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1、CompanyLOGO Company Logo 固 定 化 酶 的 定 義v所 謂 固 定 化 酶 (immobilized enzyme)， 是 指 在 一 定 的空 間 范 圍 內(nèi) 起 催 化 作 用 ， 并 能 反 復 和 連 續(xù) 使 用 的酶 。 Company Logo v1916年 ， Nelson和 Griffin發(fā) 現(xiàn) 酶 的 固 定 化 現(xiàn) 象 ；v1969年 ， 千 畑 一 郎 等 將 固 定 化 氨 基 酰 化 酶 應 用 于生 產(chǎn) L-氨 基 酸 ， 開 創(chuàng) 了 固 定 化 酶 應 用 于 工 業(yè) 生 產(chǎn)的 先 例 ；v1971年 召 開 的 第 一 屆 國 際 酶

2、 工 程 會 議 上 ， 建 議 采用 統(tǒng) 一 的 英 文 名 稱 I mmobilized Enzyme；v1973年 ， 固 定 化 大 腸 桿 菌 菌 體 中 的 天 冬 氨 酸 酶 連續(xù) 生 產(chǎn) L-天 冬 氨 酸 。v1986年 ， 利 用 固 定 化 原 生 質(zhì) 體 發(fā) 酵 生 產(chǎn) 堿 性 磷 酸酶 和 葡 萄 糖 氧 化 酶 等 相 繼 獲 得 成 功 。酶 固 定 化 技 術 發(fā) 展 史 Company Logo v從 目 前 的 發(fā) 展 狀 況 來 看 ， 盡 管 酶 種 類 繁 多 ， 但 已經(jīng) 固 定 化 的 酶 卻 相 對 有 限 ， 采 用 固 定 化 酶 技 術 大

3、規(guī) 模 生 產(chǎn) 的 企 業(yè) 尚 屬 少 數(shù) ， 真 正 在 工 業(yè) 上 使 用 的固 定 化 酶 還 僅 限 于 葡 萄 糖 異 構 酶 、 葡 萄 糖 氧 化 酶和 青 霉 素 酰 化 酶 等 為 數(shù) 不 多 的 十 幾 個 酶 種 ， 故 仍需 大 力 研 究 開 發(fā) 使 更 多 的 固 定 化 酶 和 細 胞 能 適 用于 工 業(yè) 規(guī) 模 生 產(chǎn) 。 發(fā) 展 現(xiàn) 狀 Company Logo 固 定 化 酶 的 優(yōu) 點同 一 批 固 定 化 酶 能 在 工 藝 流 程 中 重 復 多 次 地 使 用 ；固 定 化 后 ， 和 反 應 物 分 開 ， 有 利 于 控 制 生 產(chǎn) 過 程

4、，同 時 也 省 去 了 熱 處 理 使 酶 失 活 的 步 驟 ；穩(wěn) 定 性 顯 著 提 高 ；可 長 期 使 用 ， 并 可 預 測 衰 變 的 速 度 ；提 供 了 研 究 酶 動 力 學 的 良 好 模 型 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 制 備 原 則v（ 1） 必 須 注 意 維 持 酶 的 構 象 ， 特 別 是 活 性 中 心 的 構 象 。v（ 2） 酶 與 載 體 必 須 有 一 定 的 結 合 程 度 。 酶 的 固 定 化 既 不 影響 酶 的 原 有 構 象 ， 又 能 使 固 定 化 酶 能 有 效 回 收 貯 藏 ， 利 于 反復 使 用 。v

5、（ 3） 固 定 化 應 有 利 于 自 動 化 、 機 械 化 操 作 。 這 要 求 用 于 固定 化 的 載 體 必 須 有 一 定 的 機 械 強 度 ， 才 能 使 之 在 制 備 過 程 中不 易 破 壞 或 受 損 。 Company Logo v（ 4） 固 定 化 酶 應 有 最 小 的 空 間 位 阻 。v（ 5） 固 定 化 酶 應 有 最 大 的 穩(wěn) 定 性 。 在 應 用 過 程 中 ，所 選 載 體 應 不 和 底 物 、 產(chǎn) 物 或 反 應 液 發(fā) 生 化 學 反應 。v（ 6） 固 定 化 酶 的 成 本 適 中 。 Company Logo 固 定 化 酶 （

6、 細 胞 ） 的 制 備 方 法 酶 和 細 胞 固 定 化 方 法 載 體 結 合 法 交 聯(lián) 法 包 埋 法 網(wǎng) 格 型 微 囊 型物 理 吸 附 法 離 子 結 合 法 共 價 結 合 法 熱 處 理 （ 細 胞 ） Company Logo Company Logo 1、 吸 附 法v通 過 載 體 表 面 和 酶 分 子 表 面 間 的 次 級 鍵 相 互 作 用而 達 到 固 定 目 的 的 方 法 ， 是 固 定 化 中 最 簡 單 的 方法 。v吸 附 法 又 可 分 為 物 理 吸 附 法 和 離 子 吸 附 法 。 Company Logo v物 理 吸 附 法 (ph

7、ysical adsorption)是 通 過 非 特 異 性 物 理吸 附 作 用 將 酶 直 接 吸 附 在 水 不 溶 性 載 體 表 面 上 而使 酶 固 定 化 的 方 法 。 包 括 范 德 華 力 、 疏 水 相 互 作用 、 氫 鍵 。v物 理 吸 附 法 常 用 的 載 體 ：有 機 載 體 ： 纖 維 素 、 膠 原 、 淀 粉 及 面 筋 等 ；無 機 載 體 ： 活 性 炭 、 氧 化 鋁 、 皂 土 、 多 孔 玻 璃 、硅 膠 、 二 氧 化 鈦 、 羥 基 磷 灰 石 等 。物 理 吸 附 法 Company Logo v離 子 吸 附 法 (ion adsorp

8、tion)是 通 過 離 子 鍵 使 酶 與 含有 離 子 交 換 基 團 的 水 不 溶 性 載 體 相 結 合 的 固 定 化方 法 。v此 法 固 定 的 酶 有 葡 萄 糖 異 構 酶 、 糖 化 酶 、 -淀 粉酶 、 纖 維 素 酶 等 ， 在 工 業(yè) 上 用 途 較 廣 。離 子 吸 附 法 Company Logo v離 子 吸 附 法 常 用 的 載 體 ：v陰 離 子 交 換 劑 ： DEAE-纖 維 素 、 四 乙 氨 基 乙 基(TEAE)-纖 維 素 等 ；v陽 離 子 交 換 劑 有 羧 甲 基 (CM)-纖 維 素 、 纖 維 素 檸 檬酸 鹽 、 Dowex-5

9、0等 。v其 吸 附 容 量 一 般 大 于 物 理 吸 附 劑 。 離 子 吸 附 法 具有 操 作 簡 便 、 條 件 溫 和 、 酶 活 力 不 易 喪 失 等 優(yōu) 點 。此 外 ， 吸 附 過 程 同 時 可 以 純 化 酶 。 Company Logo 2、 包 埋 法v包 埋 法 （ entrapment） 是 將 酶 包 埋 在 高 聚 物 的 細 微凝 膠 網(wǎng) 格 中 或 高 分 子 半 透 膜 內(nèi) 的 固 定 化 方 法 。 前者 又 稱 為 凝 膠 包 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成 網(wǎng) 格 型 ； 后 者又 稱 為 微 膠 囊 包 埋 法 ， 酶 被 包 埋 成 微 膠

10、 囊 型 。 Company Logo v（ 1） 凝 膠 包 埋 法 將 聚 合 物 的 單 體 與 酶 溶 液 混 合 ， 再 借 助 于 聚 合促 進 劑 (包 括 交 聯(lián) 劑 )的 作 用 進 行 聚 合 ， 酶 被 包埋 在 聚 合 物 中 以 達 到 固 定 化 。 凝 膠 包 埋 法 常 用 的 載 體 有 海 藻 酸 鈉 凝 膠 、 角 叉菜 膠 、 明 膠 、 瓊 脂 凝 膠 、 卡 拉 膠 等 天 然 凝 膠 以及 聚 丙 烯 酰 胺 、 聚 乙 烯 醇 和 光 交 聯(lián) 樹 脂 等 合 成凝 膠 或 樹 脂 。 Company Logo v（ 2） 微 膠 囊 包 埋 法

11、微 膠 囊 包 埋 即 將 酶 包 埋 在 各 種 高 聚 物 制 成 的 半透 膜 微 膠 囊 內(nèi) 的 方 法 。 它 使 酶 存 在 于 類 似 細 胞內(nèi) 的 環(huán) 境 中 ， 可 以 防 止 酶 的 脫 落 ， 防 止 微 囊 外的 環(huán) 境 直 接 接 觸 ， 從 而 增 加 了 酶 的 穩(wěn) 定 性 。 常用 于 制 造 微 膠 囊 的 材 料 有 聚 酰 胺 、 火 棉 膠 、 醋酸 纖 維 素 等 。 Company Logo 3、 共 價 鍵 結 合 法v共 價 鍵 結 合 法 (covalent binding） 是 將 酶 與 聚 合 物 載體 以 共 價 鍵 結 合 的 固

12、定 化 方 法 。 Company Logo v（ 1） 酶 蛋 白 N末 端 的 -氨 基 或 賴 氨 酸 殘 基 的 -氨 基 。v（ 2） 酶 蛋 白 C末 端 的 -羧 基 、 天 門 冬 氨 酸 殘 基 的 -羧 基 以 及 谷 氨 酸 殘 基 的 -羧 基 。v（ 3） 苯 丙 氨 酸 和 酪 氨 酸 殘 基 的 苯 環(huán) 。v（ 4） 其 他 ： 半 胱 氨 酸 殘 基 的 巰 基 ； 絲 氨 酸 、 蘇 氨 酸 和 酪氨 酸 殘 基 的 羥 基 ； 組 氨 酸 殘 基 的 咪 唑 基 ； 色 氨 酸 殘 基 的 吲哚 基 。 酶 蛋 白 上 可 供 載 體 結 合 的 功 能 基

13、 團v酶 共 價 偶 聯(lián) 的 載 體 的 功 能 基 團 ： 芳 香 氨 基 、 羥 基 、 羧基 和 羧 甲 基 等 。 Company Logo 載 體 活 化 的 主 要 反 應v重 氮 法v疊 氮 法v溴 化 氰 法v芳 香 烴 化 法 Company Logo v（ 1） 重 氮 法 重 氮 法 是 將 酶 蛋 白 與 水 不 溶 性 載 體的 重 氮 基 團 通 過 共 價 鍵 相 連 接 而 固 定 化 的 方 法 ，是 共 價 鍵 法 中 使 用 最 多 的 一 種 。v常 用 的 載 體 有 多 糖 類 的 芳 族 氨 基 衍 生 物 、 氨 基 酸的 共 聚 體 和 聚

14、丙 烯 酰 胺 衍 生 物 等 。 Company Logo v（ 2） 疊 氮 法 即 載 體 活 化 生 成 疊 氮 化 合 物 ， 再 與酶 分 子 上 的 相 應 基 團 偶 聯(lián) 成 固 定 化 酶 。v含 有 羥 基 、 羧 基 、 羧 甲 基 等 基 團 的 載 體 都 可 用 此法 活 化 。 如 CMC、 CM-sephadex（ 交 聯(lián) 葡 聚 糖 ） 、聚 天 冬 氨 酸 、 乙 烯 -順 丁 烯 二 酸 酐 共 聚 物 等 都 可 用此 法 來 固 定 化 酶 。 其 中 使 用 最 多 的 是 羧 甲 基 纖 維素 疊 氮 法 。 Company Logo v（ 3）

15、溴 化 氰 法 即 用 溴 化 氰 將 含 有 羥 基 的 載 體 ， 如纖 維 素 、 葡 聚 糖 凝 膠 、 瓊 脂 糖 凝 膠 等 ， 活 化 生 成 亞氨 基 碳 酸 酯 衍 生 物 ， 然 后 再 與 酶 分 子 上 的 氨 基 偶 聯(lián) ，制 成 固 定 化 酶 。v任 何 具 有 連 位 羥 基 的 高 聚 物 都 可 用 溴 化 氰 法 來 活 化 。 Company Logo v（ 4） 烷 基 化 和 芳 基 化 法 以 鹵 素 為 功 能 團 的 載 體可 與 酶 蛋 白 分 子 上 的 氨 基 、 巰 基 、 酚 基 等 發(fā) 生 烷基 化 或 芳 基 化 反 應 而 使

16、酶 固 定 化 。v此 法 常 用 的 載 體 有 鹵 乙 酰 、 三 嗪 基 或 鹵 異 丁 烯 基的 衍 生 物 。 Company Logo v優(yōu) 點 ： 共 價 鍵 的 鍵 能 高 ， 酶 和 載 體 之 間 的 結 合 相 當 牢 固 ，即 使 用 高 濃 度 底 物 溶 液 或 鹽 溶 液 ， 也 不 會 使 酶 分 子 從 載 體上 脫 落 下 來 ， 具 有 酶 穩(wěn) 定 性 好 、 可 連 續(xù) 使 用 較 長 時 間 的 優(yōu)點 。 v缺 點 ： 載 體 活 化 的 難 度 較 大 ， 操 作 復 雜 ， 反 應 條 件 較 劇 烈 ，制 備 過 程 中 酶 直 接 參 與 化

17、學 反 應 ， 易 引 起 酶 蛋 白 空 間 構 象變 化 。 Company Logo 4、 交 聯(lián) 法v交 聯(lián) 法 （ cross-linking） 是 使 用 雙 功 能 或 多 功 能 試 劑使 酶 分 子 之 間 相 互 交 聯(lián) 呈 網(wǎng) 狀 結 構 的 固 定 化 方 法 。v常 用 的 雙 功 能 試 劑 有 戊 二 醛 、 己 二 胺 、 異 氰 酸 衍生 物 等 。v戊 二 醛 和 酶 蛋 白 中 的 游 離 氨 基 發(fā) 生 Schiff反 應 ， 形成 薛 夫 堿 ， 從 而 使 酶 分 子 之 間 相 互 交 聯(lián) 形 成 固 定化 酶 。 Company Logo C

18、ompany Logo 5、 選 擇 性 熱 變 性 法v專 用 于 細 胞 固 定 化 。 是 將 細 胞 在 適 當 的 溫 度 下 處理 使 細 胞 膜 蛋 白 變 性 ， 但 不 使 酶 變 性 而 使 酶 固 定于 細 胞 內(nèi) 的 方 法 。 Company Logo 6、 固 定 化 活 細 胞v將 活 細 胞 限 制 或 定 位 于 特 定 空 間 位 置 的 方法 。 Company Logo v無 需 進 行 酶 的 分 離 和 純 化 ， 減 少 酶 的 活 力 損 失 ，同 時 大 大 降 低 了 成 本 ；v保 持 了 酶 的 原 始 狀 態(tài) ， 比 固 定 化 酶

19、 的 穩(wěn) 定 性 更 高 ，對 污 染 的 抵 抗 力 更 強 ；v細 胞 本 身 含 多 酶 系 統(tǒng) ， 可 催 化 一 系 列 反 應 ， 且 不需 添 加 輔 助 因 子 ；v細 胞 生 長 停 滯 時 間 短 ， 細 胞 多 ， 反 應 快 等 。固 定 化 活 細 胞 的 優(yōu) 越 性 Company Logo v缺 點必 須 保 持 菌 體 的 完 整 ， 需 防 止 菌 體 的 自 溶 ， 否 則影 響 產(chǎn) 物 的 純 度 ；必 須 抑 制 細 胞 內(nèi) 蛋 白 酶 對 目 的 酶 的 分 解 ；胞 內(nèi) 多 酶 的 存 在 ， 會 形 成 副 產(chǎn) 物 ；載 體 、 細 胞 膜 或 細

20、 胞 壁 會 造 成 底 物 滲 透 與 擴 散 的障 礙 等 。 Company Logo 制 備 方 法v固 定 化 活 細 胞 的 制 備 條 件 比 固 定 化 酶 更 要 溫 和 ，其 制 備 方 法 主 要 有 物 理 吸 附 法 和 包 埋 法 兩 種 。 CompanyLOGO 固 定 化 酶 的 特 性 Company Logo 固 定 化 酶 的 形 狀v固 定 化 酶 的 形 式 多 樣 ， 依 不 同 用 途 有 顆 粒 狀 、 纖維 狀 、 酶 膜 和 酶 管 等 形 狀 。v其 中 顆 粒 占 絕 大 多 數(shù) ， 它 和 纖 維 狀 主 要 用 于 工 業(yè)發(fā) 酵

21、 生 產(chǎn) ， 如 裝 成 酶 柱 用 于 連 續(xù) 生 產(chǎn) ， 或 在 反 應器 中 進 行 批 式 攪 拌 反 應 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 性 質(zhì)v酶 活 力v酶 穩(wěn) 定 性v酶 學 特 性 Company Logo 固 定 化 酶 的 酶 活 力v固 定 化 酶 的 活 力 在 多 數(shù) 情 況 下 比 天 然 酶 的 活 力 低 ，其 原 因 可 能 是 ： 酶 活 性 中 心 的 重 要 氨 基 酸 殘 基 被 載 體 結 合 ； 高 級 結 構 和 空 間 構 象 的 改 變 ； 空 間 位 阻 的 影 響 ； 內(nèi) 擴 散 阻 力 ； 半 透 膜 的 隔 離

22、 。v個 別 情 況 下 ， 酶 經(jīng) 固 定 化 后 其 活 力 升 高 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 穩(wěn) 定 性 v操 作 穩(wěn) 定 性 ： 體 內(nèi) 半 衰 期v貯 藏 穩(wěn) 定 性 ： 低 溫 放 置v熱 穩(wěn) 定 性 ： 耐 熱 性 提 高v對 蛋 白 酶 的 穩(wěn) 定 性 ： 空 間 位 阻v其 他 ： 對 有 機 溶 劑 、 pH、 酶 抑 制 劑 等 的 穩(wěn) 定 性 均有 提 高 。 Company Logo 固 定 化 酶 的 酶 學 特 性v底 物 特 異 性 ： 對 高 分 子 底 物 的 活 性 明 顯 下 降 ；v最 適 pH： 最 適 pH和 pH曲 線

23、 常 會 發(fā) 生 偏 移 ；v最 適 溫 度 ： 多 數(shù) 較 游 離 酶 高 ；v動 力 學 常 數(shù) ： Km均 增 大 ， 增 大 幅 度 視 情 況 而 定 ；v最 大 反 應 速 度 ： 與 游 離 酶 大 多 數(shù) 是 相 同 或 相 近 。 CompanyLOGO 酶 反 應 器 及 其 類 型 Company Logo 酶 反 應 器 的 定 義v以 酶 為 催 化 劑 進 行 反 應 所 需 要 的 設 備 稱 之 為 酶 催化 反 應 器 ， 簡 稱 酶 反 應 器 。 Company Logo 酶 反 應 器 的 類 型v間 歇 式 攪 拌 罐 反 應 器 ， BSTRv連

24、 續(xù) 流 動 攪 拌 罐 反 應 器 ， CSTRv填 充 床 反 應 器 ， PBRv流 化 床 反 應 器 ， FBRv連 續(xù) 攪 拌 罐 -超 濾 膜 反 應 器 ， CSTR/UFRv循 環(huán) 式 反 應 器 ， RCR CompanyLOGO 反 應 器 的 結 構 特 點 Company Logo v這 類 反 應 器 結 構 簡 單 ， 造 價 較 低 ， 傳 質(zhì) 阻力 很 小 ， 反 應 能 迅 速 達 到 穩(wěn) 態(tài) ， 主 要 應 用在 飲 料 和 食 品 工 業(yè) 中 。 其 缺 點 是 操 作 麻 煩 ，在 反 復 回 收 過 程 中 固 定 化 酶 容 易 損 失 ， 所以

25、工 業(yè) 規(guī) 模 的 固 定 化 酶 很 少 采 用 。 常 用 于游 離 酶 。 BSTR 間 歇 式 攪 拌 罐 反 應 器 ， BSTR Company Logo v這 種 反 應 器 在 運 轉 過 程 中 ， 底物 以 恒 定 的 流 速 流 入 反 應 器 ，與 此 同 時 ， 反 應 液 則 以 同 樣 的流 速 流 出 反 應 器 。 反 應 桶 內(nèi) 裝有 攪 拌 器 ， 使 反 應 組 分 與 固 定化 酶 顆 粒 混 合 均 一 ， 出 口 處 有過 濾 膜 ， 可 使 不 斷 補 充 新 鮮 底物 與 反 應 液 流 量 維 持 動 態(tài) 平 衡 。連 續(xù) 流 動 攪 拌 罐

26、 反 應 器 ， CSTR CSTR Company Logo 優(yōu) 點 ： 反 應 液 混 合 良 好 ， 各 部 位 的 成 分 相 同 ， 并 與 流出 液 的 組 成 也 一 致 。 CSTR的 開 放 結 構 使 得 調(diào) 換 固 定 化酶 比 較 容 易 ， 而 且 有 利 于 控 制 溫 度 和 調(diào) 節(jié) pH， 還 能 夠處 理 膠 態(tài) 或 不 溶 性 底 物 ， 受 底 物 抑 制 的 固 定 化 酶 采 用CSTR有 較 高 的 轉 化 率 。 缺 點 ： 由 攪 拌 產(chǎn) 生 的 剪 切 力 較 大 ， 易 打 碎 磨 損 固 定 化酶 顆 粒 。 需 改 良 的 CSTR。

27、Company Logo 填 充 床 反 應 器 ， PBR PBRv又 稱 固 定 床 反 應 器 。 可 填 充 多 向 異 性半 透 性 中 空 纖 維 制 成 管 狀 ， 內(nèi) 部 填 充酶 膜 、 酶 片 等 。v在 填 充 床 反 應 器 內(nèi) ， 底 物 在 一 定 方 向上 以 恒 定 的 速 度 通 過 固 定 化 酶 柱 ， 以近 似 活 塞 式 流 動 反 應 器 （ Plug Flow Reactor， PFR） 運 轉 。 Company Logo 流 化 床 反 應 器 ， FBR FBR vFBR種 裝 有 較 小 顆 粒 的 垂 直 塔 式反 應 器 。 反 應

28、 時 ， 底 物 溶 液 以 足 夠大 的 流 速 ， 從 反 應 器 底 部 向 上 通 過固 定 化 酶 柱 床 ， 便 能 使 固 定 化 酶 顆粒 始 終 處 于 流 化 狀 態(tài) 。 其 混 合 程 度介 于 CSTR的 全 混 型 和 PFR的 平 推流 型 之 間 。 由 于 反 應 器 內(nèi) 混 合 程 度高 ， 因 此 ， 傳 熱 、 傳 質(zhì) 情 況 良 好 ，可 處 理 粘 性 大 、 含 有 固 體 顆 粒 的 底物 。 Company Logo 連 續(xù) 攪 拌 罐 -超 濾 膜 反 應 器 ， CSTR/UFRCSTR/UFRv CSTR UF結 構 是 CSTR與超 濾

29、裝 置 聯(lián) 用 的 酶 膜 反 應 器 。在 CSTR出 口 處 設 置 一 個 超濾 裝 置 ， 通 過 超 濾 裝 置 ， 酶可 以 循 環(huán) 使 用 。 該 超 濾 器 中的 半 透 性 超 濾 膜 只 允 許 小 分子 產(chǎn) 物 通 過 ， 不 允 許 大 分 子酶 和 底 物 通 過 。v 該 反 應 器 適 用 于 顆 粒 較 細 的固 定 化 酶 、 游 離 酶 和 細 胞 以及 小 分 子 產(chǎn) 物 與 大 分 子 底 物 。 Company Logo 循 環(huán) 式 反 應 器 ， RCR外 循 環(huán) 反 應 器 內(nèi) 循 環(huán) 反 應 器 循 環(huán) 操 作 仍 能 為 底 物 與 酶 提

30、供 足 夠 的 接 觸 機 會 ，以 達 到 所 需 的 轉 化 率 。 這 種 反 應 器 可 用 于 難 溶 或者 不 溶 性 底 物 的 轉 化 反 應 。 Company Logo 酶 反 應 器 的 選 擇 依 據(jù)v根 據(jù) 固 定 化 酶 的 形 狀 ： 溶 液 酶 ： BSTR 顆 粒 狀 和 片 狀 ： CSTR、 PBR 膜 狀 和 纖 維 狀 ： PBR 容 易 變 形 、 易 粘 結 、 顆 粒 細 小 ： FBRv根 據(jù) 底 物 的 物 理 性 質(zhì) 溶 解 性 和 濁 液 性 底 物 ： 任 何 類 型 顆 粒 狀 和 膠 狀 底 物 ： CSTR、 FBR、 RCR

31、Company Logo v根 據(jù) 酶 反 應 動 力 學 特 性 產(chǎn) 物 對 酶 活 性 抑 制 ： PBR 底 物 對 酶 活 性 抑 制 ： CSTRv根 據(jù) 外 界 環(huán) 境 對 酶 的 穩(wěn) 定 性 的 影 響 改 良 的 CSTRv根 據(jù) 操 作 要 求 及 反 應 器 費 用 CSTR CompanyLOGO固 定 化 細 胞 法 生 產(chǎn) 6-氨 基 青 霉 烷 酸 Company Logo 基 本 原 理v青 霉 素 G經(jīng) 青 霉 素 酰 化 酶 作 用 ， 水 解 除 去 側 鏈 后的 產(chǎn) 物 稱 為 6-氨 基 青 霉 烷 酸 ， 也 稱 無 側 鏈 青 霉 素 。6-APA結

32、 構 式 Company Logo 工 藝 路 線 大 腸 桿 菌 的 培 養(yǎng)大 腸 桿 菌 固 定 化固 定 化 大 腸 桿 菌 反 應 堆 制 備轉 化 反 應6-氨 基 青 霉 烷 酸 的 提 取 Company Logo 工 藝 要 點v大 腸 桿 菌 的 培 養(yǎng)菌 種 ： 大 腸 桿 菌 D816斜 面 培 養(yǎng) 基 ： 普 通 肉 湯 瓊 脂 培 養(yǎng) 基發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 ： 蛋 白 胨 、 氯 化 鈉 、 苯 乙 酸 、 自 來 水發(fā) 酵 條 件 ： 通 氣 攪 拌 培 養(yǎng) ， 28 ， pH7.0 Company Logo v大 腸 桿 菌 固 定 化 取 濕 菌 體 100 k

33、g， 置 于 40 反 應 罐 中 ， 在 攪 拌 下 加 入50L10%戊 二 醛 5 升 ， 在 轉 移 至 搪 瓷 盤 中 ， 使 之 成 為 3-5 cm厚 的 液 層 ， 室 溫 放 置 2 小 時 ， 再 轉 移 至 4 冷 庫 過 夜 ，待 形 成 固 體 凝 膠 后 ， 通 過 粉 碎 和 過 篩 ， 使 其 成 為 直 徑 為 2 mm左 右 的 顆 粒 狀 固 定 化 大 腸 桿 菌 細 胞 ， 用 蒸 餾 水 以pH7.5和 0.3mol/L磷 酸 緩 沖 液 先 后 充 分 洗 滌 ， 抽 干 ， 備 用 。 Company Logo v固 定 化 大 腸 桿 菌 反

34、應 堆 制 備將 上 述 充 分 洗 滌 后 的 固 定 化 大 腸 桿 菌 細 胞 裝 填 于帶 保 溫 夾 套 的 填 充 式 反 應 器 中 ， 即 成 為 固 定 化 大腸 桿 菌 反 應 堆 ， 反 應 器 規(guī) 格 為 直 徑 70 160 cm。 Company Logo v轉 化 反 應v取 20 kg青 霉 素 G鉀 鹽 ， 加 入 到 1000L配 料 罐 中 ， 用 0.03 mol/L、 pH7.5 的 磷 酸 緩 沖 液 溶 解 并 使 青 霉 素 G鉀 鹽 濃 度 為3%， 用 2 mol/L氫 氧 化 鈉 溶 液 調(diào) pH 至 7.5-7.8， 然 后 將 反 應器

35、 及 pH 調(diào) 節(jié) 罐 中 反 應 液 溫 度 到 0 ， 維 持 反 應 體 系 的 酸 度在 7.5-7.8 范 圍 內(nèi) ， 以 70L/min流 速 使 青 霉 素 G鉀 鹽 溶 液 通 過固 定 化 大 腸 桿 菌 反 應 堆 進 行 循 環(huán) 轉 化 ， 直 至 轉 化 液 酸 度 不變 為 止 。 循 環(huán) 時 間 一 般 為 3-4h， 反 應 結 束 后 ， 放 出 轉 化 液 ，再 進 入 下 一 批 反 應 。 Company Logo v6-氨 基 青 霉 烷 酸 的 提 取 上 述 轉 化 液 經(jīng) 過 濾 澄 清 后 ， 濾 液 用 薄 膜 濃 縮 器 減 壓 濃 縮 至100 L左 右 ， 冷 卻 至 室 溫 后 ， 于 250L攪 拌 罐 中 加 50L醋 酸丁 酯 充 分 攪 拌 提 取 10-15min， 取 下 層 水 相 ， 加 1%活 性 炭于 70 攪 拌 脫 色 30min， 濾 除 活 性 炭 ， 濾 液 用 6mol/L HCl調(diào) pH至 4 左 右 ， 5 放 置 結 晶 過 夜 ， 次 日 濾 取 結 晶 ， 用 少量 冷 水 洗 滌 ， 抽 干 ， 115 烘 2-3h得 成 品 6-氨 基 青 霉 烷 酸 ，收 率 為 70-80%。