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1、北京康為世紀(jì)生物科技有限公司實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCRReal Time Quantitative PCR 內(nèi) 容rmiRNA的 特 點(diǎn) 及 檢 測(cè)r熒 光 定 量 PCR檢 測(cè) microRNA 長 度 20 24nt 單 鏈 小 分 子 RNA 與 目 標(biāo) 基 因 3端 非 編 碼 區(qū) 的 識(shí) 別 位 點(diǎn) 相 結(jié) 合 導(dǎo) 致 目 標(biāo) 基 因 mRNA分 子 穩(wěn) 定 性 下 降 ， 半 衰 期 變 短 ， 或mRNA分 子 結(jié) 構(gòu) 變 化 （ 5脫 帽 ） ， 從 而 表 達(dá) 水 平 下 降 。3AAAAAAAA5cap miRNA作 用 靶 點(diǎn) 編 碼 區(qū)mRNA microRNA分

2、子 功 能 microRNA 的 來 源 miRNA前 體 與 成 熟 體 靶 點(diǎn) 識(shí) 別 不 嚴(yán) 格 互 補(bǔ) 配 對(duì) 一 個(gè) miRNA可 調(diào) 節(jié) 多 個(gè)基 因 一 個(gè) 基 因 可 受 多 個(gè)miRNA調(diào) 控 60%人 類 蛋 白 基 因 受miRNA調(diào) 控 miRNA 與 siRNA的 異 同 分 子 形 式 無 區(qū) 別 ， 都 是 由 Dicer產(chǎn) 生 的22nt小 分 子 分 子 功 能 近 似 ， 都 導(dǎo) 致 目 標(biāo) 基 因 表 達(dá) 水 平下 降 ， 但 通 常 siRNA效 果 更 劇 烈 產(chǎn) 生 來 源 不 同 miRNA有 其 基 因 ， 內(nèi) 源 性 表 達(dá) siRNA多 數(shù)

3、情 況 下 為 人 工 外 源 導(dǎo) 入 miRNA siRNAmiRNA 與 siRNA的 異 同 miRNA 檢 測(cè) 與 定 量經(jīng) 典 方 法 :放 射 標(biāo) 記Northern雜 交 miRNA芯 片 基 因 表 達(dá) 譜 基 本 原 理 ： 某 物 種 全 部 已 知 miRNA集 中 于一 張 芯 片 ， 點(diǎn) 雜 交 檢 測(cè) 各 miRNA豐 度 所 回 答 的 問 題 ： 哪 些 miRNA是 你 所 應(yīng) 該 關(guān)注 的 優(yōu) 點(diǎn) ： 高 通 量 ， 全 景 觀 察 缺 點(diǎn) ： 敏 感 度 、 特 異 性 均 有 限 ， 適 用 于 初篩 需 后 續(xù) 驗(yàn) 證 ： 熒 光 定 量 PCR Pr

4、e-miRNA檢 測(cè)必 要 性 ：不 排 除 miRNA從 前 體 到成 熟 體 ， 從 核 內(nèi) 轉(zhuǎn) 運(yùn) 到核 外 的 過 程 中 存 在 調(diào) 控機(jī) 制 的 可 能 。 Specific miRNA quantification by real time PCR way to go關(guān) 鍵 難 點(diǎn) 豐 度 低 解 決 辦 法 :小 RNA提 取 太 短 解 決 辦 法 : 加 長 序 列 高 度 相 似 miRNA之 間 難 以 區(qū) 分 解 決 辦 法 : 特 殊 設(shè) 計(jì) 的 檢 測(cè) 方 法 ； 小 心 設(shè) 計(jì) 引 物 與 反 應(yīng)優(yōu) 化 解 決 miRNA豐 度 難 題 基 本 原 理影 響 R

5、NA分 子 與 硅 膠 柱 結(jié) 合 的 因 素 離 液 劑 chaotropic agent， 如 鹽 酸 胍 離 子 強(qiáng) 度 ， 如 NaCl 小 分 子 有 機(jī) 溶 劑 ， 如 乙 醇精 心 調(diào) 整 各 組 份 配 比 ， 達(dá) 成 大 、 小 RNA與硅 膠 柱 結(jié) 合 的 區(qū) 分 條 件 ， 分 離 去 除 大 分 子 量RNA， 富 集 小 分 子 量 RNA小 RNA提 取 M 1 2 3 M： Marker#1： 康 為 柱 式 分 離 的 小 片 段 RNA#2： 康 為 柱 式 分 離 的 總 RNA#3： 沉 淀 法 得 到 的 總 RNA提 取 小 分 子 量 RNA 成

6、熟 miRNA qPCR檢 測(cè)- Poly(A)加 尾 法優(yōu) 點(diǎn) ：簡(jiǎn) 單 直 接 ， 高 效 。 一 次 逆 轉(zhuǎn)錄 獲 得 的 cDNA可 用 于 多 個(gè)目 標(biāo) 分 子 的 檢 測(cè) 。 成 熟 miRNA qPCR檢 測(cè) 莖 環(huán) 法優(yōu) 點(diǎn) ： 特 異 引 物 逆 轉(zhuǎn) 錄 ， 理 論 上 效 率 更 高 ， 檢 測(cè) 更 靈 敏缺 點(diǎn) ： 莖 環(huán) 引 物 設(shè) 計(jì) 復(fù) 雜 ； 特 異 引 物 逆 轉(zhuǎn) 錄 不 便 多 基 因 檢 測(cè) 檢 測(cè) 方 法 選 擇 依 樣 本 特 性 ， 檢 測(cè) 目 標(biāo) 多 寡 而 定 康 為 技 術(shù) 服 務(wù) 經(jīng) 驗(yàn) 舉 例 ： 復(fù) 旦 大 學(xué) 某 客 戶 miRNA芯 片

7、 提 示 10個(gè) miRNA在 病 人 與 正 常 人 之 間 有 顯 著 差 異表 達(dá) 要 求 從 66個(gè) 外 周 血 RNA樣 本 中 檢 測(cè) 這 10個(gè) miRNA 加 尾 法 ， 5個(gè) 目 標(biāo) 獲 得 良 好 檢 測(cè) 莖 環(huán) 法 ， 4個(gè) 目 標(biāo) 獲 得 良 好 檢 測(cè) 1個(gè) 目 標(biāo) 的 檢 測(cè) 很 難 ， 嘗 試 多 種 引 物 設(shè) 計(jì) ， 調(diào) 整 反 應(yīng) 體 系 康 為 miRNA產(chǎn) 品小 RNA提 取 試 劑 盒加 尾 法 miRNA cDNA第 一 鏈 合 成 試 劑 盒miRNA熒 光 定 量 PCR檢 測(cè) 試 劑 盒 CW0627CW2141 CW2142 康 為 miRN

8、A檢 測(cè) 服 務(wù)全 套 miRNA檢 測(cè) ： 從 生 物 樣 本 到 數(shù) 據(jù)莖 環(huán) 法 miRNA檢 測(cè) 引 物 ： 定 制 (Real time Quantitative PCR)rmiRNA的 特 點(diǎn) 及 檢 測(cè)r熒 光 定 量 PCR檢 測(cè) 內(nèi) 容 PCR：偉 大 的 天 才 發(fā) 明 Use of LSD Synthesis and self-testing of novel psychoactive substances Belief in astrology CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 1 1 22 4 3 84 16 5 326 64 7 1288 25

9、6 9 51210 1,024 11 2,04812 4,096 13 8,19214 16,384 15 32,76816 65,536 17 131,07218 262,144 19 524,28820 1,048,576 21 2,097,15222 4,194,304 23 8,388,60824 16,777,216 25 33,554,43226 67,108,864 27 134,217,72828 268,435,456 29 536,870,91230 1,073,741,824 31 1,400,000,00032 1,500,000,000 33 1,550,000,00

10、034 1,580,000,000 PCR： 理 想 與 現(xiàn) 實(shí)起 點(diǎn) 定 量 終 點(diǎn) 定 量 起 點(diǎn) 定 量 檢 測(cè) ： - 起 點(diǎn) 量 是 樣 本 中 未 經(jīng) PCR放 大 之 前 的 模 板 量- 具 有 重 現(xiàn) 性 ， 誤 差 小- “加 入 了 500個(gè) 拷 貝 ” 終 點(diǎn) 定 量 檢 測(cè) ：- 終 點(diǎn) 產(chǎn) 物 量 經(jīng) 過 PCR放 大 的 DNA量- 不 恒 定 ， 誤 差 大- “生 成 了 500， 0000， 0000個(gè) 拷 貝 ” 擴(kuò) 增 曲 線 - Ct值 ：q模 板 DNA量 越 多 ， 熒 光 強(qiáng) 度 達(dá) 到 檢 測(cè) 域 值 所 需 的 循 環(huán) 數(shù) 越 少 ， 即 C

11、t值 越 小 。 確 定 模 板 初 始 數(shù) 量 ？ Real-time PCR: 檢 測(cè) 原 理非 特 異 性 熒 光 標(biāo) 記 ： SYBR Green I 特 異 性 熒 光 標(biāo) 記 ：水 解 探 針 ： TaqMan非 水 解 探 針 ： Molecular beacon RQ ReporterQuencherR Q 535 3 SG SGSGSG535 3SG SG SG SGEmission Excitationl SYBR Green I 是 一 種 與 雙 鏈 DNA小 溝 結(jié) 合 的 熒 光 染 料 。l SYBR Green I只 與 雙 鏈 DNA結(jié) 合 才 能 發(fā) 出 熒

12、 光 。l 熒 光 信 號(hào) 的 強(qiáng) 度 與 反 應(yīng) 體 系 中 所 有 雙 鏈 DNA分 子 成 正 比 。 SYBR Green I 工 作 原 理 Taqman 工 作 原 理 在 退 火 過 程 中 ， 探 針 與 靶 序 列 結(jié) 合 探 針 被 Taq酶 的 5- 3 外 切 酶 活 性 剪 切 成 片 斷 游 離 報(bào) 告 基 團(tuán) 發(fā) 出 熒 光在 延 伸 過 程 中 ， 探 針 部 分 與 靶 序 列 分 離熒 光 信 號(hào) 強(qiáng) 度 與 結(jié) 合 探 針 的 DNA分 子 成 正 比 。 染 料 法 與 探 針 法 對(duì) 比探 針 法 特 異 性 高- 與 探 針 與 特 異 靶 序 列

13、結(jié) 合 對(duì) 模 板 有 選 擇 性- 可 進(jìn) 行 多 重 PCR反 應(yīng) 成 本 高- 不 同 靶 基 因 需 要 合 成 不 同探 針 染 料 法 通 用 性 好- 對(duì) DNA模 板 沒 有 選 擇 性 使 用 方 便 ， 成 本 低- 僅 需 設(shè) 計(jì) 兩 個(gè) 引 物 有 假 陽 性 現(xiàn) 象- 通 過 融 解 曲 線 判 斷 Real-time PCR 應(yīng) 用 基 因 表 達(dá) 分 析- 相 對(duì) 定 量 ： 基 因 表 達(dá) 量 的 差 異- 絕 對(duì) 定 量 ： 樣 本 中 核 酸 的 量 （ 拷 貝 數(shù) 、 微 克 ） 基 因 型 分 析- SNP檢 測(cè) 等 位 基 因 檢 測(cè) 甲 基 化 檢

14、測(cè) 基 因 表 達(dá) 分 析 檢 測(cè)test sample處 理 樣 本target gene目 的 基 因 reference gene內(nèi) 參 基 因total RNAcDNA calibrator sample對(duì) 照 樣 本target gene目 的 基 因 reference gene內(nèi) 參 基 因qPCR以 各 自 樣 本 中 內(nèi) 參 基 因 為 標(biāo) 桿 ， 比 較 兩 樣 本 中 目 的 基 因 的 相 對(duì) 豐 度 。數(shù) 據(jù) 分 析 qPCRcDNAtotal RNA 內(nèi) 參 基 因 的 選 擇 特 點(diǎn) 選 擇 內(nèi) 參 基 因內(nèi) 參 基 因beta-actin、GAPDH、 18S

15、rRNA、28S rRNA等 - 文 獻(xiàn) 檢 索- 實(shí) 驗(yàn) 篩 選選 擇 多 個(gè) 備 選 內(nèi) 參 基因 ， 以 備 選 內(nèi) 參 基 因的 幾 何 平 均 數(shù) 作 為 均一 化 標(biāo) 準(zhǔn) 內(nèi) 參 基 因Housekeeping Gene- RNA抽 提 、 反 轉(zhuǎn) 錄 為 cDNA的 效 率 不 同 ， 用 于 定 量 分 析 的樣 本 初 始 濃 度 不 同 。 對(duì) 樣 本 初 始 濃 度 差 異 進(jìn) 行 均 一 化 校 正 。不 同 環(huán) 境 ， 不 同 器官 、 組 織 、 細(xì) 胞 類型 之 間 ， 表 達(dá) 量 相對(duì) 恒 定 。 Housekeeping Gene 康 為 產(chǎn) 品不 同 豐 度

16、 ：高 豐 度 ACTB、 GAPDH中 等 豐 度 beta2M低 豐 度 HPRT1不 同 物 種 ：人 、 大 鼠 、 小 鼠 、 豬 、 牛 、 羊 、雞 、 斑 馬 魚 、 甘 蔗 等 基 因 表 達(dá) 分 析 檢 測(cè) 樣 本 處 理 與 RNA提 取 cDNA qPCR 內(nèi) 參 基 因 (housekeeping gene)選 擇 樣 本 處 理 與 RNA提 取 外 界 刺 激 10分 鐘 可 檢 測(cè) 的 表 達(dá) 改 變 樣 品 離 開 定 義 環(huán) 境 2分 鐘 內(nèi) 固 定 、 裂 解 細(xì) 胞 RNA樣 本 保 存 液 Trizol 超 純 RNA提 取 試 劑 盒 RNA的 評(píng)

17、價(jià) 與 鑒 定 - 完 整 性 - 純 度 小 心 DNA污 染 ！ - 使 用 DNase - 引 物 設(shè) 計(jì) - 以 RNA作 PCR陰 性 對(duì) 照CW0580 CW0592CW0581 CW2090A RT-qPCR一 步 法 還 是 兩 步 法 ？兩 步 法 ： 步 驟 多 但 靈 活 多 樣 。 cDNA可 長 期保 留 ， 檢 測(cè) 多 個(gè) 基 因 ， 便 于 反 應(yīng) 條 件 的 優(yōu)化 。 推 薦 ： 工 作 的 初 期 階 段 ， 以 及 單 個(gè) 樣 本 多 個(gè) 靶 基 因 檢 測(cè) 。一 步 法 ： 簡(jiǎn) 單 、 靈 敏 度 高 ， 有 效 減 少 實(shí) 驗(yàn) 操 作誤 差 和 污 染

18、。 每 次 只 能 做 一 個(gè) 基 因 。 推 薦 ： 工 作 的 成 熟 階 段 ， 以 及 多 個(gè) 樣 本 單 個(gè) 靶 基 因 檢 測(cè) 。 逆 轉(zhuǎn) 錄逆 轉(zhuǎn) 錄 引 物 選 擇 下 游 應(yīng) 用 ： 是 否 檢 測(cè) 其 它 基 因 ？ Abundant RNA的 干 擾 ： mRNA or total RNA？ 檢 測(cè) 靈 敏 度 是 否 足 夠 ？逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 SuperRT 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 （ RNase H -） HiFi-MMLV逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 （ RNase H-）引 物 特 異 性 反 應(yīng) 效 率Oligo dT 中 低Random hexmer 低 中Specific pri

19、mer 高 高 CW0741CW0743 總 原 則 與 普 通 PCR相 同 ：l 避 免 引 物 二 聚 體 ， 避 免 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)l 擴(kuò) 增 片 段 長 度 （ 80 300 bp)l 推 薦 做 跨 intron設(shè) 計(jì) 引 物 設(shè) 計(jì) 原 則EXON 1 EXON 2INTRON 2 DNAEXON 1 EXON 2 RNA 反 應(yīng) 條 件 優(yōu) 化內(nèi) 參 基 因 目 的 基 因 - 融 解 曲 線 ： 單 一 特 異 性 產(chǎn) 物- 擴(kuò) 增 曲 線 ： Ct值- 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 ：擴(kuò) 增 效 率 盡 量 高 ， 目 的 基 因盡 可 能 接 近 內(nèi) 參 基 因 反 應(yīng) 條 件 優(yōu) 化

20、融 解 曲 線 分 析- 單 一 特 異 性 產(chǎn) 物 將 溫 度 對(duì) 熒 光 強(qiáng) 度 的 變 化 求 導(dǎo) 圖 2 Effciency slope內(nèi) 參 基 因 100% -3.32目 的 基 因Primer 2 78% -4.00 圖 1 Effciency slope內(nèi) 參 基 因 100% -3.32目 的 基 因Primer 1 95.36% -3.43 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 分 析 - 擴(kuò) 增 效 率 盡 量 高- 目 的 基 因 盡 可 能 接 近 內(nèi) 參 基 因 10%以 內(nèi)反 應(yīng) 條 件 優(yōu) 化 反 應(yīng) 條 件 優(yōu) 化擴(kuò) 增 曲 線 分 析- Ct值 Master Mix的 應(yīng) 用-

21、熱 啟 動(dòng) 酶 化 學(xué) 修 飾 ， 常 溫 下 完 全 沒 有 聚 合 酶 活 性 ， 熱 復(fù) 活 需 95 10分 鐘 - GoldStar、 HotStar 非 化 學(xué) 修 飾 （ Oligo修 飾 、 抗 體 修 飾 、 Mg2+螯 合 物 ） 熱 復(fù) 活 僅 需 95 幾 十 秒 -FastStar- Buffer 反 應(yīng) 增 強(qiáng) 劑 - 減 少 引 物 二 聚 體 ， 進(jìn) 一 步 提 高 反 應(yīng) 特 異 性 - 對(duì) 于 復(fù) 雜 模 板 ， 提 高 反 應(yīng) 效 率 穩(wěn) 定 劑- dNTP Master Mix的 應(yīng) 用ROX Passive Reference 不 參 與 、 不 干

22、擾 PCR反 應(yīng) 恒 定 發(fā) 射 熒 光 信 號(hào) 用 于 校 正 因 信 號(hào) 檢 測(cè) 器 到 各 孔 間 光 路 不 同 而 導(dǎo) 致的 系 統(tǒng) 誤 差 。 需 參 照 儀 器 要 求 選 擇 。 誤 差 控 制 使 用 Master mix 配 置 預(yù) 混 體 系 設(shè) 置 生 物 學(xué) 重 復(fù) （ 不 同 個(gè) 體 ） 技 術(shù) 性 重 復(fù) （ 復(fù) 孔 ） 陰 性 對(duì) 照 熒 光 定 量 PCR體 系 2- Ct法滿 足 條 件 ： 1） 內(nèi) 參 基 因 和 目 標(biāo) 基 因 的 擴(kuò) 增 效 率 接 近 -正 負(fù) 10% 2） 內(nèi) 參 基 因 和 目 標(biāo) 基 因 的 擴(kuò) 增 效 率 基 本 為 90%

23、-110% 相 對(duì) 定 量 數(shù) 據(jù) 分 析1、 目 標(biāo) 基 因 的 CT值 -內(nèi) 參 基 因 的 CT值2、 待 測(cè) 樣 本 的 CT值 -對(duì) 照 樣 本 的 CT值3、 計(jì) 算 表 達(dá) 水 平 比 率 ： 2 CT=表 達(dá) 量 的 比 值2 - Ct 法 目 的基 因 內(nèi) 參基 因 目 的 基 因-內(nèi) 參 基 因 Ct 待 測(cè) 樣 本-對(duì) 照 樣 本 Ct 倍 數(shù) 值fold2- Ct 對(duì) 照 樣 本 30.485 23.625 6.86 0 1待 測(cè) 樣 本 27.025 22.66 4.365 -2.495 5.63728 Trouble shootingHousekeeping gen

24、e無 信 號(hào) RNA降 解 用 新 鮮 組 織 提 取 RNAHousekeeping gene 有 信 號(hào)而 目 標(biāo) 基 因 無 信 號(hào) 1. 目 的 基 因 表 達(dá) 低 。 逆 轉(zhuǎn) 錄 效 率 不 高2. PCR引 物 不 良 1. 富 集 mRNA 2. 在 逆 轉(zhuǎn) 錄 中 嘗 試 不 同 引 物 ， 如 特 異 引 物 。3. 嘗 試 不 同 PCR引 物 。 減 小 產(chǎn) 物 大 小 ， 改 換 目 標(biāo) 區(qū) 段 ， 考 慮 不 同 剪 接 體 。4. 嘗 試 不 同 熱 循 程 序 ， 降 低 復(fù) 性 溫 度 。Housekeeping gene反 應(yīng) 效 率 正 常 ,但 目 標(biāo) 基

25、 因 放 大 效 率 不 高 PCR引 物 不 良 重 新 設(shè) 計(jì) 引 物 ， 減 小 產(chǎn) 物 大 小 ， 改 換 目 標(biāo) 區(qū) 段 ，考 慮 不 同 剪 接 體目 標(biāo) 基 因 表 達(dá) 豐 度 在樣 本 之 間 異 常 一 致 RNA被 基 因 組 DNA污 染 1.使 用 跨 intron 引 物2.用 DNase處 理 RNA3.確 保 RNA陰 性 對(duì) 照 表 現(xiàn) 陰 性溶 解 曲 線 出 現(xiàn) 雜 峰 1.出 現(xiàn) 非 特 異 PCR產(chǎn) 物2.出 現(xiàn) 引 物 二 聚 體 1.嘗 試 不 同 PCR引 物2.嘗 試 不 同 熱 循 程 序 ， 升 高 復(fù) 性 溫 度3.修 改 儀 器 設(shè) 置

26、， 將 檢 測(cè) 溫 度 設(shè) 定 在 在 引 物 二 聚體 解 鏈 溫 度 與 PCR特 異 產(chǎn) 物 解 鏈 溫 度 之 間 。陰 性 對(duì) 照 在 30個(gè) 循 環(huán)以 內(nèi) 出 現(xiàn) 信 號(hào) 試 劑 被 污 染 1.注 意 區(qū) 分 信 號(hào) 是 來 自 引 物 二 聚 體 還 是 PCR產(chǎn) 物 查 找 ， 替 換 污 染 試 劑2. 使 用 UNG系 統(tǒng) 。 熒 光 定 量 產(chǎn) 品 -染 料 法FastSYBRMixture UltraSYBR MixturelGoldStar Taql特 異 性 強(qiáng)l靈 敏 度 高 lCt值 更 低l線 性 范 圍 更 廣l定 量 更 準(zhǔn) 確 l反 應(yīng) 速 度 快l比

27、 普 通 反 應(yīng) 可 節(jié)省 約 40分 鐘l適 合 于 普 通 和 快速 定 量 PCR程 序 熒 光 定 量 產(chǎn) 品 -染 料 法 某 其 它 品 牌 康 為 UltraSYBR- cDNA用 內(nèi) 參 actin引 物 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 ， 產(chǎn)物 片 段 100bp。- 模 板 濃 度 進(jìn) 行 10倍 稀 釋 ， 稀 釋 6個(gè) 梯度 。 康 為 世 紀(jì) 產(chǎn) 品RNA- Trizol -超 純 RNA提 取 試 劑 盒- 動(dòng) 物 組 織 RNA - 植 物 RNA - 血 液 RNA - 病 毒 RNA 逆 轉(zhuǎn) 錄-SuperRT / HiFi-MMLV逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 - cDNA第 一 鏈 合 成 試 劑 盒 -RT-PCR 一 步 法 、 兩 步 法 試 劑 盒熒 光 定 量 PCR- UltraSYBR Mixture - FastSYBR Mixture- GoldStar Taqman MixturePCR- GoldStar DNA Polymerase - Taq /Es Taq DNA Polymerase - Taq /Es Taq Master Mix