 白 質(zhì) 和 多 肽 分 子 在 堿 性溶 液 中 與 硫 酸 銅 共 熱 ， 呈 現(xiàn) 紫 色 或 紅 色 ，稱 為 雙 縮 脲 反 應(yīng) 。 2 蛋 白 質(zhì) 分 離 純 化 的 常 用 方 法（ 1） 離 心 法（ 2） 沉 淀 法 （ 3） 膜 分

36、 離 法 （ 1） 離 心 法 沉 降 速 度 法 /差 速 離 心 ： 如 果 兩 種 蛋 白 質(zhì) 的 沉 降 系 數(shù) 相 差 一 個數(shù) 量 級 以 上 ， 可 用 差 速 離 心 ， 反 復(fù) 多 次 達(dá) 到 分 離 效 果 。 開 始在 一 個 較 低 的 速 度 下 離 心 ， 使 沉 降 系 數(shù) 大 的 物 質(zhì) 沉 淀 ， 其 他物 質(zhì) 仍 保 留 在 溶 液 中 。 取 上 清 ， 在 更 大 的 離 心 場 中 再 離 心 ，又 會 獲 得 一 些 沉 淀 物 質(zhì) ， 如 此 反 復(fù) 多 次 ， 便 可 使 混 合 物 逐 級被 分 開 。 密 度 梯 度 離 心 ： 如 果 兩

37、種 蛋 白 質(zhì) 的 沉 降 系 數(shù) 相 差 不 到 一 個 數(shù)量 級 ， 用 差 速 離 心 很 難 奏 效 ， 若 改 用 密 度 梯 度 離 心 ， 便 可 獲得 比 較 滿 意 的 分 離 效 果 。 在 離 心 管 中 造 成 一 個 梯 度 密 度 環(huán) 境 ，使 介 質(zhì) 的 最 大 密 度 大 于 分 離 物 的 最 大 密 度 。 而 后 加 入 待 分 離物 ， 在 離 心 力 的 作 用 下 ， 當(dāng) 分 離 物 的 密 度 與 介 質(zhì) 密 度 相 等 時 ，分 離 物 即 停 留 在 與 其 密 度 相 同 的 區(qū) 域 ， 從 而 達(dá) 到 分 離 目 的 。 l 離 心 時 離

38、 心 管 中 的 介 質(zhì) 是 不 均 一 的 ， 從 近 中 心 到 遠(yuǎn) 中 心 密 度不 斷 增 加 ， 形 成 梯 度 。 常 用 的 梯 度 介 質(zhì) 有 甘 油 、 蔗 糖 、 溴 化鉀 、 氯 化 銫 。 （ 2） 沉 淀 法 等 電 點 沉 淀 法 ： 蛋 白 質(zhì) 分 子 在 等 電 點 時 ， 凈 電 荷 為 零 ，分 子 之 間 的 靜 電 排 斥 力 最 小 ， 因 而 容 易 聚 集 形 成 沉 淀 。 有 機 溶 劑 沉 淀 蛋 白 質(zhì) ： 可 與 水 混 合 的 有 機 溶 劑 ， 如 酒精 、 甲 醇 和 丙 酮 等 ， 對 水 的 親 和 力 很 大 ， 能 破 壞

39、蛋 白質(zhì) 顆 粒 的 水 化 膜 ， 在 等 電 點 時 使 蛋 白 質(zhì) 沉 淀 。 鹽 析 法 ： 在 蛋 白 質(zhì) 溶 液 中 加 入 大 量 的 中 性 鹽 以 破 壞 蛋白 質(zhì) 的 膠 體 穩(wěn) 定 性 而 使 其 析 出 。 常 用 的 中 性 鹽 有 硫 酸銨 、 硫 酸 鈉 、 氯 化 鈉 等 。有 機 沉 淀 劑 與 水 分 子 通 過氫 鍵 結(jié) 合 ， 使 溶 質(zhì) 溶 解 度 降 低 ， 從 而 得 到 沉 淀 。 沉 淀劑 為 非 離 子 聚 合 物 ， 如 ： PEG 聚 乙 二 醇 （ PEG2000、 PEG4000和 PEG6000） 、 PVP及 葡 聚 糖 等 。

40、（ 3） 膜 分 離 法 定 義 分 類 根 據(jù) 推 動 力 不 同 ， 可 分 為 ： 透 析 法（Dialysis，DS） （ 以 膜 兩 側(cè) 的濃 度 差 為 推 動 力 ） 膜 過 濾 法 （ 以 膜 兩 側(cè) 的 壓 力 差 為 推 動 力） 根 據(jù) 膜 孔 徑 大 小 不 同 ， 膜 過 濾 法 可 分 為 ： 微 過 濾（Microfiltration，MF） 超 濾（Ultrafiltration，UF） 反 滲 透 法（Reverse osmosis，RO） 納 濾 法 (Nanofiltration， NF) （ 1） 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 （ 2） 等 電 聚

41、 焦 電 泳 （ 3） 雙 向 凝 膠 電 泳 （ 4） 毛 細(xì) 管 電 泳 （ 1） 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 的 形 成 原 理 ： 是 由 單 體 丙 烯 酰 胺（ Acrylamide， Acr） 和 交 聯(lián) 劑 N， N-甲 叉 雙 丙 烯 酰 胺（ Bisacrylamide， Bis） ， 在 加 速 劑 四 甲 基 乙 二 胺（ TEMED） 和 催 化 劑 過 硫 酸 銨 （ AP） 的 作 用 下 聚 合 交 聯(lián) 成三 維 網(wǎng) 狀 結(jié) 構(gòu) 的 凝 膠 。 蛋 白 質(zhì) 被 PAGE電 泳 所 分 離 ， 主 要 基 于 電 荷 效 應(yīng) 和

42、 分 子 篩 效應(yīng) 。 如 果 緩 沖 液 系 統(tǒng) 為 不 連 續(xù) 系 統(tǒng) ， 還 要 加 上 濃 縮 效 應(yīng) （ 凝膠 濃 度 的 不 連 續(xù) 性 、 離 子 成 分 及 pH的 不 連 續(xù) 性 、 電 位 梯 度的 不 連 續(xù) 性 ） 。 當(dāng) 所 分 離 的 蛋 白 成 分 復(fù) 雜 、 分 子 質(zhì) 量 范 圍 較 大 時 ， 使 用 濃 度梯 度 PAGE進(jìn) 行 分 離 效 果 更 好 。 l 濃 度 梯 度 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 是 指 隨 著 凝 膠 濃 度 逐 漸 增 高 ， 凝膠 孔 徑 逐 漸 減 小 ， 不 同 大 小 蛋 白 質(zhì) 分 子 的 移 動 就 會 在

43、不 同 的 區(qū)域 受 阻 ， 形 成 較 窄 的 區(qū) 帶 。 SDS-PAGE的 原 理 SDS在 SDS-PAGE中 的 作 用 是 什 么 ？ （ 2） 等 電 聚 焦 電 泳 等 電 聚 焦 （ isoelectrofocusing， IEF） 聚丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 的 原 理 ： 等 電 聚 焦 就 是 在電 解 槽 中 放 入 載 體 兩 性 電 解 質(zhì) ， 當(dāng) 通 以 直 流電 時 ， 即 形 成 一 個 由 陽 極 到 陰 極 逐 步 增 加 的pH梯 度 。 蛋 白 質(zhì) 在 此 體 系 中 因 解 離 而 帶 不同 的 電 荷 ， 其 泳 動 率 也 不 同 。 各

44、 蛋 白 質(zhì) 分 子泳 動 到 各 自 的 等 電 點 時 即 停 止 移 動 ， 形 成 很窄 的 一 個 區(qū) 帶 ， 彼 此 得 以 分 離 。 （ 3） 雙 向 凝 膠 電 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 雙 向 電 泳 （ 2-DE） 的 第 一 向是 等 電 聚 焦 電 泳 ， 第 二 向 是 SDS-PAGE。u IEF/SDS-PAGE的 第 一 相 常 用 柱 狀 電 泳 ，第 二 相 常 用 板 狀 電 泳 。u 雖 然 IEF/SDS-PAGE的 原 理 與 IEF-PAGE、SDS-PAGE單 相 電 泳 的 原 理 基 本 相 同 ， 但在 具 體 操 作 上 卻 有

45、較 大 的 差 別 。u第 一 相 的 電 泳 分 離 系 統(tǒng) 與 IEF-PAGE不 同 u第 二 相 的 加 樣 操 作 與 SDS-PAGE不 同 第 一 相 的 電 泳 分 離 系 統(tǒng) 與 IEF-PAGE不 同u 第 一 向 相 電 泳 系 統(tǒng) 中 的 樣 品 處 理 液 中 加 入 高 濃 度 的 尿 素和 適 量 的 非 離 子 型 去 垢 劑 NP-40， 還 需 加 入 二 硫 蘇 糖 醇（ dithiothreitol， DTT） 。u 這 些 試 劑 可 破 壞 蛋 白 質(zhì) 分 子 內(nèi) 的 二 硫 鍵 ， 使 蛋 白 質(zhì) 變 性 ，有 利 于 第 二 相 中 蛋 白 質(zhì)

46、與 SDS充 分 結(jié) 合 ；u 這 些 試 劑 本 身 并 不 帶 電 荷 ， 不 會 影 響 蛋 白 質(zhì) 原 有 的 電 荷 量和 等 電 點 。 l 第 一 向 電 泳 的 環(huán) 境 溫 度 保 持 在 20 35 。 尿 素 在 低 溫 時 容 易 析出 ， 在 高 溫 時 容 易 分 解 。 第 二 相 的 加 樣 操 作 與 SDS-PAGE不 同 第 一 向 電 泳 結(jié) 束 后 ， 凝 膠 柱 用 去 離 子 水 洗 3次 ，再 放 入 第 二 向 SDS-PAGE的 濃 縮 膠 緩 沖 液 含 -巰 基 乙 醇 （ -ME） 和 SDS 中 震 蕩 平 衡 。使 凝 膠 柱 內(nèi) 原

47、 有 的 第 一 相 電 泳 分 離 系 統(tǒng) 被 第二 相 的 電 泳 分 離 系 統(tǒng) 所 取 代 。 -ME使 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 的 二 硫 鍵 保 持 還 原 狀 態(tài) ，以 便 蛋 白 質(zhì) 與 SDS充 分 結(jié) 合 ， 從 而 完 成 第 二 向的 樣 品 處 理 。 經(jīng) 平 衡 處 理 后 的 凝 膠 柱 包 埋 在 第 二 相 的 凝 膠板 上 端 ， 完 成 第 二 相 電 泳 的 加 樣 。 （ 4） 毛 細(xì) 管 電 泳 毛 細(xì) 管 電 泳 （ CE） 是 在 內(nèi) 徑 為 25 100 m的 石 英 毛細(xì) 管 中 進(jìn) 行 電 泳 。 它 的 分 離 原 理 是 被 分 離 物

48、 質(zhì) 差 速運 動 的 結(jié) 果 。 在 毛 細(xì) 管 電 泳 中 ， 物 質(zhì) 主 要 有 兩 種 運 動 ： 電 泳 和電 滲 。 （ 理 解 電 滲 現(xiàn) 象 的 基 本 概 念 ） 物 質(zhì) 粒 子 在 毛 細(xì) 管 中 的 運 動 速 度 是 這 兩 種 運 動 速度 之 和 。 通 常 電 滲 流 的 速 度 是 電 泳 流 速 度 的 5 7倍 ， 因 而 粒 子 的 速 度 主 要 由 電 滲 速 度 決 定 ， 因 而可 以 實 現(xiàn) 所 有 的 樣 品 組 分 向 同 一 方 向 泳 動 及 正 負(fù)離 子 的 同 時 分 離 。 正 離 子 的 泳 動 方 向 與 電 滲 方 向 相 同

49、 ， 最 先 流 出 ；中 性 離 子 的 泳 動 速 度 為 零 ， 在 正 離 子 后 流 出 ； 負(fù)離 子 的 泳 動 方 向 與 電 滲 方 向 相 反 ， 最 后 流 出 。 第 五 章 蛋 白 質(zhì) 的 定 性 定 量 檢 測 基 本 概 念l 免 疫 組 織 化 學(xué)l ABC法l Western blotting/免 疫 印 跡 第 五 章 主 要 內(nèi) 容Western blotting 免 疫 組 織 化 學(xué) ： 免 疫 學(xué) 與 組 織 化 學(xué) 相 結(jié) 合 的 一 個 分 支 學(xué) 科 。 以 免 疫 學(xué) 的抗 原 -抗 體 反 應(yīng) 為 基 礎(chǔ) 的 理 論 ， 其 可 作 為 蛋

50、白 質(zhì) 定 位 、 定 性 及 半 定 量 檢測 的 方 法 之 一 。 它 把 免 疫 反 應(yīng) 的 特 異 性 、 組 織 化 學(xué) 的 可 見 性 巧 妙 地 結(jié) 合起 來 ， 借 助 顯 微 鏡 （ 包 括 熒 光 顯 微 鏡 和 電 子 顯 微 鏡 等 ） 的 顯 像 和 放 大 作用 ， 在 細(xì) 胞 、 亞 細(xì) 胞 水 平 檢 測 各 種 抗 原 物 質(zhì) （ 如 蛋 白 質(zhì) 、 多 肽 、 酶 、 激素 、 病 原 體 以 及 受 體 等 ） ， 也 可 在 原 位 顯 示 相 應(yīng) 的 基 因 和 基 因 表 達(dá) 產(chǎn) 物 。 免 疫 組 織 化 學(xué) 的 簡 要 步 驟 包 括 ： （

51、1） 抗 體 的 制 備 。l 1） 抗 原 的 提 取 和 純 化 。l 2） 免 疫 動 物 制 備 多 克 隆 抗 體 或 細(xì) 胞 融 合 制 備 單 克 隆 抗 體 。l 3） 抗 體 效 價 檢 測 和 純 化 。l 4） 標(biāo) 記 復(fù) 合 物 的 制 備 。 （ 2） 抗 原 的 檢 測 。l 1） 細(xì) 胞 或 組 織 切 片 的 制 備 。l 2） 免 疫 組 織 化 學(xué) 反 應(yīng) 和 顯 色 。 （ 3） 結(jié) 果 觀 察 和 記 錄 。 ABC法 （ avidin-biotin-enzyme complex， ABC） ： 美 籍 華 人 Hsu于1981年 首 次 報 道 。 它

52、 是 以 卵 白 素 作 為 橋 ， 把 生 物 素 化 的 抗 體 （ 二 抗 ） 與生 物 素 結(jié) 合 酶 （ 如 生 物 素 標(biāo) 記 的 HRP） 連 接 起 來 ， 形 成 avidin biotin enzyme complex， 即 ABC。 ABC法 的 操 作 過 程 基 本 原 理 ： 先 將 已 知 抗 體 或 抗 原 結(jié) 合 在 某 種固 體 載 體 上 ， 并 保 持 其 免 疫 活 性 ； 利 用 標(biāo) 記技 術(shù) ， 將 酶 標(biāo) 記 到 抗 體 （ 或 抗 原 ） 上 。 測 定時 ， 將 待 測 樣 本 和 酶 標(biāo) 抗 體 或 抗 原 按 不 同 步驟 與 固 體 載

53、 體 表 面 吸 附 的 抗 體 或 抗 原 發(fā) 生 反應(yīng) ， 形 成 抗 體 -抗 原 復(fù) 合 物 ； 加 入 酶 反 應(yīng) 底 物 ，根 據(jù) 底 物 被 酶 催 化 產(chǎn) 生 的 顏 色 及 其 吸 光 度 值的 大 小 進(jìn) 行 定 性 或 定 量 分 析 。 實 驗 方 法 （ 分 類 ）l 間 接 法 （ 用 于 測 定 抗 體 的 常 用 方 法 ） l 雙 抗 體 夾 心 法 （ 用 于 測 定 抗 原 的 常 用 方 法 ） /橋 連 ABC-ELISA夾 心 法l 競 爭 法 （ 用 于 測 定 抗 原 、 半 抗 原 及 抗 體 ） 使 用 雙 抗 體 夾 心 法 /三 明 治

54、法 檢 測 某 種 蛋 白 質(zhì) 向 微 孔 板 內(nèi) 加 入 單 克 隆 抗 體 進(jìn) 行 包 被 ， 4C反 應(yīng) 24-36 h。 用 PBST洗 滌 3次 。 加 入 封 閉 液 ， 37C封 閉 反 應(yīng) 2 h或 4C反 應(yīng) 過 夜 。 向 微 孔 板 內(nèi) 加 入 待 側(cè) 樣 品 ， 37C反 應(yīng) 45-60 min。 用 PBST洗 滌 3次 。 向 微 孔 板 內(nèi) 加 入 酶 標(biāo) 抗 體 ， 37C反 應(yīng) 45-60 min。 用 PBST洗 滌 5次 。 顯 色 反 應(yīng) 。 室 溫 避 光 反 應(yīng) 15 min。 酶 標(biāo) 議 檢 測 。 結(jié) 果 分 析 。 Western blotti

55、ng/免 疫 印 跡 ： 蛋 白 樣 品 經(jīng)過 SDS-PAGE分 離 后 ， 轉(zhuǎn) 移 到 膜 上 ， 然 后應(yīng) 用 抗 原 抗 體 反 應(yīng) 進(jìn) 行 特 異 性 檢 測 的 方 法 。它 是 檢 測 蛋 白 質(zhì) 混 合 溶 液 中 某 種 特 定 目 的蛋 白 的 定 性 方 法 ， 也 可 以 作 為 確 定 同 一 種蛋 白 在 不 同 細(xì) 胞 或 同 一 種 細(xì) 胞 在 不 同 條 件下 的 相 對 含 量 的 半 定 量 方 法 。 應(yīng) 用 ： 使 用 Western blotting/免 疫 印 跡 法檢 測 某 種 蛋 白 質(zhì) 。 使 用 免 疫 印 跡 法 檢 測 某 種 蛋 白

56、 質(zhì) 用 純 化 的 蛋 白 免 疫 小 鼠 ， 得 到 某 種 蛋 白 特 異 性 的 抗 血清 。 制 備 樣 品 ， 用 SDS-PAGE電 泳 分 離 。 用 半 干 式 電 轉(zhuǎn) 移 法 將 蛋 白 轉(zhuǎn) 至 PVDF膜 或 NC膜 上 。 將 膜 在 封 閉 液 中 室 溫 反 應(yīng) 45-60 min。 轉(zhuǎn) 移 膜 至 用 封 閉 液 稀 釋 的 蛋 白 特 異 性 的 抗 血 清 （ 一 抗工 作 液 ） 中 ， 室 溫 反 應(yīng) 45-60 min。 TBST漂 洗 3 10 min。 轉(zhuǎn) 移 膜 至 用 封 閉 液 稀 釋 的 堿 性 磷 酸 酶 （ AP） 偶 聯(lián) 的 羊抗 鼠

57、IgG（ 二 抗 工 作 液 ） 中 ， 室 溫 反 應(yīng) 45-60 min。 TBST漂 洗 3 10 min。 顯 色 反 應(yīng) 。 將 膜 浸 泡 在 NBT/BCIP顯 色 液 中 ， 避 光 靜 置 ，待 出 現(xiàn) 清 晰 條 帶 后 ， 把 膜 轉(zhuǎn) 移 至 蒸 餾 水 中 中 止 反 應(yīng) 。 凱 氏 定 氮 法 。 雙 縮 脲 法 。 Folin-酚 試 劑 法 （ Lowry法 ） 。 紫 外 -分 光 光 度 法 。 考 馬 斯 亮 藍(lán) G-250染 色 法 。 BCA法 。 第 六 章 蛋 白 質(zhì) 的 生 物 信 息 學(xué)理 論 基 本 概 念l 序 列 對 比l 序 列 的 相

58、似 性 （ similarity） l 序 列 的 同 源 性 （ homology） 直 系 同 源 旁 系 同 源l 局 部 和 整 體 相 似 性 序 列 對 比 第 六 章 主 要 內(nèi) 容 生 物 信 息 學(xué) 的 基 本 概 念l 廣 義 上 講 ， 生 物 信 息 學(xué) 是 對 生 物 信 息 的 獲 取 、 加 工 、 儲 存 、 發(fā) 布 、分 析 和 解 釋 ， 并 綜 合 運 用 數(shù) 學(xué) 、 計 算 機 科 學(xué) 和 生 物 學(xué) 等 工 具 ， 以 達(dá)到 理 解 數(shù) 據(jù) 中 的 生 物 學(xué) 含 義 的 目 標(biāo) 。 是 生 物 與 信 息 技 術(shù) 的 結(jié) 合 。l 狹 義 上 講 ，

59、 生 物 信 息 學(xué) 是 把 基 因 組 DNA序 列 分 析 作 為 源 頭 ， 找 到 基因 組 序 列 中 代 表 蛋 白 質(zhì) 和 RNA基 因 的 編 碼 區(qū) ， 闡 明 非 編 碼 區(qū) 的 信 息實 質(zhì) ， 破 譯 隱 藏 在 DNA序 列 中 的 遺 傳 規(guī) 律 ； 同 時 ， 在 此 基 礎(chǔ) 上 ， 歸納 、 整 理 與 基 因 組 遺 傳 信 息 釋 放 及 其 調(diào) 控 相 關(guān) 的 轉(zhuǎn) 錄 譜 和 蛋 白 質(zhì) 譜的 數(shù) 據(jù) ， 從 而 揭 示 生 命 體 的 生 長 、 發(fā) 育 、 代 謝 和 進(jìn) 化 的 規(guī) 律 。 生 物 信 息 學(xué) 的 研 究 內(nèi) 容l 建 立 可 以 存

60、 放 和 管 理 大 量 生 物 信 息 學(xué) 數(shù) 據(jù) 集l 開 發(fā) 確 定 大 數(shù) 據(jù) 集 中 各 成 員 關(guān) 系 的 算 法 和 統(tǒng) 計 方 法 ， 并 設(shè) 計 一 些 相應(yīng) 的 工 具 軟 件 。 l 使 用 這 些 工 具 來 分 析 和 解 釋 不 同 類 型 的 生 物 數(shù) 據(jù) ， 包 括 DNA、 RNA和 蛋 白 質(zhì) 序 列 、 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 、 基 因 表 達(dá) 及 生 化 途 徑 。 1. 基 因 功 能 表 達(dá) 譜 的 研 究 ， 探 討 基 因 在 特 定 時 空 中 的 表 達(dá) 。2. 確 定 核 酸 序 列 中 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 基 因 ， 了 解 蛋 白

61、質(zhì) 的 功 能 及 其 分 子基 礎(chǔ) ， 運 用 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 模 擬 與 分 子 設(shè) 計 進(jìn) 行 功 能 預(yù) 測3. 對 已 知 的 各 種 代 謝 途 徑 和 相 關(guān) 的 生 物 分 子 的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 及 它 們 之間 的 相 互 作 用 進(jìn) 行 整 理 ， 用 以 研 究 細(xì) 胞 發(fā) 育 、 分 化 途 徑 和 疾 病 的發(fā) 生 與 發(fā) 展 的 途 徑 ， 并 將 這 些 信 息 與 生 命 體 和 生 命 過 程 的 生 理 生化 信 息 相 結(jié) 合 ， 闡 明 其 分 子 機 制 ， 最 終 進(jìn) 行 蛋 白 質(zhì) 及 核 酸 的 分 子設(shè) 計 、 藥 物 設(shè) 計 和 個

62、 體 化 的 醫(yī) 療 保 健 設(shè) 計 等 。4. 其 他 。 例 如 ， 序 列 對 比 ， 結(jié) 構(gòu) 對 比 ； 計 算 機 輔 助 基 因 識 別 ， 非 編碼 區(qū) 分 析 ； 分 子 進(jìn) 化 和 比 較 基 因 組 學(xué) ； 基 因 芯 片 設(shè) 計 ； 序 列 重 疊群 裝 配 ； 生 物 信 息 處 理 并 行 算 法 的 研 究 ； 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 數(shù) 據(jù) 分 析 等等 。 美 國 國 家 生 物 技 術(shù) 信 息 中 心 （ NCBI） 的GenBank數(shù) 據(jù) 庫 ， 歐 洲 生 物 信 息 學(xué) 研 究 所 （ EBI） 維 護(hù) 的 EMBL核 酸 序 列 數(shù) 據(jù) 庫 日 本 國 立

63、 遺 傳 學(xué) 研 究 所 （ NIG） 建 立 的 日 本DNA數(shù) 據(jù) 庫 （ DDBJ） ， 并 列 為 國 際 上 最 著 名 的 三 大 DNA數(shù) 據(jù) 庫 。 在 生 物 信 息 學(xué) 研 究 中 ， 序 列 對 比 是 最 常 用 和 最 經(jīng) 典 的 一 個 研 究 手 段 。將 研 究 對 象 進(jìn) 行 相 互 比 較 來 尋 找 研 究 對 象 可 能 具 備 的 某 些 特 性 。 從核 酸 及 蛋 白 質(zhì) 的 一 級 結(jié) 構(gòu) 方 面 來 分 析 序 列 的 相 同 點 和 不 同 點 ， 從 而能 夠 推 測 它 們 的 結(jié) 構(gòu) 、 功 能 及 進(jìn) 化 上 的 聯(lián) 系 。 序 列

64、對 比 的 理 論 基 礎(chǔ) 是 進(jìn) 化 學(xué) 說 。 如 果 基 因 和 蛋 白 質(zhì) 序 列 之 間 具 有足 夠 的 相 似 性 ， 就 推 測 兩 者 可 能 有 共 同 的 進(jìn) 化 祖 先 ， 經(jīng) 過 序 列 內(nèi) 殘基 的 替 換 、 缺 失 以 及 序 列 重 組 等 遺 傳 變 異 過 程 分 別 演 化 而 來 。 序 列 的 相 似 性 （ similarity） ： 在 序 列 對 比 中 描 述 兩 條 序 列 之 間 相 同堿 基 或 氨 基 酸 殘 基 所 占 比 例 （ 可 進(jìn) 行 量 化 ） 。 序 列 的 同 源 性 （ homology） ： 指 從 大 量 數(shù) 據(jù)

65、 中 推 斷 出 的 兩 個 基 因 在進(jìn) 化 上 具 有 共 同 祖 先 的 結(jié) 論 （ 不 可 進(jìn) 行 量 化 ） 。 在 生 物 信 息 學(xué) 研 究 中 ， 局 部 相 似 性 序 列 對 比 更 合 理 ， 應(yīng) 用 也 比 較 廣泛 。 其 生 物 學(xué) 基 礎(chǔ) 是 蛋 白 質(zhì) 功 能 結(jié) 構(gòu) 域 的 高 度 保 守 性 。 所 以 ， 通 過比 較 分 析 保 守 位 點 上 的 殘 基 可 以 對 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 和 功 能 進(jìn) 行 預(yù) 測 。 蛋 白 質(zhì) 分 析 專 家 系 統(tǒng) （ Expert Protein Analysis System， ExPASy） 是 于 19

66、94年由 瑞 士 生 物 信 息 學(xué) 院 （ Swiss Institute of Bioinformatics， SIB） 創(chuàng) 立 的 世 界 上 第 一個 分 子 生 物 學(xué) 網(wǎng) 站 ， 專 門 從 事 蛋 白 質(zhì) 序 列 、結(jié) 構(gòu) 、 功 能 和 蛋 白 質(zhì) 2D-PAGE圖 譜 等 的 分析 。 較 廣 泛 的 序 列 相 似 性 搜 索 工 具 ： FASTA、BLAST和 BLITZ等 。 第 七 章 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 理 論 與 進(jìn) 展 基 本 概 念l 基 因 組 （ genome）l DNA微 陣 列l(wèi) 蛋 白 質(zhì) 組l 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué)l 表 達(dá) 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué)l 細(xì) 胞 圖 譜 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) l 串 聯(lián) 質(zhì) 譜l 肽 質(zhì) 量 指 紋 譜 回 答 問 題 ： 1. 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 的 基 本 概 念 及 意 義 。 2. 蛋 白 質(zhì) 組 和 基 因 組 的 主 要 區(qū) 別 。 3. 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 研 究 的 幾 個 重 要 的 技 術(shù) 平 臺 。 4. 二 維 電 泳 的 基 本 原 理 和 實 驗 過 程 。 5. 質(zhì) 譜 技 術(shù) 的 基