《《蛋白質(zhì)化學(xué)》課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《《蛋白質(zhì)化學(xué)》課件（125頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、蛋 白 質(zhì) 化 學(xué)Protein chemistry 問 題什 么 是 蛋 白 質(zhì) ? 什 么 是 蛋 白 質(zhì)分 子 ? 蛋 白 質(zhì) 化 學(xué) 的 內(nèi) 容 是 什 么 ? 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 蛋 白 質(zhì) 的 定 義 蛋 白 質(zhì) 的 分 類 蛋 白 質(zhì) 的 化 學(xué) 組 成 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系 理 化 性 質(zhì) 和 分 離 提 純 蛋 白 質(zhì) 的 定 義蛋 白 質(zhì) 的 定 義 protein is derived from the Greek word (proteios), meaning in the lead or standing in fr

2、ont.or the most important 蛋 白 質(zhì) 分 子 蛋 白 質(zhì) 的 最 小 功 能 單 位 蛋 白 質(zhì) 的 分 類n 按 形 狀 分 ：n 按 組 成 分n 按 功 能 分n 按 結(jié) 構(gòu) 分 按 形 狀 分 類n軸 比 ： 長 軸 與 短 軸 的 比 例 。 10:1纖 維 狀 蛋 白 Fibrous proteins球 狀 蛋 白 質(zhì) Globular proteins膜 蛋 白 Membrane proteins 纖 維 狀 蛋 白 a-Keratin a-ibroin and -Keratin: -Sheet Proteins Triple Helix : Colla

3、gen 球 狀 蛋 白 質(zhì) 膜 蛋 白 按 組 成 分 類n 終 產(chǎn) 物 氨 基 酸 簡 單 蛋 白 （ simple protein） 結(jié) 合 蛋 白 （ conjugated protein） 分 類 溶 解 度 實(shí) 例可 溶 不 溶 或 沉 淀清 蛋 白(albumins) 水 、 稀 鹽 、 稀 酸、 稀 堿 飽 和 硫 酸 銨 血 清 清 蛋 白 、 卵 清 蛋 白球 蛋 白（ globulins） 稀 鹽 、 稀 酸 、 稀堿 水 、 1/2飽 和 硫酸 銨 血 清 清 蛋 白 、 溶 菌 酶谷 蛋 白(glutelins) 稀 酸 、 稀 堿 水 、 稀 鹽 麥 谷 蛋 白醇 溶

4、 蛋 白(prolamines) 70%90%乙 醇 水 小 麥 醇 溶 谷 蛋 白組 蛋 白(histones) 水 、 稀 酸 氨 水 富 含 Arg、 Lys的 堿 性 蛋 白 ，與 DNA結(jié) 合精 蛋 白(protamines) 水 、 稀 酸 氨 水 富 含 Arg、 Lys， 缺 少 Trp、Tyr 硬 蛋 白(scleroproteins) 水 、 稀 鹽 、 稀酸 、 稀 堿 角 蛋 白 、 膠 原 蛋 白 簡 單 蛋 白 質(zhì) 分 類 輔 基 實(shí) 例核 蛋 白 類 DNA或 RNA 病 毒 、 脫 氧 核 糖 蛋 白糖 蛋 白 類 糖 類 免 疫 球 蛋 白 、 血 型 糖 蛋

5、 白脂 蛋 白 類 脂 類 血 細(xì) 胞 凝 集 素磷 蛋 白 類 磷 酸 基 乳 酪 蛋 白黃 素 蛋 白類 黃 素 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸 或 黃 素 單核 苷 酸 氨 基 酸 氧 化 酶 、 琥 珀 酶 脫 氨酸色 蛋 白 類 血 紅 素 或 葉 綠 素 血 紅 蛋 白 、 葉 綠 素 蛋 白金 屬 蛋 白 金 屬 離 子 ， 如 :Fe、 Mo、 Cu、Zn等 固 氮 酶 、 鐵 氧 還 蛋 白結(jié) 合 蛋 白 蛋 白 質(zhì) 在 生 命 活 動(dòng) 中 的 作 用生 物 體 的 組 成 成 分 -結(jié) 構(gòu)酶運(yùn) 輸運(yùn) 動(dòng)抗 體激 素遺 傳 信 息 的 控 制細(xì) 胞 膜 的 通 透 性記 憶 、

6、識(shí) 別按功能分類 以 上 分 類 方 法 各 有 什 么 好 處 ? 蛋 白 質(zhì) 的 化 學(xué) 組 成 一 、 蛋 白 質(zhì) 的 元 素 組 成 特 征 二 、 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 三 、 氨 基 酸 的 主 要 理 化 性 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 的 元 素 組 成所 有 蛋 白 質(zhì) 均 含 有 C: 50-55% H: 6 -8 O: 20 -23 N: 15 -17某 些 蛋 白 質(zhì) 含 有 ： S， P等非金 屬 元 素個(gè) 別 蛋 白 質(zhì) 含 有 ： Zn, Fe, Cu 等 金 屬元 素 蛋 白 質(zhì) 的 元 素 組 成 特 點(diǎn)各 種 蛋 白 質(zhì) 的 平 均 含 量 氮 為 1

7、6 左 右蛋 白 質(zhì) 含 量 （ 克 %） =每 克 生 物 樣 品 中 含 氮的 克 數(shù) 6.25 （ 蛋 白 質(zhì) 系 數(shù) ）凱 氏 （ Kjeldahl） 定 氮 法 測 定 蛋 白 質(zhì) 含 量 測 定 方 法 最 常 用 的 四 種 基 本 方 法 ： 定 氮 法 ， 雙 縮 尿 法 （ Biuret法 ） 、 Folin 酚法 （ Lowry法 ） 和 紫 外 吸 收 法 、 考 馬 斯 亮 藍(lán) 法（ Bradford法 ） 。 其 中 ： Bradford法 和 Lowry法 靈 敏 度 比 紫 外 法靈 敏 10 20倍 ， 比 Biuret法 靈 敏 100倍 以 上 。 定 氮

8、 法 雖 然 比 較 復(fù) 雜 ， 但 較 準(zhǔn) 確 ， 往 往 作 為 其他 方 法 的 標(biāo) 準(zhǔn) 。 凱 氏 （ Kjeldahl） 定 氮消化、蒸餾和滴定 方 法 選 擇 每 種 測 定 法 各 有 優(yōu) 缺 點(diǎn) 。 選 擇 時(shí) 應(yīng) 考 慮 ： 對 測 定 所 要 求 的 靈 敏 度 和 精 確 度 ； 蛋 白 質(zhì) 的 性 質(zhì) 溶 液 中 存 在 的 干 擾 物 質(zhì) ； 測 定 所 要 花 費(fèi) 的 時(shí) 間 。 考 馬 斯 亮 藍(lán) 法 （ Bradford法 ） ， 越 來 越 廣泛 的 應(yīng) 用 我國的牛奶事件 三聚氰胺“白色血液” 0r 牛奶致癌 性 激 素 、 IGF-1 三聚氰胺牛奶按照我國

9、制定的生鮮牛奶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原奶的蛋白質(zhì)含量在2.9以上，即100克生鮮牛奶的蛋白質(zhì)含量在2.9克以上屬于合格產(chǎn)品，如低于2.9，就意味著向原奶里摻加了水。我國目前采用的檢測牛奶蛋白質(zhì)含量的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法的缺點(diǎn)是：能檢測出氮元素的量，而檢測不出氮屬于什么化合物。 三聚氰胺（Melamine）（C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為“2,4,6-三氨基- 1,3,5-三嗪”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。白色單斜晶體，幾乎無味，微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸等，不溶於丙酮、醚類、對身體有害，不可用於食品加工或食品添加物。由它制成的樹

10、脂可用作阻燃劑。它也是殺蟲劑環(huán)丙氨嗪在動(dòng)物和植物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 氨 基 酸 的 結(jié) 構(gòu) 氨 基 酸 的 分 類 稀 有 氨 基 酸 非 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 構(gòu) 成 蛋 白 質(zhì) 的 基 本 結(jié) 構(gòu) 單 位 -氨 基 酸 （ Amino Acid）n自 然 界 氨 基 酸 有 300種 ， 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 有20種 。 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸結(jié)構(gòu)：L-氨基酸通式 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 分 類按 R基 的 極 性 性 質(zhì)（ 即 細(xì) 胞 內(nèi) 的 pH范 圍 時(shí) 的 解 離 狀 態(tài) ）按 R基 的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu)按 R基 極 酸 堿 性 分 類按

11、來 源 分 類不 同 分 類 方 法 有 不 同 的 用 途 按 R側(cè) 鏈 極 性 分 為 四 大 類不 帶 電 荷 極 性 氨 基 酸 ： Gly,Ser,Thr, Cys,Thr,Asn,Gln帶 負(fù) 電 荷 極 性 氨 基 酸 ： Asp,Glu帶 正 電 荷 極 性 氨 基 酸 His,Arg,Lys非 極 性 氨 基 酸 ： Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Trp, Met 按 R基 的 結(jié) 構(gòu) 分 類1 脂 肪 族 氨 基 酸 ： 一 氨 基 一 羧 基 氨 基 酸 ： 甘 氨 酸 ， 丙 氨 酸 ， 纈氨 酸 ， 亮 氨 酸 ， 異 亮 氨 酸 羥 基

12、 氨 基 酸 ： 絲 氨 酸 ， 蘇 氨 酸 。 含 硫 氨 基 酸 ：半 胱 氨 酸 ， 甲 硫 氨 酸 （ 蛋 氨 酸 ） 酰 胺 基 氨 基 酸 ： 天 冬 酰 胺 ， 谷 氨 酰 胺 。 一 氨 基 二 羧 基 氨 基 酸 ： 天 冬 氨 酸 ， 谷 氨 酸 。 二 氨 基 一 羧 基 氨 基 酸 ： 賴 氨 酸 ， 精 氨 酸 。2.芳 香 族 氨 基 酸 ： 苯 丙 氨 酸 、 酪 氨 酸 。3.雜 環(huán) 族 氨 基 酸 ： 色 氨 酸 、 組 氨 酸 、 脯 氨 酸 。 1、 中 性 AA（ 有 極 性 與 非 極 性 15種 ）2、 酸 性 AA（ 2種 ） ： 天 冬 氨 酸

13、、 谷 氨 酸3、 堿 性 AA（ 3種 ） ： 組 、 賴 、 精按 R基 酸 堿 性 分 類 按 R側(cè) 鏈 極 性 分 類 有 何 優(yōu) 點(diǎn) 氨 基 酸 開 發(fā) 應(yīng) 用氨基酸工業(yè)是自20世紀(jì)50年代以來，一個(gè)朝氣蓬勃的新興工業(yè)體系。氨基酸的研究、開發(fā)和應(yīng)用方面均取得重大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)的新氨基酸種類和數(shù)量已由60年代50種左右，發(fā)展到80年代的400種，目前已達(dá)1000多種。其中用于藥物的氨基酸及氨基酸衍生物的品種達(dá)100多種。我國藥用氨基酸原料生產(chǎn)廠現(xiàn)今已發(fā)展到40多家，產(chǎn)量由1994年的600多t增長4000多t，18種基本氨基酸中已有17種實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)化。氨基酸在醫(yī)藥上主要用作氨基酸輸液和口服

14、氨基酸制劑，此外還用作治療藥物 、短肽藥物和醫(yī)藥合成原料。 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 的 理 化 性 質(zhì) 物 理 性 質(zhì)旋光性紫外吸收 氨基酸的等電點(diǎn)n氨 基 酸 的 化 學(xué) 性 質(zhì) 氨 基 酸 物 理 性 質(zhì)無 色 晶 體 、 有 味 （ 甜 、 鮮 、 苦 ） 或 無 味 ， 不同 程 度 溶 于 水 、 稀 酸 、 稀 堿 ， 但 不 溶 于 任 何有 機(jī) 溶 劑 。光 學(xué) 性 質(zhì) ： 色 氨 酸 、 酪 氨 酸 、 苯 丙 氨 酸 有 紫外 吸 收 ， 各 種 氨 基 酸 在 可 見 區(qū) 都 沒 有 光 吸 收除 甘 氨 酸 外 ， 氨 基 酸 均 含 有 一 個(gè) 手 性 -碳 原子 ，

15、 因 此 都 具 有 旋 光 性 。 氨 基 酸 的 比 旋 光 度是 物 理 常 數(shù) 之 一 。 D-型 和 L-型 氨 基 酸 D-型 和 L-型 構(gòu) 型 COO- COO-NH3+ C H H C NH3+ R R根 據(jù) 甘 油 醛 原 則 確 定 構(gòu) 型自 然 界 的 氨 基 酸 有 兩 種 構(gòu) 型除 甘 氨 酸 外 ， 其 余 19種 氨 基 酸都 是 D-型 和 L-型 的 生 理 意 義 ？ 飼 用 氨 基 酸 ？ 氨 基 酸 的 光 吸 收 特 征 色 氨 酸 、 酪 氨 酸 、苯 丙 氨 酸 的 最 大 吸收 波 長 分 別 為 279、278、 259nm利 用 紫 外 分

16、 光 光度 計(jì) （ 280nm處 ）測 定 蛋 白 質(zhì) 濃 度 的基 礎(chǔ) 。 氨 基 酸 的 兩 性 解 離 與 等 電 點(diǎn)氨 基 酸 在 結(jié) 晶 形 態(tài) 或 水 溶 液 中 氨 基 是 以 -NH3+存 在 ，羧 基 以 -COO-存 在 。 COO-C HH3N+ R-pK1+H+H+COOHC HH3N+ R H+H+pK2- COO-C HH2N Ru氨 基 酸 的 等 電 點(diǎn)（Isoelectric point, PI）： 氨 基酸 所 帶 凈 電 荷 為 零 時(shí) 溶 液 的 pH值 氨 基 酸 等 電 點(diǎn) 的 滴 定 氨 基 酸 等 電 點(diǎn) 與 溶 液 pH的 關(guān) 系 ? 稀 有

17、氨 基 酸除 了 20種 常 見 氨 基 酸 以 外 ， 還 有 一 些 僅 存 在 于 少數(shù) 蛋 白 質(zhì) 中 的 氨 基 酸 。 例 如 ： 膠 原 蛋 白 中 羥 脯 氨 酸 和 羥 賴 氨 酸 ； 甲 狀 腺 球 蛋 白 中 的 二 碘 酪 氨 酸 和 甲 狀 腺 素 ； 肌 球 蛋 白 中 的 -N-甲 基 賴 氨 酸 ； -角 蛋 白 中 的 胱 氨 酸 上 述 氨 基 酸 是 常 見 氨 基 酸 的 衍 生 物 ,沒 有 遺 傳密 碼 ， 是 通 過 有 關(guān) 酶 的 催 化 修 飾 而 形 成 的 。 非 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 蛋 白 質(zhì) 氨 基 酸 測 定 蛋 白 質(zhì) 水 解

18、氨 基 酸 分 離 氨 基 酸 測 定 1、 蛋 白 質(zhì) 酸 水 解常 用 6mol/L的 鹽 酸 或 4mol/L的 硫 酸 ，回 流 煮 沸 20小 時(shí) 左 右 使 蛋 白 質(zhì) 完 全 水解 。優(yōu) 點(diǎn) ： 不 引 起 消 旋 作 用 ， 得 到 的 是 L-氨 基 酸 。缺 點(diǎn) ： 色 氨 酸 完 全 被 破 壞 ； 羥 基 氨 基酸 （ 絲 或 蘇 ） 部 分 被 分 解 ， 天 門 冬 酰胺 和 谷 氨 酰 胺 酰 胺 基 水 解 成 羧 基 。 2、 蛋 白 質(zhì) 堿 水 解 一 般 用 5mol/L氫 氧 化 鈉 煮 沸 10-20小 時(shí) 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 蛋 白 質(zhì) 完 全 水 解

19、， 色 氨 酸 不 破 壞 。 缺 點(diǎn) ：許 多 氨 基 酸 都 受 到 不 同 程 度 的 破 壞 ， 產(chǎn) 率不 高 。部 分 的 水 解 產(chǎn) 物 消 旋 化 ， 是 D-型 和 L-型 氨基 酸 的 混 合 物 。 3、 蛋 白 質(zhì) 酶 水 解優(yōu) 點(diǎn) ： 不 會(huì) 破 壞 氨 基 酸 ， 不 發(fā) 生 消 旋 化 。缺 點(diǎn) ： 一 種 酶 往 往 水 解 不 徹 底 ， 需 多 種 酶協(xié) 同 作 用 。 所 需 時(shí) 間 較 長 。 最 常 見 的 蛋 白 水 解 酶 有 以 下 幾 種 ： 胰 蛋 白 酶 、 糜 蛋 白 酶 、 胃 蛋 白 酶 、 嗜 熱 菌蛋 白 酶 等 。 氨 基 酸 分

20、 離 氨 基 酸 的 化 學(xué) 反 應(yīng) -氨 基 的 化 學(xué) 反 應(yīng) -羧 基 的 化 學(xué) 反 應(yīng)R-基 的 化 學(xué) 反 應(yīng) 成 肽 反 應(yīng) 肽 鍵 ： 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 氨 基 酸 的 -COOH和 氨 基酸 的 -NH2脫 水 縮 合 而 成 的 酰 胺 鍵 。 肽 ： 由 肽 鍵 形 成 的 化 合 物 -氨 基 的 化 學(xué) 反 應(yīng) 氨 基 酸 -氨 基 反 應(yīng) 具 有 特 殊 的 意 義 : 茚 三 酮 的 反 應(yīng) Sanger反 應(yīng) Edman反 應(yīng)氨 基 酸 的 -羧 基 可 以 和 堿 作 用 生 成 鹽 。其 重 金 屬 鹽 不 溶 液 于 水 。 氨 基 酸 的 羧 基

21、可以 被 醇 類 所 酯 化 而 生 成 相 應(yīng) 的 酯 。 茚 三 酮 的 反 應(yīng) 2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)萘磺酰氯（DNS-Cl） Edman法 （ 異 硫 氰 酸 苯 酯 ） Edman降 解 法 測 定 氨 基 酸 序 列 R-基 的 化 學(xué) 反 應(yīng) 絲 氨 酸 、 蘇 氨 酸 、 羥 脯 氨 酸 羥 基 能 成 酯 。酪 氨 酸 苯 酚 基 ， 組 氨 酸 咪 唑 基 具 有 芳 香環(huán) 或 雜 環(huán) ， 能 與 重 氮 化 合 物 結(jié) 合 而 生 成 棕紅 色 化 合 物 ， 可 以 定 性 、 定 量 測 定半 胱 氨 酸 側(cè) 鏈 的 巰 基 （ -SH） ， 易 被 氧

22、化 生 成 胱 氨 酸 ， 胱 氨 酸 中 的 二 硫 鍵 在 形 成蛋 白 質(zhì) 的 構(gòu) 象 上 起 很 大 的 作 用 。 Ag 、Hg2 能 與 巰 基 反 應(yīng) ， 生 成 硫 醇 鹽 。 H2NCHCH2S SHNO2HOOCSNO2COOHCOOH + S SNO2NO2HOOC COOHH2NCHCOOH +CH2SH pH8.0硫代硝基苯甲酸測 定 Cys含 量 （ pH8.0 412nm的 摩 爾 消 光 系數(shù) =13600） 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 的 層 次n初 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ： 氨 基 酸 排 列 順 序n高 級(jí) 結(jié) 構(gòu) :二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ： 主 鏈 骨 架 的 局 部 空 間

23、結(jié) 構(gòu)超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ： 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 單 位 的 集 合 體結(jié) 構(gòu) 域 ： 多 肽 可 以 明 顯 區(qū) 分 的 球 狀 區(qū) 域三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ： 整 個(gè) 多 肽 鏈 所 有 原 子 的 空 間排 布四 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ： 由 亞 基 或 分 子 締 和 而 成 的 集合 體 蛋 白 質(zhì) 與 多 肽蛋 白 質(zhì) 與 多 肽 并 無 嚴(yán) 格 的 界 線 :1.蛋 白 質(zhì) 分 子 量 變 化 范 圍 很 大 , 從 大 約6000到 1000000道 爾 頓 甚 至 更 大 。 通 常 是將 分 子 量 在 6000道 爾 頓 以 上 的 多 肽 稱 為蛋 白 質(zhì) ；2.構(gòu) 象 的 穩(wěn) 定 性 。

24、 蛋 白 質(zhì) 比 多 肽 穩(wěn) 定 蛋 白 質(zhì) 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu)蛋 白 質(zhì) 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) （ protein primary structure） 又 稱 初 級(jí) 結(jié) 構(gòu) ， 共 價(jià) 結(jié) 構(gòu) ：蛋 白 質(zhì) 多 肽 鏈 氨 基 酸 的 組 成 和 排 列 順 序 。游 離 的 -氨 基 端 稱 為 氨 基 端 或 N-端 ；游 離 的 -羧 基 端 稱 為 羧 基 端 或 C-端 。多 肽 鏈 上 不 完 整 的 氨 基 酸 ， 稱 為 氨 基 酸殘 基 蛋 白 質(zhì) 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 分 析蛋 白 質(zhì) 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 分 析 包 括 :v組 成 蛋 白 質(zhì) 的 多 肽 鏈 數(shù) 目v多 肽

25、 鏈 的 氨 基 酸 數(shù) 目 、 種 類v多 肽 鏈 的 氨 基 酸 順 序v二 硫 鍵 的 數(shù) 目 和 位 置v其 中 最 重 要 的 是 多 肽 鏈 的 氨 基 酸 順 序 。 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 層 次 與 慨 念 ? GSH與GSSG 谷 胱 甘 肽 （ GSH）2GSH GSSG 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 表 示C C N C C N C C N C C N C C H 2 C H C H 2 C H 2 C H 2 C O O -O H C O 2H C H 2C O N H 2O HC H 3H 3N + O O O OH H H H HH H H HSer Val Tyr Asp

26、 GlnC H 3N-端 C-端肽鍵氨 基 酸 的 順 序 是 從 N-端 的 氨 基 酸 殘 基 開 始 ， 以 C-端 氨基 酸 殘 基 為 終 點(diǎn) 的 排 列 順 序 。如 上 述 五 肽 可 表 示 為 ： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 分 析 氨 基 酸 自 動(dòng) 測 序 儀 蛋 白 質(zhì) 的 高 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 原 理肽 單 位 平 面 結(jié) 構(gòu) 和 二 面 角維 持 蛋 白 質(zhì) 分 子 構(gòu) 象 的 化 學(xué) 鍵 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 結(jié) 構(gòu) 域 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 四 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 蛋 白 質(zhì) 的 構(gòu) 象 原 理1.構(gòu) 型 與 構(gòu) 象構(gòu)

27、型 是 指 在 立 體 異 構(gòu) 體 中 取 代 原 子 或 基 團(tuán) 在 空間 的 取 向 。 構(gòu) 型 互 變 -共 價(jià) 鍵 的 破 裂構(gòu) 象 是 指 基 團(tuán) 當(dāng) 單 鍵 旋 轉(zhuǎn) 時(shí) 可 能 形 成 的 不 同 的立 體 結(jié) 構(gòu) 。 構(gòu) 象 改 變 并 不 涉 及 共 價(jià) 鍵 的 破 裂 。2.多 肽 鏈 折 疊 的 空 間 限 制 肽 骨 架 由 肽 平 面 組 成 肽 平 面 繞 C -N1和 C -C2鍵 旋 轉(zhuǎn) 。 和 可以 取 -180 +180 之 間 的 一 值 。 但 和 的大 小 受 R基 影 響 。 肽 鍵 （ peptide bond） ：肽 鍵 具 有 部 分 雙 鍵 的

28、 性 質(zhì)組 成 肽 鍵 的 原 子 處 于 同 一 平 面 。 0.127nm鍵 長 =0.132nm 0.148nmCNC=N 肽 平 面 （ peptide plane） :連 接 在 肽 鍵 上 的六 個(gè) 原 子 共 處 于 一 個(gè) 平 面 上 ， 此 平 面 稱 為肽 平 面 。 兩 面 角（dihedral angle） C 碳 原 子 位 于 兩 個(gè) 肽 平 面 的 交 線 上 。 C 上 的C -N和 C -C都 是 可 繞 鍵 旋 轉(zhuǎn) ， 其 中 以 C -N旋 轉(zhuǎn)的 角 度 稱 為 ， 而 以 C -C旋 轉(zhuǎn) 的 角 度 稱 為 ， 這就 是 -碳 原 子 上 的 一 對 二

29、 面 角 。 維 持 蛋 白 質(zhì) 分 子 構(gòu) 象 的 化 學(xué) 鍵離 子 鍵 (a)氫 鍵 （ b） 疏 水 作 用 力 (c)范 德 華 引 力 (d)配 位鍵 、 二 硫 鍵 (e)蛋 白 質(zhì) 分 子 構(gòu) 象 主 要 靠 非 共 價(jià) 鍵 維 持 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) （ secondary structure）指 多 肽 鏈 主 鏈 在 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 基 礎(chǔ) 上 進(jìn) 一步 的 盤 旋 或 折 疊 ， 形 成 的 周 期 性 構(gòu) 象 ，又 稱 為 主 鏈 空 間 結(jié) 構(gòu) ， 主 鏈 構(gòu) 象 結(jié) 構(gòu) 單元 。維 系 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 力 是 氫 鍵 。二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 主 要 形 式 -螺

30、旋 、 -折 疊 、 -轉(zhuǎn) 角 、 -轉(zhuǎn) 角 、無 規(guī) 卷 曲 -螺 旋 ( -helix) 3.613 螺 旋每 一 圈 含 3.6個(gè) 殘 基 ， 13個(gè) 原 子 ， 螺 距 0.54nm，殘 基 高 0.15nm， 螺 旋 半 徑 0.23nm 角 -57 ， 角 等 于 -47 。相 鄰 螺 圈 之 間 形 成 鏈 內(nèi) 氫 鍵 。 即 一 個(gè) 肽 單 位 的基 氧 原 子 與 其 前 的 第 三 個(gè) 肽 單 位 的 基 氫 原 子 生 成一 個(gè) 氫 鍵 。 氫 鍵 與 螺 軸 幾 乎 平 行 。 所 有 肽 鍵 都 能參 與 鏈 內(nèi) 氫 鍵 的 形 成 。與 -碳 原 子 相 連 的 R

31、側(cè) 鏈 ， 位 于 -螺 旋 的 外 側(cè) 。由 1條 充 分 伸 展 的 肽 鏈 的 肽 鍵 平 面 折 疊 成 的 右 手螺 旋 。 -折 疊 （ - sheet）多 肽 鏈 中 一 段 較伸 展 的 周 期 性 折疊 的 鋸 齒 形 的 主鏈 構(gòu) 象 -折 疊 有 兩 種 類型 :即 平 行 結(jié) 構(gòu) 和反 平 行 結(jié) 構(gòu) . -折 疊 -折 疊 是 由 兩 條 或 多 條 幾 乎 完 全 伸 展 的 肽 鏈平 行 排 列 ， 通 過 鏈 間 的 氫 鍵 交 聯(lián) 而 成 的 。 肽 鏈 的 主 鏈 呈 鋸 齒 樁 折 疊 構(gòu) 象 。 在 -折 疊 中 ， -碳 原 子 總 是 處 于 折 疊

32、 的 角上 ， 氨 基 酸 的 R基 團(tuán) 處 于 折 疊 的 棱 角 上 并 與棱 角 垂 直 ， 兩 個(gè) 氨 基 酸 之 間 的 軸 心 距 為0.35nm。 -折 疊 有 兩 種 類 型 。 一 種 為 平 行 式 ， 即 所 有肽 鏈 的 N-端 都 在 同 一 邊 。 另 一 種 為 反 平 行 式 ，即 相 鄰 兩 條 肽 鏈 的 方 向 相 反 。 -轉(zhuǎn) 角 (-turn)又 稱 為 -回 折 、 -彎 曲 或 發(fā) 卡 結(jié) 構(gòu) .是 多 肽鏈 180回 折 處 的 特 殊 結(jié) 構(gòu) 。 在 第 一 個(gè) 氨 基 酸殘 基 的 C=O和 第 四 個(gè) 氨 基 酸 殘 基 的 N-H之 間形

33、 成 一 個(gè) 氫 鍵 。 n無 規(guī) 卷 曲 （ random coil）蛋 白 質(zhì) 的 肽 鏈 中 沒 有 確 定 規(guī) 律 性 肽 段 構(gòu)象 。 結(jié) 構(gòu) 比 較 松 散 。 和 -螺 旋 、 -折疊 、 -轉(zhuǎn) 角 比 較 是 不 規(guī) 則 的 ， 但 對 于 一些 蛋 白 質(zhì) 分 子 來 講 ， 特 定 的 無 規(guī) 卷 曲 構(gòu)象 是 不 能 被 破 壞 的 ， 否 則 就 失 去 活 性 。n -轉(zhuǎn) 角 （ -turn angle）存 在 于 蛋 白 質(zhì) 180回 折 處 ， 是 由 3個(gè) 連 續(xù) 的氨 基 酸 殘 基 組 成 ， 第 一 個(gè) 和 第 三 個(gè) 殘 基 之間 形 成 兩 個(gè) 氫 鍵

34、 以 維 持 其 結(jié) 構(gòu) 的 穩(wěn) 定 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測 超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)（super secondary structure） 球 狀 蛋 白 質(zhì) 分 子 中 的 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 順 序 上 相 鄰 的二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 常 常 在 三 維 中 相 互 靠 近 ， 在 局 部 區(qū)域 形 成 規(guī) 則 的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 聚 合 體 。 motif 常 見 的 超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 類 型 結(jié) 構(gòu) 域 （ domain）結(jié) 構(gòu) 域 (strucbural domain)或 稱 轄 區(qū) ， 是 近似 球 狀 的 三 維 實(shí) 體 。 對 于 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 或亞 基 ， 多 肽

35、鏈 往 往 由 兩 個(gè) 或 兩 個(gè) 以 上 相 對 獨(dú) 立的 三 維 實(shí) 體 締 合 而 成 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 。 l丙 酮 酸 激 酶 的 一 個(gè) 結(jié) 構(gòu) 域 超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 和 結(jié) 構(gòu) 域超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 是 若 干 相 鄰 的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 構(gòu) 象單 元 彼 此 相 互 作 用 ， 形 成 有 規(guī) 則 的 ， 在 空間 上 能 辨 認(rèn) 的 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 組 合 體 。 是 蛋 白 質(zhì)二 級(jí) 至 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 一 種 過 渡 態(tài) 構(gòu) 象 層 次 。結(jié) 構(gòu) 域 是 球 狀 蛋 白 質(zhì) 的 折 疊 單 位 。 在 超二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 基 礎(chǔ) 上 進(jìn) 一 步 繞 曲 折 疊 成

36、緊 密的 近 似 球 行 的 結(jié) 構(gòu) ， 具 有 部 分 生 物 功 能 。對 于 較 大 的 蛋 白 質(zhì) 分 子 或 亞 基 ， 多 肽 鏈 往往 由 兩 個(gè) 以 上 結(jié) 構(gòu) 域 締 合 而 成 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 。 蛋 白 質(zhì) 的 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu)（tertiary structure） 指 一 條 多 肽 鏈 在 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) （ 超 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu)及 結(jié) 構(gòu) 域 ） 的 基 礎(chǔ) 上 ， 進(jìn) 一 步 盤 繞 、 折疊 而 成 的 具 有 特 定 肽 鏈 走 向 的 緊 密 球 狀結(jié) 構(gòu) , 或 者 說 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 是 指 多 肽 鏈 中 所有 原 子 的 空 間 排 布 。 維 系 三

37、 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 力 有 疏 水 作 用 力 、 氫 鍵 、 范 德 華 力 、 鹽 鍵 鯨 肌 紅 蛋 白的 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu)1957年由John Kendrew 用X射線晶體分析法測定的有三維結(jié)構(gòu)1） 由 一 條 多 肽 鏈 （ 153個(gè) Aa殘 基 ） 和 一 個(gè) 血 紅 素 組 成 。2） 多 肽 鏈 主 鏈 主 鏈 骨 架 折 疊 、 盤 繞 成 A,B,C,D,E,F,G,H 8個(gè) 肽 段 3） 8個(gè) 肽 段 均 為 -螺 旋 結(jié) 構(gòu) ， 兩 段 之 間 的 拐 角 處 形 成 無 規(guī) 卷 曲 4） 親 水 氨 基 酸 分 布 于 分 子 的 外 表 面 ， Mb溶 于 水5） 疏

38、水 氨 基 酸 包 埋 于 分 子 內(nèi) 部 ， 形 成 疏 水 空 穴 ， 血 紅 素 輔 基 位 于 其 中 四 級(jí) 結(jié) 構(gòu)由 具 有 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 肽 鏈 通 過 非 共 價(jià) 鍵 連 接 起 來的 結(jié) 構(gòu) 形 式 ；最 小 的 單 位 通 常 稱 為 亞 基 或 亞 單 位 Subunit， 亞基 ,分 別 以 、 、 、 、 命 名 。 根 據(jù) 亞 基數(shù) 目 的 不 同 ， 可 分 為 二 聚 體 、 三 聚 體 、 四 聚 體 等 。寡 聚 蛋 白 (Oligomer protein)與 多 聚 蛋 白 (polymer protein)。四 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 包 括 亞 基 的 種

39、類 、 數(shù) 目 、 空 間 排 布 以及 相 互 作 用 。 亞 基 的 排 列 是 對 稱 的 。維 持 四 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 作 用 力 是 疏 水 鍵 、 離 子 鍵 、氫 鍵 、 范 德 華 引 力 。 主 要 是 疏 水 力 。 Hb（ hemeglobin） 四 級(jí) 結(jié) 構(gòu) Mb 與 Hb 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系高 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系1、 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 中 個(gè) 別 氨 基 酸 改 變 可 能 改 變 功 能Cys-Tyr- -Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly 加 壓

40、素S SCys-Tyr-Ile -Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly 催 產(chǎn) 素S S2、 關(guān) 鍵 肽 端 的 改 變 導(dǎo) 致 功 能 改 變 ACTH(促 腎 上 腺 皮 質(zhì) 激 素 ) SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDELAEAFPLEF 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 反 映 物 種 的 進(jìn) 化 -分子 進(jìn) 化細(xì) 胞 色 素 C的 種 屬 差 異 性 （ 以 人 為 標(biāo) 準(zhǔn) ）物 種 殘 基改 變數(shù) 物 種 殘 基改 變數(shù)黑 猩 猩 0 雞 、 火 雞 13牛 羊 豬 10 昆 蟲 20馬 12 酵 母 45 最 早 從 分 子 水 平 證明 的 先 天 性 遺 傳

41、 病 鐮 刀 形 紅 細(xì) 胞 貧 血 癥 。 高 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 的 關(guān) 系 蛋 白 質(zhì) 變 性 （ protein denaturation） 理 化 因 素 使 天 然 蛋 白 質(zhì) 失 去 原 有 的 理 化 性質(zhì) 和 生 物 學(xué) 活 性 。 蛋 白 質(zhì) 的 變 性 只 是 三 維構(gòu) 象 的 改 變 ， 不 涉 及 一 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 改 變 。 包括 可 逆 和 不 可 逆 變 性 。 變 性 蛋 白 的 特 征 ： 溶 解 度 降 低 黏 度 變 化 易 被 酶 水 解 凝 固 生 物 學(xué) 活 性 喪 失 牛 胰 RNase的 可 逆 變 性 血 紅 蛋 白 的 變 構(gòu) 與 輸

42、 氧 功 能變 構(gòu) 作 用 （ allosteric effect ） 是 指 對 于 多 亞基 的 蛋 白 質(zhì) 或 酶 ， 效 應(yīng) 劑 作 用 于 某 個(gè) 亞 基 ， 引 發(fā)其 構(gòu) 象 改 變 ， 繼 而 引 起 其 他 亞 基 構(gòu) 象 的 改 變 ， 導(dǎo)致 蛋 白 質(zhì) 或 酶 的 生 物 活 性 的 變 化 。 這 樣 的 效 應(yīng)劑 也 稱 變 構(gòu) 劑 。血 紅 蛋 白 中 的 4個(gè) 亞 基 與 氧 分 子 的 親 和 性 不 同 。氧 分 子 與 血 紅 蛋 白 的 一 個(gè) 亞 基 結(jié) 合 后 ， 引 起 其 構(gòu)象 發(fā) 生 改 變 ， 這 種 變 化 在 亞 基 之 間 傳 遞 ， 改

43、變 了其 他 亞 基 與 氧 的 結(jié) 合 能 力 。 氧 合 可 以 引 發(fā) 血 紅 蛋 白 4個(gè) 亞 基 的 8對 離子 鍵 相 繼 斷 開 ， 從 緊 湊 的 T構(gòu) 象 轉(zhuǎn) 變 為 松弛 的 R構(gòu) 象 蛋 白 質(zhì) 的 性 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 的 相 對 分 子 量 蛋 白 質(zhì) 的 顏 色 反 應(yīng) 蛋 白 質(zhì) 的 兩 性 解 離 和 等 電 點(diǎn) 蛋 白 質(zhì) 的 膠 體 性 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 的 相 對 分 子 量蛋 白 質(zhì) 相 對 分 子 量 在 10 000-1 000 000之 間 。測 定 分 子 量 的 主 要 方 法 有 滲 透 壓 法 、 超 離 心 法 、凝 膠 過 濾 法 、 聚

44、丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 等 。 最 準(zhǔn) 確 可靠 的 方 法 是 超 離 心 法 （ Svedberg于 1940年 ）蛋 白 質(zhì) 顆 粒 在 25-50X104 g離 心 力 作 用 下 從 溶 液中 沉 降 下 來 。沉 降 系 數(shù) （ s） ： 單 位 離 心 場 的 沉 降 速 度 。沉降系數(shù)單位常用S，1S=110-13（s） 蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）關(guān)系M = RTsD（1V）R 氣 體 常 數(shù) （ 8.314 107ergs mol -1 度 -1）T 絕 對 溫 度D 擴(kuò) 散 常 數(shù) （ 蛋 白 質(zhì) 分 子 量 很 大 ， 離 心 機(jī) 轉(zhuǎn) 速 很 快 ，則 忽

45、 略 不 計(jì) ）V 蛋 白 質(zhì) 的 微 分 比 容 （ m3 g-1） 溶 劑 密 度 （ 20 ， g ml -1） s 沉 降 系 數(shù) 反應(yīng)名稱試 劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個(gè)以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)及HNO3混合物紅色 Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色 Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)乙醛酸試劑及濃H 2SO4紫色 Trp坂口反應(yīng)-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基-氨基酸 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)OH N 蛋 白 質(zhì) 的 兩

46、性 解 離 和 等 電 點(diǎn)蛋 白 質(zhì) 能 發(fā) 生 兩 性 離 解 ， 有 等 電 點(diǎn) 。v在 電 場 中 ， 如 果 蛋 白 質(zhì) 分 子 所 帶 正 電荷 多 于 負(fù) 電 荷 ， 凈 電 荷 為 正 ， 則 向 負(fù)電 極 移 動(dòng) ， 反 之 ， 凈 電 荷 為 負(fù) ， 向 正極 移 動(dòng) ， 這 種 泳 動(dòng) 現(xiàn) 象 稱 電 泳 。v利 用 蛋 白 質(zhì) 在 等 電 點(diǎn) 可 以 將 蛋 白 質(zhì) 進(jìn)行 分 離 純 化 。 蛋 白 質(zhì) 的 兩 性 解 離 和 等 電 點(diǎn) 與氨 基 酸 的 兩 性 解 離 與 等 電 點(diǎn) 有何 異 同 ， 聯(lián) 系 ? 蛋 白 質(zhì) 的 膠 體 性 質(zhì)由 于 蛋 白 質(zhì) 的

47、分 子 量 很 大 ， 它 在 水 中能 夠 形 成 膠 體 溶 液 。 蛋 白 質(zhì) 溶 液 具 有 膠體 溶 液 的 典 型 性 質(zhì) ， 如 丁 達(dá) 爾 現(xiàn) 象 、 布郎 運(yùn) 動(dòng) 等 。由 于 膠 體 溶 液 中 的 蛋 白 質(zhì) 不 能 通 過 半 透膜 ， 因 此 可 以 應(yīng) 用 透 析 法 將 非 蛋 白 的 小分 子 雜 質(zhì) 除 去 蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀v蛋 白 質(zhì) 膠 體 溶 液 的 穩(wěn) 定 性 與 它 的 分 子 量 大 小 、所 帶 電 荷 和 水 化 作 用 有 關(guān) 。v改 變 溶 液 的 條 件 ， 將 影 響 蛋 白 質(zhì) 溶 解 性 質(zhì)v在 適 當(dāng) 的 條 件 下 ， 蛋

48、 白 質(zhì) 能 夠 從 溶 液 中 沉 淀 出來 。v蛋 白 質(zhì) 的 沉 淀 分 為 可 逆 沉 淀 和 不 可 逆 沉 淀 。 可逆 沉 淀 又 稱 為 非 變 性 沉 淀 。 如 等 電 點(diǎn) 沉 淀 法 、鹽 析 法 和 有 機(jī) 溶 劑 沉 淀 法 等 。 不 可 逆 沉 淀 又 稱為 變 性 沉 淀 。 如 加 熱 沉 淀 、 強(qiáng) 酸 堿 沉 淀 、 重 金屬 鹽 沉 淀 和 生 物 堿 沉 淀 等 。 蛋 白 質(zhì) 分 離 提 純 的 一 般 原 則蛋 一 般 程 序 分 前 處 理 、 粗 分 級(jí) 和 細(xì) 分 級(jí) 三 步 。第 一 步 是 前 處 理 (pretreatment)。 把

49、蛋 白 質(zhì) 從原 來 的 組 織 或 細(xì) 胞 中 以 溶 解 的 狀 態(tài) 釋 放 出 來 ，并 保 持 原 來 的 天 然 狀 態(tài) ， 生 物 活 性 。第 二 步 是 粗 分 級(jí) (roughfractionation)。 蛋 白質(zhì) 混 合 物 選 用 適 當(dāng) 方 法 ， 將 所 要 的 蛋 白 質(zhì) 與 其他 雜 蛋 白 質(zhì) 分 離 開 來 。 一 般 用 鹽 析 、 等 電 點(diǎn) 沉淀 和 有 機(jī) 溶 劑 分 級(jí) 分 離 等 。第 三 步 是 細(xì) 分 級(jí) (finefractionation)。 樣 品 經(jīng)粗 分 級(jí) 后 ， 使 用 層 析 法 ， 電 泳 法 等 進(jìn) 一 步 提 純 。 1

50、 前 處 理 選 擇 適 當(dāng) 的 生 物 材 料 ， 加 上 適 當(dāng) 的 抽 提試 劑 ， 如 0.1mol L NaCl溶 液 ，采 用 適 當(dāng) 的 細(xì) 胞 破 碎 方 法 ， 對 生 物 材 料進(jìn) 行 細(xì) 胞 破 碎 ， 使 蛋 白 質(zhì) 充 分 釋 放 到 溶 液中 離 心 ， 除 去 沉 淀 ， 得 到 上 清 液 。 沉 淀 分 離 采 用 適 當(dāng) 的 沉 淀 法 ， 從 抽 提 液 中 分 離目 的 蛋 白 。 硫 酸 銨 分 段 鹽 析 法 乙 醇 分 段 沉 淀 法 等 電 點(diǎn) 沉 淀 法 選 擇 性 變 性 法 原 理 有 什 么 不 同 ? 純 化 如 果 要 均 一 的 高

51、 純 度 蛋 白 質(zhì) 制 劑 ， 需 要 進(jìn) 一 步 提 純 。通 常 采 用 柱 層 析 法 。 如 ： 離 子 交 換 柱 層 析 ， 分 子 篩 層析 、 親 和 層 析 、 疏 水 吸 附 層 析 、 高 效 液 相 層 析 等 。通 常 采 用 制 備 性 電 泳 法 進(jìn) 一 步 提 純 ， 如 ： 制 備 性 聚 丙烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 、 蔗 糖 密 度 梯 度 等 電 聚 焦 電 泳 等 。 電 泳法 只 能 處 理 少 量 的 樣 品 ， 因 此 ， 在 提 純 后 期 使 用 比 較 合適 。 也 可 采 用 結(jié) 晶 法 對 目 的 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 一 步 提 純 。

52、 蛋 白 質(zhì)制 劑 必 須 達(dá) 到 較 高 的 純 度 (大 約 是 50 )， 才 能 進(jìn) 行 結(jié) 晶 。因 此 ， 結(jié) 晶 法 是 在 提 純 后 期 使 用 的 。在 提 純 過 程 中 ， 必 須 時(shí) 刻 注 意 防 止 蛋 白 質(zhì) 變 性 。 因 此 ，必 須 低 溫 操 作 ， 防 止 過 酸 過 堿 、 防 止 產(chǎn) 生 過 多 的 泡 沫 等 。 蛋 白 質(zhì) 混 合 物 的 分 離 方 法u1.根 據(jù) 分 子 大 小 不 同 的 分 離 方 法u2.利 用 溶 解 度 差 別 的 分 離 方 法u3.根 據(jù) 電 荷 不 同 的 分 離 方 法u4.蛋 白 質(zhì) 的 選 擇 吸 附

53、分 離u5.根 據(jù) 生 物 學(xué) 特 異 性 的 分 離 方 法 1.根 據(jù) 分 子 大 小 不 同 的 分 離 方 法透 析 （ dialysis） 和 超 濾 （ ultrafiltration） 利 用蛋 白 質(zhì) 分 子 不 能 通 過 半 透 膜 的 性 質(zhì) ， 使 蛋 白 質(zhì) 和其 他 小 分 子 物 質(zhì) 分 開 。密 度 梯 度 離 心 。 常 用 的 密 度 有 蔗 糖 梯 度 ， 聚 蔗糖 梯 度 和 其 他 合 成 材 料 的 密 度 梯 度凝 膠 過 濾 即 凝 膠 過 濾 層 析 (getfiltration chromatography)， 也 稱 分 子 排 阻 層 析

54、 (molecular exclusion chromatography)， 分 子 篩 層 析(molecular sieve chromatography)或 凝 膠 滲 透層 析 (gel permeation chromatography)。 這 是 根據(jù) 分 子 大 小 分 離 蛋 白 質(zhì) 混 合 物 最 有 效 的 方 法 之 。 凝 膠 過 濾 的 原 理 2.利 用 溶 解 度 差 別 的 分 離(1)等 電 點(diǎn) 沉 淀 (2)蛋 白 質(zhì) 的 鹽 溶 和 鹽 析 ：低 濃 度 時(shí) 鹽 溶 (salting in)；當(dāng) 溶 液 的 離 子 強(qiáng) 度 增 加 時(shí) ， 蛋 白 質(zhì) 的溶

55、 解 度 開 始 下 降 。 當(dāng) 離 子 強(qiáng) 度 足 夠 高 時(shí) ，蛋 白 質(zhì) 從 水 溶 液 中 沉 淀 出 來 ,這 種 現(xiàn) 象 稱為 鹽 析 salting out (3)有 機(jī) 溶 劑 分 級(jí) 法 ： 蛋 白 質(zhì) 的 選 擇 吸 附 分 離某 些 物 質(zhì) ， 例 如 極 性 的 硅 膠 和 氧 化 鋁 以 及 非極 性 的 活 性 炭 等 的 粉 末 具 有 吸 附 能 力 ， 能 夠?qū)?其 他 種 類 的 分 子 吸 附 在 其 粉 末 顆 粒 的 表 面 ，而 吸 附 力 的 強(qiáng) 弱 又 因 被 吸 附 的 物 質(zhì) 性 質(zhì) 不 同而 異 ， 吸 附 層 析 法(adsorption

56、chromatography)就 是 利 用 這 種吸 附 力 的 強(qiáng) 弱 不 同 而 達(dá) 到 分 離 的 目 的 。 離 子 交 換 層 析 根 據(jù) 電 荷 不 同 的 分 離 方 法(1)電 泳 ： 在 電 場 的 作 用 下 ， 帶 電 顆 粒 向著 與 其 電 性 相 反 的 電 極 移 動(dòng) ， 這 種 現(xiàn) 象 稱電 泳 （ electrophoresis） 或 離 子 泳 .泳 動(dòng) 速度 主 要 決 定 于 它 所 帶 的 凈 電 荷 量 以 及 顆 粒的 大 小 和 形 狀 。(2)離 子 交 換 層 析 ： 是 以 離 子 交 換 劑 作 支持 劑 的 層 析 法 。 由 于 不

57、 同 物 質(zhì) 與 交 換 劑 間的 靜 電 吸 引 不 同 ， 使 不 同 物 質(zhì) 依 次 被 洗 脫下 來 而 得 到 分 離 。 自由電泳 親 和 層 析 質(zhì) 量 鑒 定 鑒 定 蛋 白 質(zhì) 制 劑 純 度 的 方 法 很 多 ， 有 聚丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 法 、 等 電 聚 焦 電 泳 法 、超 離 心 沉 降 法 、 免 疫 電 泳 法 、 酶 活 力 法 等一 般 需 要 用 二 種 或 更 多 種 方 法 鑒 定 蛋 白質(zhì) 制 劑 的 純 度 。測 定 蛋 白 質(zhì) 的 生 理 活 性 ， 如 酶 的 比 活 力 ，多 肽 激 素 的 生 理 活 性 等 。 為 了 計(jì) 算 酶 的 比活 力 ， 還 必 須 測 定 蛋 白 質(zhì) 濃 度 。