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1、1 第 七 章重 組 DNA技 術(shù)(Recombination DNA Technology) 2 第 一 節(jié) 基 本 概 念 3 重 組 DNA技 術(shù) ： 是 指 在 基 因 水 平 上 ， 將 目的 DNA在 體 外 重 組 于 能 自 我 復(fù) 制的 載 體 DNA分 子 上 ， 然 后 將 重 組DNA導(dǎo) 入 宿 主 細(xì) 胞 中 進(jìn) 行 增 生 ，以 獲 得 大 量 的 目 的 DNA片 段 ， 或以 此 為 基 礎(chǔ) ， 通 過 基 因 的 誘 導(dǎo)表 達(dá) ， 得 到 大 量 相 應(yīng) 蛋 白 質(zhì) 產(chǎn)物 的 過 程 。 又 稱 為 分 子 克 隆 技 術(shù) 或 基因 工 程 技 術(shù) 4 第 二

2、 節(jié) 重 組 DNA技 術(shù) 的 發(fā) 展 史 5 基 因 工 程 的 誕 生1、 Berg的 開 創(chuàng) 性 實(shí) 驗(yàn) 第 一 個 實(shí) 現(xiàn) DNA重 組1980年 Nobel化 學(xué) 獎猴 病 毒 SV40的 DNA+ 噬 菌 體 的 DNA第 一 個 取 得 基 因 工 程 成 功1973年 構(gòu) 建 雙 重 抗 藥 性 重 組 質(zhì) 粒1973年 是 基 因 工 程 誕 生 的 元 年 6 第 三 節(jié) 工 具 酶 7Werner Arber 理 論 預(yù) 見 限 制 酶 Hamilton O. Smith 得 到 第 一 個 限 制 酶 Daniel Nathans 用 限 制 酶 切 得 SV40 DN

3、A片 斷1978年 Nobel生 理 或 醫(yī) 學(xué) 獎 1、 “ 基 因 剪 刀 ” 限 制 性 核 酸 內(nèi) 切 酶 8 1.定 義 ： 能 識 別 雙 鏈 DNA分 子 中 某 特 定 的 核 苷 酸 序 列 ， 并 在 識 別 序 列 內(nèi) 或 附 近 切 割 DNA雙 鏈 結(jié) 構(gòu) 的 一 類 核 酸 內(nèi) 切 酶 （ 在 核 酸 分 子 鏈 的 內(nèi) 部 制 造 切 口 的 酶 ） 。2.來 源 ： 原 核 生 物 9 型 酶 、 型 酶 ： 具 有 限 制 切 割 與 甲 基 化 修 飾 活 性 。 型 和 型 酶 都 沒有 多 大 的 實(shí) 用 價 值 。 型 酶 ： 應(yīng) 用 廣 泛 ， 能

4、在 DNA分 子 內(nèi) 部 的 特 異 位 點(diǎn) ， 識 別 和 切割 雙 鏈 DNA， 其 切 割 位 點(diǎn) 的 序 列 可 知 、 固 定 。 通 常 所 說 的 限 制 性 內(nèi) 切 酶 就 是 指 型 酶 。3.分 類 ： 根 據(jù) 結(jié) 構(gòu) 、 作 用 特 點(diǎn) 不 同 ， 分 為 三 類 。 10 識 別 位 點(diǎn) ： 即 為 型 酶 識 別 的 特 殊 DNA序 列 。通 常 是 4 8個 堿 基 對 、 具 有 回 文 序 列 的 DNA片 段 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 54.識 別 和 切 割 位 點(diǎn) ： 11 5突 出 粘 性 末 端 3突 出 粘

5、 性 末 端 平 頭 （ 鈍 性 末 端 ） 12 5 突 出 黏 性 末 端 (EcoR )：3 突 出 黏 性 末 端 (Pst )：平 端 缺 口 （ 鈍 性 末 端 ） ( Sma ） 5 -G AATTC-3 5 -G AATTC-3 3 -CTTAA G-5 3 -CTTAA G-55 -CTGCA G-3 5 -CTGCA G-33 -G ACGTC-5 3 -G ACGTC-55 -CCC GGG-3 5 -CCC GGG-33 -GGG CCC-5 3 -GGG CCC-5切 割 方 式 ： 對 dsDNA 2條 鏈 同 時 切 割 產(chǎn) 生 3種 不 同 缺 口 13 2、

6、DNA連 接 酶 催 化 DNA中 相 鄰 的 5 端 磷 酸 基 和 3 -OH末 端 之 間 形 成3 5 磷 酸 二 酯 鍵 。 大 腸 桿 菌 連 接 酶 ， 只 能 連 接 粘 性 末 端 ， T4噬 菌 體 連 接 酶 不但 能 連 接 粘 性 末 端 ， 還 能 連 接 齊 平 末 端 。ACG-OH P-AATTCGTTACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT- -TGCTTAAGCA 14 3、 DNA聚 合 酶 具 有 5 3聚 合 活 性 、 5 3外 切 酶 活 性 、 3 5外 切 酶 活 性 。可 用 于 合 成 雙 鏈 cDNA分 子 或 片 斷 連

7、 接 ， 探 針 制 備 ， 序 列 分 析 等 。（ 1） 耐 熱 Taq DNA聚 合 酶 最 適 反 應(yīng) 溫 度 為 75 80 具 有 5 3 外 切 酶 活 性 ， 不 具 有 3 5 外 切 酶 活 性（ 3） T4 DNA聚 合 酶 ： 主 要 用 于 DNA的 末 端 的 標(biāo) 記 。（ 4） T7 DAN聚 合 酶 長 模 板 DNA引 物 的 延 伸 反 應(yīng) ， 標(biāo) 記 DNA。（ 2） 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 15 （ 5） DNA聚 合 酶 大 片 段 （ Klenow 片 段 ） 為 DNA聚 合 酶 I用 枯 草 桿 菌 蛋 白 酶 裂 解 后 產(chǎn) 生 的 大 片 段 ， 分

8、子 量 為 76 kD， 這 個 片 段 也 稱 為 Klenow片 段 （ Klenow fragment） 它 除 了 保 留 5 3 聚 合 酶 活 性 及 3 5 外 切 酶 活 性 外 ，失 去 了 5 3 外 切 酶 活 性 。 常 用 于 cDNA第 二 鏈 合 成 ， 雙 鏈 DNA 3 端 標(biāo) 記 等 。 16 （ 1） 5 端 標(biāo) 記 （ 2） 制 備 載 體 時 ， 用 堿 性 磷 酸 酶 處 理 后 ， 可 防 止 載 體 自 身 連 接 ， 提 高 重 組 效 率 。 堿 性 磷 酸 酶 有 細(xì) 菌 堿 性 磷 酸 酶 （ BAP） 和 牛 小 腸 堿 性 磷 酸 酶

9、 （ CIP） 。 CIP能 在 1% SDS溶 液 中 68 加 熱 15 min而 失 活 ， 故 CIP較 為 常 用 。 4、 堿 性 磷 酸 酶 去 除 DNA、 RNA、 dNTP和 NTP 5端 的 磷 酸 根 。 17 催 化 單 脫 氧 核 苷 酸 轉(zhuǎn) 移 到 DNA3-端 羥 基 上 。應(yīng) 用 ： 探 針 標(biāo) 記 ， 標(biāo) 記 測 序 以 及 制 備 人 工 黏 性 末 端 。催 化 多 聚 核 苷 酸 5 羥 基 末 端 磷 酸 化 。用 途 ： 放 射 性 標(biāo) 記 DNA的 5端 使 缺 少 5-磷 酸 基 的 DNA磷 酸 化 用 于 連 接 反 應(yīng) 。單 鏈 核 酸

10、內(nèi) 切 酶 ， 降 解 單 鏈 DNA或 RNA。6、 T4多 聚 核 苷 酸 激 酶7、 S1核 酸 酶5、 末 端 轉(zhuǎn) 移 酶 18 第 四 節(jié) 重 組 DNA技 術(shù) 常 用 載 體 19 是 指 能 攜 帶 目 的 基 因 進(jìn) 入 宿 主 細(xì) 胞 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 和 表 達(dá) 的一 類 DNA分 子 。 一 、 定 義 分 類 ：克 隆 載 體 ： 用 于 在 宿 主 細(xì) 胞 中 克 隆 和 擴(kuò) 增 外 源 DNA片 段 。 表 達(dá) 載 體 ： 用 于 在 宿 主 細(xì) 胞 中 獲 得 外 源 基 因 表 達(dá) 產(chǎn) 物 。 20 1、 具 備 復(fù) 制 能 力 。2、 具 備 一 個 或 多 個

11、 篩 選 標(biāo) 志 。3、 具 備 較 多 拷 貝 數(shù) ， 易 從 宿 主 細(xì) 胞 中 分 離 純 化 。4、 具 備 一 個 或 多 個 限 制 性 內(nèi) 切 酶 的 單 一 識 別 點(diǎn) （ 多 克 隆 位 點(diǎn) ， MCS） 。5、 具 有 較 高 的 遺 傳 穩(wěn) 定 性 。 二 、 特 點(diǎn) 21 這 些 載 體 均 需 經(jīng) 人 工 構(gòu) 建 ， 除 去 致 病 基 因 ， 并 賦予 一 些 新 的 功 能 ： 如 有 利 于 進(jìn) 行 篩 選 的 標(biāo) 志 基 因 、 單 一的 限 制 酶 切 點(diǎn) 等 。 3、 常 用 載 體 質(zhì) 粒 DNA、 噬 菌 體 DNA、 病 毒 DNA、 酵 母 DNA

12、 22 1、 質(zhì) 粒 （ plasmid） : 質(zhì) 粒 為 細(xì) 菌 染 色 體 之 外 一 些 能 獨(dú) 立 復(fù) 制 并 保 持 穩(wěn) 定 遺 傳 的復(fù) 制 子 。 結(jié) 構(gòu) 上 ， 它 是 一 種 雙 鏈 閉 合 環(huán) 狀 的 DNA分 子 。 23 pBR322質(zhì) 粒 載 體 相 對 分 子 質(zhì) 量 小 ， 長 度 為 4.3kb。 含 有 氨 芐 青 霉 素 和 四 環(huán) 素 的 抗 性基 因 (Ampr和 Tetr)。 有 24種 限 制 性 內(nèi) 切 酶 位 點(diǎn) 。 有 一 個 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) （ ori） 及 與DNA復(fù) 制 有 關(guān) 的 序 列 ， 賦 予 該 質(zhì) 粒復(fù) 制 子 特 性 。

13、 為 松 弛 型 復(fù) 制 子 。 24 是 感 染 細(xì) 菌 的 一 類 病 毒 ，寄 生 于 細(xì) 菌 中 ， 并 能 溶 解 細(xì) 菌細(xì) 胞 ， 故 稱 噬 菌 體 。 2、 噬 菌 體 （ bacteriophage,phage) 25 噬菌體生活周期 26 27 4、 病 毒 3、 酵 母酵 母 人 工 染 色 體 （ YAC） ： 用 于 大 片 段 DNA的 克 隆 。 28 第 五 節(jié) 重 組 DNA技 術(shù) 29 基 本 步 驟 目 的 基 因 的 獲 取重 組 DNA導(dǎo) 入 受 體 菌目 的 基 因 與 載 體連 接 成 重 組 DNA克 隆 載 體 的 選 擇重 組 體 的 篩 選

14、 克 隆 基 因 的 表 達(dá) 30 1、 制 備 目 的 基 因（ 1） 化 學(xué) 合 成 ： 已 知 目 的 基 因 的 核 苷 酸 序 列 或 根 據(jù) 基 因 產(chǎn) 物 的 氨 基 酸 序列 推 導(dǎo) 出 相 應(yīng) 基 因 DNA堿 基 序 列 。 目 前 使 用 DNA合 成 儀 合 成 的 片 段 長 度 有 限 ， 一 般 用 于 小分 子 活 性 多 肽 基 因 的 合 成 ， 較 長 的 鏈 則 須 分 段 合 成 ， 然 后 用連 接 酶 加 以 連 接 。 31 （ 2） 構(gòu) 建 基 因 組 DNA文 庫 ： 將 某 種 生 物 細(xì) 胞 的 整 個 基因 組 DNA用 物 理 或 酶

15、 學(xué) 的 方 法切 割 成 預(yù) 期 大 小 的 片 斷 ， 并 將所 有 這 些 片 斷 都 與 適 當(dāng) 的 載 體連 接 ， 引 入 相 應(yīng) 的 宿 主 細(xì) 胞 中保 存 和 擴(kuò) 增 。 理 論 上 講 ， 這 些 重 組 載 體上 帶 有 了 該 生 物 體 的 全 部 基因 ， 稱 為 基 因 文 庫 。 32 (3)構(gòu) 建 cDNA文 庫 ： 33(5)直 接 用 限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 取 、 分 離 ： 對 一 些 物 理 圖 譜 已 經(jīng) 確 定 ， 背 景 資 料 清 楚 的原 核 生 物 、 噬 菌 體 及 病 毒 等 基 因 組 ， 可 直 接 用 限制 性 內(nèi) 切 酶

16、消 化 后 ， 通 過 分 離 獲 得 目 的 基 因 。 (4)聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) （ PCR） 已 知 目 的 基 因 的 基 因 序 列 ， 用 PCR從 基 因 組DNA中 獲 得 目 的 基 因 ， 或 用 逆 轉(zhuǎn) 錄 PCR方 法 直 接從 mRNA獲 得 特 定 基 因 的 cDNA。 34 2、 克 隆 載 體 的 選 擇 和 構(gòu) 建 用 于 基 因 組 文 庫 構(gòu) 建 的 載 體 通 常 選 裝 載 量 較 大 的 噬 菌 體和 黏 性 質(zhì) 粒 ； cDNA文 庫 和 克 隆 較 小 DNA片 段 通 常 選 pUC系 列 質(zhì) 粒 ； 待 測 DNA序 列 使 用 M13

17、噬 菌 體 。 35 由 同 一 種 限 制 酶 切割 或 不 同 的 限 制 酶 切 割形 成 互 補(bǔ) 的 黏 性 末 端 。經(jīng) 退 火 后 ， 由 DNA連 接酶 連 接 。3、 目 的 基 因 與 載 體 的 連 接 粘 性 末 端 連 接 ： 36 平 端 DNA片 段 可 以 在 T4 DNA連 接 酶 的 作 用下 相 連 接 ， 但 連 接 效 率 較 低 。 為 提 高 連 接 效 率 ,所 用 的 ATP及 T4 DNA連 接 酶 的 濃 度 比 粘 性 末 端連 接 要 高 些 。 （ 2） 平 端 連 接 ： 37 （ 3） 定 向 連 接 ：GAATTCCTTAAG A

18、GATCTTCTAGAEco R 切 割 位 點(diǎn) GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l 切 割 位 點(diǎn)AATTCG ATCTAG AATTCGGATCTA AATTCG ATCTAGEcoR + Bg l雙 酶 切 Eco R + Bg l雙 酶 切GCTTAA ATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連 接 酶 重 組 體 38 （ 4） 同 聚 物 加 尾 連 接 ： 39 （ 5） 人 工 接 頭 連 接 ： 接 頭 是 指 含 有 某 些限 制 性 內(nèi) 切 酶 切 點(diǎn) 的 寡核 苷 酸 片 段 。CCG AATTCG G G CTTAAG C5-3- Eco

19、 R 40 4、 重 組 DNA導(dǎo) 入 受 菌 體 將 重 組 DNA或 其 他 外 源 DNA導(dǎo) 入 宿 主 細(xì) 胞 的 常 用 方 法 ：轉(zhuǎn) 化 、 感 染 、 轉(zhuǎn) 染 、 顯 微 注 射 、 電 穿 孔 等 。轉(zhuǎn) 化 （ transformation） ： 是 指 將 重 組 質(zhì) 粒 DNA導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 。轉(zhuǎn) 染 （ transfection） ： 將 重 組 噬 菌 體 DNA直 接 引 入 受 體 細(xì) 胞的 過 程 。轉(zhuǎn) 導(dǎo) （ transduction） ： 重 組 噬 菌 體 DNA分 子 ， 在 體 外 經(jīng) 過 包裝 成 具 有 感 染 能 力 的 噬 菌 體 顆 粒

20、 ， 再 以 此 噬 菌 體 為 載 體 ， 將重 組 DNA導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 內(nèi) 的 過 程 ， 也 稱 為 感 染 （ infection） 。 41 5、 重 組 體 的 篩 選 與 鑒 定 篩 選 是 指 通 過 某 些 特 定 方 法 ， 從 被 轉(zhuǎn) 化 的 細(xì)胞 群 體 或 基 因 文 庫 中 ， 鑒 別 出 真 正 的 陽 性 重 組 子的 過 程 。 42 （ 一 ） 根 據(jù) 遺 傳 表 型 進(jìn) 行 篩 選 的 方 法 （ 1） 抗 生 素 抗 性 篩 選 （ 2） -半 乳 糖 苷 酶 系 統(tǒng) 篩 選（ 二 ） 根 據(jù) 重 組 子 結(jié) 構(gòu) 特 征 進(jìn) 行 篩 選 的 方

21、 法方 法 ： 43 （ 1） 抗 生 素 抗 性 篩 選 : 大 多 數(shù) 載 體 均 帶 有 抗 生 素 抗 性 基 因（ 一 ） 根 據(jù) 遺 傳 表 型 進(jìn) 行 篩 選 的 方 法 b.插 入 失 活 法 :外 源 基 因 插 入 到 一 個 抗 性 基 因 位 點(diǎn) ， 使 此 種 抗 生 素 抗 性 消 失 ， 重 組 體 轉(zhuǎn) 化 的 細(xì) 菌 不 能 在 含 有 這 種 抗 生 素 的 培 養(yǎng) 基 中 生 長 。a.構(gòu) 建 重 組 體 時 ， 保 留 了 抗 性 基 因 活 性 ， 所 轉(zhuǎn) 化 的 細(xì) 胞 就 能 在 含 此 種 抗 生 素 的 培 養(yǎng) 基 中 生 長 ,未 轉(zhuǎn) 化 的

22、細(xì) 胞 則 不 能 生 長 。 44 ( 插入失活法)抗生素抗性篩選 45 （ 2） -半 乳 糖 苷 酶 系 統(tǒng) 篩 選 46 47 （ 二 ） 根 據(jù) 重 組 子 結(jié) 構(gòu) 特 征 進(jìn) 行 篩 選 的 方 法 （ 1） 快 速 裂 解 菌 落 并 鑒 定 分 子 大 ?。?2） 內(nèi) 切 酶 酶 切 圖 譜 鑒 定（ 3） 分 子 雜 交（ 4） PCR（ 5） 核 酸 序 列 測 定 48 原位雜交 49 6、 外 源 基 因 的 表 達(dá) 與 分 離 純 化（ 一 ） 原 核 表 達(dá) 體 系 （ E.coli表 達(dá) 體 系 最 為 常 用 ） 利 用 原 核 細(xì) 胞 （ 大 腸 桿 菌 為

23、主 ） 作 受 體 細(xì) 胞 ， 經(jīng) 培 養(yǎng) 、誘 導(dǎo) 表 達(dá) 外 源 目 的 基 因 。 50 （ 二 ） 真 核 表 達(dá) 體 系 （ 酵 母 、 昆 蟲 、 哺 乳 類 動 物 細(xì) 胞 ） 利 用 真 核 細(xì) 胞 作 為 受 體 細(xì) 胞 ， 誘 導(dǎo) 表 達(dá) 外 源 基 因 51 （ 1） 分 離 ： 提 取 和 獲 得 目 的 基 因 和 載 體（ 2） 切 割 ： 分 別 對 目 的 基 因 和 載 體 DNA 酶 切 ；（ 3） 連 接 ： 目 的 基 因 與 載 體 連 接 ， 形 成 新 的 重 組 DNA分 子 ；（ 4） 轉(zhuǎn) 化 ： 用 重 組 DNA分 子 轉(zhuǎn) 化 受 體 細(xì) 胞 ；（ 5） 篩 選 ： 篩 選 轉(zhuǎn) 化 成 功 的 細(xì) 胞 克 隆（ 6） 表 達(dá) ： 培 養(yǎng) 獲 得 外 源 基 因 的 細(xì) 胞 或 生 物 體 ， 獲 得 所 需 的 遺 傳 性 狀 或 表 達(dá) 出 所 需 要 的 產(chǎn) 物 。小 結(jié) ： 52 第 六 節(jié) 重 組 DNA技 術(shù) 的 在 醫(yī) 學(xué) 上 的 應(yīng) 用 （ 自 學(xué) ） 53 謝 謝 ！