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1、第 二 十 章重 組 DNA技 術(shù)recombinant DNA technique 第 一 節(jié) 重 組 DNA技 術(shù) 的 基 本 過(guò) 程Basic Process of Recombinant DNA Technology 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 2 是 在 體 外 將 不 同 來(lái) 源 的 或 插入 ， 構(gòu) 建 成 并 將 它 導(dǎo) 入 到合 適 的 ， 使 其 在 細(xì) 胞 中 擴(kuò) 增 和 繁 殖 ，； 再 進(jìn) 行 擴(kuò) 增 、。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 3 亦 稱 ， 或。 獲 取 這 類 同 一 的 DNA分 子 群 體 、 細(xì) 胞 群 體 或 個(gè) 體群 體

2、的 過(guò) 程 ， 即 無(wú) 性 繁 殖 。 又 稱 嵌 合 DNA（ chimera DNA） ， 采 用 克 隆 技 術(shù) 把來(lái) 自 不 同 生 物 的 外 源 DNA插 入 載 體 分 子 所 形 成 的 雜 合DNA分 子 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 4 指 從 同 一 始 祖 經(jīng) 無(wú) 性 繁 殖 傳 代 而 來(lái) 的 一 群 遺 傳上 同 一 的 DNA分 子 、 細(xì) 胞 或 個(gè) 體 ； 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 5 思 考 題 1 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 6 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 7 思 考 題 1 2021年 5月 4日 21

3、時(shí) 01分 8Common Enzymes Used in RecombinantDNA Technology 是 一 類 能 識(shí) 別 雙 鏈 DNA中 的 某 些， 并 由 此 切 割 DNA雙 鏈 的 核 酸 內(nèi) 切 酶 ， 又 稱 為主 要 是 從 原 核 生 物中 分 離 純 化 而 來(lái) 。與 共 同 構(gòu) 成 細(xì) 菌 的 ， 限制 外 源 DNA， 保 護(hù) 自 身 DNA。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 9 第 一 個(gè) 字 母 取 自 產(chǎn) 生 該 酶 的 細(xì) 菌 屬 名 ， 用 大 寫 斜 體 ；第 二 、 第 三 個(gè) 字 母 是 該 細(xì) 菌 的 種 名 ， 用 小 寫 斜

4、體 ；第 四 個(gè) 字 母 代 表 株 ；用 羅 馬 數(shù) 字 表 示 發(fā) 現(xiàn) 的 先 后 次 序 。Hind 屬 種 株 序 Haemophilus influenzae d株流 感 嗜 血 桿 菌 d株 的 第 三 種 酶2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 10 和 型 限 制 酶 通 常 是 相 對(duì)反 應(yīng) 過(guò) 程 中 需 有 Mg2+和 ATP參 與 。 、 和 型 （ 基 因 工 程 技 術(shù) 中 常 用 型 ） 。 型 限 制 酶 通 常 以 同 源 二 聚 體 形 式 存 在 ， 只 具有 核 酸 內(nèi) 切 酶 活 性 而 無(wú) 甲 基 化 酶 活 性 ， 反 應(yīng) 過(guò) 程 中只 需 有

5、Mg2+參 與 而 不 需 有 ATP參 與 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 11 類 酶 識(shí) 別 序 具 有 回 文 結(jié) 構(gòu) (palindrome)特 點(diǎn) ， 即 具 有 雙 重 旋 轉(zhuǎn) 對(duì) 稱 結(jié) 構(gòu) 的 DNA反 向 重 復(fù) 雙 鏈 序 列 。 型 大 部 分 型 限 制 酶 都 能 識(shí) 別 由 48個(gè) 核 苷 酸 組成 的 特 定 序 列 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 12 思 考 題 2 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 13圖 20-3 限 制 酶 EcoR 對(duì) 雙 鏈 DNA分 子 的 切 割 作 用 Bam H GGATCCCCTAGGGTCC

6、AG GACCTG平 端 切 口 GCCTAG GATCC G粘 端 切 口HindGTCGACCAGCTG平 或 鈍 末 端 （ blunt end) 粘 性 末 端 （ sticky end) 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 14 GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBam H GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC GBst 來(lái) 源 不 同 但 能 識(shí) 別 相 同 序 列 ， 切 割 DNA后 產(chǎn) 生相 同 的 黏 性 末 端 的 限 制 酶 ， 又 稱 同 功 異 源 酶 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 15 GGATCC CCTAGG

7、 AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G ATCTAG GATCT A 識(shí) 別 序 列 不 完 全 相 同 ， 但 切 割 DNA后 ， 產(chǎn) 生 相 同 的 黏性 末 端 的 限 制 酶 稱 為 同 尾 酶 。 這 兩 個(gè) 相 同 的 黏 性 末 端 稱 為配 伍 未 端 (compatible end)。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 16 識(shí) 別 DNA序 列 中 的 一 個(gè) 或 幾 個(gè) 堿 基 是 可 變 的 ， 并 且識(shí) 別 序 列 往 往 超 過(guò) 6個(gè) 核 苷 酸 。 為 型 限 制 酶 的 特 例 。 Bstp GGTNACC CCANTGG 2021年 5

8、月 4日 21時(shí) 01分 17 Bbl CGGN(N)4CCG; GCC(N)4NGGC 重 組 DNA技 術(shù) 、 基 因 組 DNA物 理 圖 譜 繪 制 、 基 因 組DNA同 源 性 研 究 、 切 割 基 因 組 DNA或 cDNA構(gòu) 建 基 因 組 文庫(kù) 或 cDNA文 庫(kù) 等 。 DNA純 度 、 結(jié) 構(gòu) 及 甲 基 度 程 度 ； 酶 切 反 應(yīng) 的 溫 度 、時(shí) 間 及 緩 沖 液 體 系 等 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 18 只 能 封 閉 DNA鏈 上 的 缺 口 （ nick） ,而 不 能 封 閉裂 口 （ gap） 。 需 要 在 一 條 DNA鏈 的

9、 3末 端 具 有 游 離 的 羥 基 、 另一 條 DNA鏈 的 5末 端 有 磷 酸 基 團(tuán) ， 而 且 反 應(yīng) 過(guò) 程 需 要由 ATP提 供 能 量 。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 19 連 接 的 底 物 可 以 是 兩 個(gè) 雙 鏈 DNA分 子 的 互 補(bǔ) 黏性 末 端 或 平 末 端 。 最 早 是 從 T4噬 菌 體 感 染 的 大 腸 埃希 菌 分 離 ， 易 制 備 ， 應(yīng) 用 廣 。 只 能 連 接 具 有 互 補(bǔ) 黏 性 末 端 的 兩 個(gè) 雙 鏈 DNA分子 底 物 。 需 要 NAD+作 為 輔 助 因 子 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 20

10、 *GAATTC*CTTAAG*5 353 EcoR I DNA連 接 酶*G*C T T A A 5 33 5OH P A A T T C* G*5 33 5 P OH+2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 21 *AGCT*TCGA*5 353 Alu I T4 DNA連 接 酶OH P5 33 5 *TC *AG 5 33 5 OHP CT*GA*+2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 22 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 23 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 24 能 夠 催 化 以 DNA或 RNA為 模 板 合 成 DNA的 反 應(yīng) ，把 脫 氧 核 糖 核 苷

11、 酸 連 續(xù) 地 添 加 到 雙 鏈 DNA分 子 或 引物 鏈 的 3-OH末 端 ， 催 化 核 苷 酸 的 聚 合 作 用 。 具 有 具 有 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 25 依 賴 RNA的 DNA聚 合 酶 。 具 有 活 性對(duì) Mg2+濃 度 非 常 敏 感 。 是 第 一 個(gè) 被 發(fā) 現(xiàn) 的 、 耐 熱 的 、 依 賴 DNA的 DNA聚合 酶 ， 普 遍 使 用 的 是 來(lái) 源 于 AMV(鳥 類 成 髓 細(xì) 胞 白 血病 病 毒 )及 M-MLV(莫 洛 尼 鼠 白 血 病 病 毒 )的 反 轉(zhuǎn) 錄酶 ， 具 有2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 26 （

12、terminal deoxynucleotidyl transferase） (1) 底 物 是 或 有 。5 3 OH Co2+dNTP nppi 5 3 (A/G/C/T)n2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 27 (2) 底 物 是 或 的 雙 鏈 DNA。Co2+dNTP nppi5 3OH 5 3 (A/G/C/T)nCo2+dNTP nppi5 3OH 5 3(A/G/C/T)n （ 1） 主 要 作 用 是 在 載 體 或 目 的 基 因 3 末 端 加 上同 源 多 聚 尾 巴 ， 形 成 人 工 黏 性 末 端 ， 便 于 DNA重 組 。 （ 2） DNA 3 末 端

13、的 同 位 素 標(biāo) 記 。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 28 （ alkaline phosphatase） 能 特 異 地 切 除 DNA、 RNA和 dNTP上 5 -磷 酸 基 團(tuán) 。 （ polynuleotide kinase） 又 稱 T4多 核 苷 酸 激 酶 ， 能 催 化 ATP的 -磷 酸 基團(tuán) 轉(zhuǎn) 移 到 DNA或 RNA片 段 的 5 -OH末 端 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 29 重 組 DNA技 術(shù) 中 常 用 的 工 具 酶 Common Vectors in Recombinant DNA Technology2021年 5月 4日 2

14、1時(shí) 01分 31 是 在 克 隆 載 體 的 基 礎(chǔ) 上 ， 增 添 了 與 宿 主 細(xì) 胞 相 適應(yīng) 的 強(qiáng) 啟 動(dòng) 子 ， 以 及 有 利 于 表 達(dá) 產(chǎn) 物 分 泌 、 分 離 或 純化 的 元 件 。復(fù) 制 起 始 點(diǎn) oriC，2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 32 復(fù) 制 起 始 點(diǎn) ， 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 33 最 常 用 的 目 的 基 因用 于 克 隆 大 片 段 DNA(自 習(xí) )用 于 Sanger雙 脫 氧 DNA測(cè) 序 (自習(xí) ) 構(gòu) 建 基 因 組 DNA或 cDNA文 庫(kù) (自 習(xí) )包 括 人 或 哺 乳 動(dòng) 物 病 毒 、 昆 蟲

15、及 植 物病 毒 用 于 在 真 核 細(xì) 胞 中 表 達(dá) 目 的 蛋 白 (自 習(xí) )用 于 更 大 DNA片 段 的 克 隆 (自 習(xí) ) 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 34 細(xì) 菌 培 養(yǎng)染 色 質(zhì) 質(zhì) 粒 嚴(yán) 緊 型 質(zhì) 粒 （ stringent plaxmid） 松 弛 型 質(zhì) 粒 （ relaxed plaxmid） AmprORI Tetr兩 個(gè) 抗 性 基 因 ， 用于 篩 選 陽(yáng) 性 克 隆 。兩 個(gè) 酶 切 位 點(diǎn) ， 用于 插 入 目 的 基 因復(fù) 制 起 始 點(diǎn) ， 保 證高 拷 貝 自 我 復(fù) 制 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 36 目 的 基

16、 因 與 pBR322經(jīng)BamH I酶 切 后 重 組 如 何篩 選 得 到 陽(yáng) 性 克 隆 ？ TetTet平 板1 2 3 45 6 7 89 10 11 121 2 3 45 6 7 89 10 11 12Amp2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 37 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 38Amp Tet DNA連 接 酶重 組 質(zhì) 粒 目 的 基 因Ampr TetrPst I 目 的 基 因 與 pBR322經(jīng)Pst I酶 切 后 進(jìn) 行 重 組 如 何篩 選 得 到 陽(yáng) 性 克 隆 ？ 課 堂 討 論2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 39用 Pst I酶 切 Ori

17、pUC192686 bpAmpr P(BLA) PlacAva I (413)BamHI (418)EcoRI (397)H indIII (448)Pst I (440)Sma I (415)Xma I (413)Apa LI (178)Apa LI (1121)Apa LI (2367) MCS提 供 多 個(gè) 單 酶切 位 點(diǎn) 用 于 克隆 操 作Lac Z藍(lán) 白 斑 篩 選 陽(yáng)性 克 隆2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 40 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 41 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 42 藍(lán) 色 菌 落 ： 陰 性 克 隆 ; 白 色 菌 落 ： 陽(yáng) 性

18、 克 隆 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 43思 考 題 3 1.能 在 體 外 轉(zhuǎn) 錄 克 隆 基 因 的 質(zhì) 粒 載 體 由 pUC系 列 質(zhì) 粒 載 體 派 生 而 來(lái) ， 帶 有 來(lái) 自 噬 菌 體T7、 SP6的 啟 動(dòng) 子 ， 為 RNA聚 合 酶 的 附 著 提 供 了 特 異性 識(shí) 別 位 點(diǎn) 。 如 pGEM-3Z/4Z.2.穿 梭 質(zhì) 粒 載 體 （ shuttle plasmid vector） 是 一 類 人 工 構(gòu) 建 的 ， 具 有 兩 種 不 同 復(fù) 制 起 始 點(diǎn)和 選 擇 標(biāo) 記 ， 可 在 兩 種 不 同 的 宿 主 細(xì) 胞 中 存 活 和 復(fù)制 的

19、 質(zhì) 粒 載 體 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 44 許 多 耐 熱 的 DNA聚 合 酶 (如 等 )擴(kuò) 增 時(shí) ，都 在 PCR產(chǎn) 物 3 -末 端 加 上 了 A堿 基 。3 35 PCR產(chǎn) 物A A5Taq酶T載 體 TT 553 3 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 45在 連 接 酶 的 作 用 下 可 直 接 將 PCR產(chǎn) 物 克 隆 到 TA載 體 中 。 （ 自 習(xí) ） 野 生 噬 菌 體 的 基 因 組 為 線 狀 雙 鏈 DNA， 兩 端為 12bp彼 此 完 全 互 補(bǔ) ， 稱 之 為 的； 進(jìn) 入 宿 主 細(xì) 胞 后 形 成 壞 狀 雙 鏈 結(jié) 構(gòu)

20、 ，按 方 式 及 滾 環(huán) 方 式 進(jìn) 行 復(fù) 制 。 感 染 細(xì) 菌 后 ， 可 進(jìn) 入 及 溶。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 46 可 容 納 7 kb以 下 的 外 源 片 段 。 在 阻 遏 劑 CI基 因 和 lacZ 基 因 上 ， 有 供 外 源基 因 片 段 插 入 的 單 一 內(nèi) 切 酶 位 點(diǎn) 。 可 容 納 923kb的 外 源 片 段 。 具 有 兩 個(gè) 或 兩 組 內(nèi)切 酶 位 點(diǎn) ， 經(jīng) 酶 切 除 去 基 因 組 中 噬 菌 體 正 常 生 長(zhǎng) 非必 需 的 序 列 ， 由 外 源 基 因 片 段 取 代 。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 47

21、 分 子 小 ， ； 含 質(zhì) 粒 自 主 復(fù) 制 成 分 ORI， 和 耐 藥 基 因 Ampr； 含 帶 有 一 個(gè) 或 多 個(gè) 單 一 酶 切 位 點(diǎn) 的 多 聚 物 接 頭 ； 含 噬 菌 體 cos黏 性 末 端 及 與 包 裝 有 關(guān) 的 短 序 列 ； 又 稱 柯 斯 質(zhì) 粒 (cos site-carrying plasmid, cosmid),是 由 噬 菌 體 的 cos黏 性 末端 和 細(xì) 菌 的 質(zhì) 粒 構(gòu) 建 而 成 。 接 上 在 真 核 細(xì) 胞 生 活 的 元 件 ， 如 SV40復(fù) 制 區(qū) 及 啟 動(dòng) 子 ，2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 50 2021年

22、 5月 4日 21時(shí) 01分 51 基 因 組 為 閉 環(huán) 單 鏈 DNA， 感 染 雄 性 大腸 埃 希 菌 后 ， 在 菌 體 內(nèi) 復(fù) 制 成 相 當(dāng) 于 質(zhì) 粒 的雙 鏈 DNA， 可 用 作 基 因 克 隆 載 體 。 M13mp系 列 (攜 帶 有 含 MCS序 列 的 lacZ 基 因 ),外 源 DNA不 宜 大 于 1500 bp。 是 一 類 從 pUC載 體 派 生而 來(lái) 的 噬 菌 粒 載 體 。 當(dāng) RF型 M13在 細(xì) 菌 內(nèi) 達(dá) 到 100200個(gè) 拷 貝 后 ， M13只 合 成 單 鏈 DNA， 并 包 裝 成 噬 菌 體 顆 粒 分 泌 到 細(xì) 胞 外 。可

23、用 于 DNA測(cè) 序 、 體 外 定 點(diǎn) 突 變 和 核 酸 雜 交 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 52 pBluescript SK（ +/ -） 噬 菌 粒 載 體 的 分 子 結(jié) 構(gòu) 示 意 圖 。 SK表 示 多 克 隆 位 點(diǎn)區(qū) 的 一 種 取 向 ， 即 lacZ基 因 是 按 照 SacIKpnI的 方 向 轉(zhuǎn) 錄 ； （ +/ -） 表 示 單鏈 噬 菌 體 f1復(fù) 制 起 點(diǎn) 的 兩 種 相 反 的 取 向 。 （ 自 習(xí) ） ， 簡(jiǎn) 稱 YAC載 體 ， 由 酵 母 染色 體 、 酵 母 2 mDNA質(zhì) 粒 的 復(fù) 制 起 始 序 列 等 元 件 衍 生而 成

24、 ； 可 插 入 100kb 2,000kb外 源 DNA片 段 ， 是 人 類基 因 組 計(jì) 劃 中 物 理 圖 譜 繪 制 采 用 的 主 要 載 體 。 ， 簡(jiǎn) 稱 BAC載 體 ， 以 細(xì) 菌 F因子 為 基 礎(chǔ) 構(gòu) 建 而 成 ； 可 插 入 100kb 300kb外 源 DNA片段 ， 是 人 類 基 因 組 計(jì) 劃 中 序 列 分 析 采 用 的 主 要 載 體 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 54 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 55 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 (retrovirus, RV )慢 病 毒 (lentivirus):也 屬 于 RV家 族腺 病 毒

25、 (adenovirus,Ad)腺 相 關(guān) 病 毒 (adeno-associated virus,AAV)單 純 皰 疹 病 毒 (herpes simplex virus,HSV) 埃 -巴 二 氏 病 毒 (Epstein-Barr virus,EBV)痘 苗 病 毒 (vaccinia virus)（ 自 習(xí) ） 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 56 第 四 節(jié)目 的 基 因 的 獲 得 和 體 外 重 組Target DNA Acquirement and Recombinant In Vitro 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 57 要 求 已 知 目 的 基 因

26、的 核 苷 酸 序 列 或 其 產(chǎn) 物 的氨 基 酸 序 列 。 要 求 已 知 目 的 基 因 的 全 序 列 或 基 因 片 段 兩 側(cè)的 DNA序 列 。 DNA文 庫(kù) (genomic DNA library) cDNA文 庫(kù) (cDNA library) 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 58 思 考 題 4 * 已 知 氨 基 酸 序 列 推 測(cè) 可 能 的 DNA序 列 。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 59* 避 免 使 用 稀 缺 密 碼 子 ， 及 宿 主 細(xì) 胞 的 密 碼 偏 好 。 反轉(zhuǎn)錄 AAnATTnT 55 mRNA反 轉(zhuǎn) 錄 酶mRNAcDNA3

27、 TTnTAAnA核 糖 核 酸 酶 HTTnT3 cDNA核 酸 酶 S1雙 鏈 cDNA 35 35 5 加 熱 變 性加 入 特 異 性 引 物DNA聚 合 酶重 復(fù) 上 述 步 驟擴(kuò) 增 出 大 量 的 產(chǎn) 物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 退 火延 伸 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 61 限 制 酶 切 位 點(diǎn) 限 制 酶 消 化 除 去 中 間 片 段cos L R coscos L左 臂 R cos右 臂 真 核 生 物 染色 體 DNA限 制 酶 部 分 消 化 外 源 DNA與 載 體 DNA混 合 連 接 反 應(yīng) 體 外 包 裝 用 重 組 噬 菌 體感 染 大 腸 桿 菌 20

28、 Kb DNA 片 段 cos L R cos20 Kb 外 源 DNA 片 段 gDNA文 庫(kù)2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 62 mRNA cDNA 雙 鏈 cDNA cDNA分 子 反 轉(zhuǎn) 錄 酶 載 體 受 體 菌 復(fù) 制2. cDNA文 庫(kù) 的 構(gòu) 建 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 63 限 制 酶 切 位 點(diǎn) 限 制 酶 消 化 cos L R coscos L左 臂 R cos右 臂 限 制 酶 部 分 消 化 外 源 DNA與 載 體 DNA混 合 連 接 反 應(yīng) 體 外 包 裝 用 重 組 噬 菌 體感 染 大 腸 桿 菌 7 Kb DNA 片 段 cos

29、L R cos7 Kb 外 源 cDNA 片 段 cDNA文 庫(kù) c DNA 片 段 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 64 gDNA文 庫(kù) ： g-文 庫(kù)cDNA文 庫(kù) ： c-文 庫(kù) 方 法 ： 用 目 的 基 因上 的 一 段 DNA做 成探 針 與 文 庫(kù) 中 的DNA作 核 酸 雜 交 ，從 基 因 文 庫(kù) 中“ 釣 出 ” 有 目 的基 因 的 克 隆 。3. 從 基 因 文 庫(kù) 中 篩 選 目 的 基 因2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 65 Screening a genomic library by colony hybridization. Bam H 切 割

30、反 應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連 接 酶 ， 15C目 的 基 因 用 Bam H 切 割 GCCTAGGCCTAG GATCCGGATCCG 載 體 DNA用Bam H 切 割GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG重 組 體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG目 的 基 因 自 連 載 體 自 連 GAATTCCTTAAG AGATCTTCTAGAEco R 切 割 位 點(diǎn) GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l 切 割 位 點(diǎn)AATTCG ATCTAG AATTCGGATCTA AAT

31、TCG ATCTAGEcoR + Bg l 雙 酶 切 Eco R + Bg l 雙 酶 切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連 接 酶 ， 15C重 組 體 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 68 目 的 基 因 載 體限 制 性 內(nèi) 切 酶 限 制 性 內(nèi) 切 酶T4 DNA連接 酶 ， 15C重 組 體 載 體 自 連 目 的 基 因 自 連2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 69 Eco R CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3- Eco R由 平 端 加上 新 的 酶 切 位點(diǎn) ， 再 用 限 制酶 切 除 產(chǎn) 生 粘性 末 端 ， 而 進(jìn)

32、行 粘 端 連 接 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 70 53 35 載 體 DNA53 35目 的 基 因 限 制 酶 或 機(jī) 械 剪 切 限 制 酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 35 T(T) nTA(A)nA A(A)nA T(T)nT重 組 體3 A(A)nA A(A)nA3552021年 5月 4日 21時(shí) 01分 71 PCR擴(kuò) 增 +3 35 PCR產(chǎn) 物A A5 T載 體 TT 553 3藍(lán) 白 篩 選Taq酶 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 72 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 73Inporting, Scree

33、ning and Verification of Recombinant DNA 處 于 感 受 態(tài) 對(duì) 載 體 無(wú) 嚴(yán) 格 限 制 限 制 酶 和 重 組 酶 缺 陷 不 對(duì) 外 源 DNA進(jìn) 行 修 飾 能 表 達(dá) 重 組 體 所 提 供 表 型 特 征 將 體 外 構(gòu) 建 的 重 組 DNA分 子 導(dǎo) 入 用 于 復(fù) 制 、擴(kuò) 增 和 表 達(dá) 的 原 核 或 真 核 受 體 細(xì) 胞 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 74 指 將 質(zhì) 粒 DNA或 以 質(zhì) 粒 為 載 體 構(gòu) 建 的 重 組 DNA導(dǎo) 入細(xì) 菌 （ 原 核 細(xì) 胞 ） 的 過(guò) 程 。 如 大 腸 桿 菌 K12突

34、 變 株 低滲 CaCl2,0 處 理 進(jìn) 入 感 受 態(tài) 。 指 將 噬 菌 體 、 病 毒 或 以 它 們 為 載 體 構(gòu) 建 的 重 組DNA 分 子 導(dǎo) 入 真 核 細(xì) 胞 的 過(guò) 程 。 指 以 人 工 改 造 的 噬 菌 體 或 病 毒 為 載 體 構(gòu) 建 的 重 組DNA， 經(jīng) 體 外 包 裝 成 具 有 感 染 性 的 噬 菌 體 或 病 毒 顆 粒后 ， 通 過(guò) 感 染 宿 主 細(xì) 胞 而 借 助 外 殼 蛋 白 將 重 組 DNA注入 到 細(xì) 菌 或 真 核 細(xì) 胞 內(nèi) 復(fù) 制 擴(kuò) 增 的 過(guò) 程 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 75 1.磷 酸 鈣 介 導(dǎo) 的

35、 轉(zhuǎn) 染2.DEAE-葡 聚 糖 介 導(dǎo) 的 轉(zhuǎn) 染 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 76 思 考 題 5 非 轉(zhuǎn) 化 子 (不 能 生 長(zhǎng) ）自 身 環(huán) 化 載 體未 酶 解 完 全 載 體非 目 的 基 因 插 入 載 體 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 77 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 78 A typical bacterial transformation experiment. 組 氨 酸 缺 陷 型大 腸 桿 菌無(wú) 組 氨 酸 的 培 養(yǎng) 基酵 母 咪 唑 甘 油 磷酸 脫 水 酶促 進(jìn) 組 氨 酸 合 成 DNA重 組 體 標(biāo)志補(bǔ)救2021年 5月

36、4日 21時(shí) 01分 81 是 從 基 因 文 庫(kù) 中 挑 選 含 有 目 的 基 因 的 陽(yáng) 性 克 隆的 常 用 方 法 。 根 據(jù) MCS兩 側(cè) 的 保 守 序 列 設(shè) 計(jì) 引 物 ， 對(duì) 提 取 的 重組 載 體 進(jìn) 行 PCR擴(kuò) 增 鑒 定 ， 并 可 直 接 進(jìn) 行 測(cè) 序 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 82 利 用 特 異 性 抗 體 與 目 的 基 因 表 達(dá) 的 蛋 白 質(zhì) 相 互結(jié) 合 通 過(guò) 放 射 免 疫 、 化 學(xué) 發(fā) 光 來(lái) 篩 選 轉(zhuǎn) 化 菌 。 用 插 入 點(diǎn) 的 限 制 酶 酶 切 重 組 DNA， 行 瓊 脂 糖 凝 膠電 泳 ， 根 據(jù) 是

37、不 有 目 的 基 因 和 載 體 的 泳 帶 來(lái) 判 斷 重組 成 功 與 否 。 質(zhì) 粒 噬 菌 體 病 毒 目 的 基 因 （ 外 源 基 因 ）gDNA文 庫(kù) cDNA 化 學(xué) 合 成 RT-PCR限 制 酶 消 化連 接 酶 轉(zhuǎn) 化 、 轉(zhuǎn) 染 、 感 染篩 選 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 83 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 84Exogenous Gene Expression 第 六 節(jié)外 源 基 因 的 表 達(dá) 包 括 ： 涉 及 目 的 基 因 的 克 隆 、 擴(kuò) 增 ， 轉(zhuǎn)錄 、 翻 譯 ， 蛋 白 質(zhì) 產(chǎn) 物 的 加 工 修 飾 ， 以 及 分 離

38、、 純化 等 過(guò) 程 ， 需 要 在 適 合 的 表 達(dá) 系 統(tǒng) 中 完 成 。 表 達(dá) 系 統(tǒng) 可 根 據(jù) 受 體 細(xì) 胞 的 不 同 分 為和 。2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 85思 考 題 6 表 達(dá) 載 體 的 構(gòu) 建 ； 受 體 細(xì) 胞 的 建 立 ； 表 達(dá) 產(chǎn) 物 的 分 離 、 純 化 等 技 術(shù) 和 策 略 。 產(chǎn) 品 功 能組 織 型 纖 溶 酶 原 激 活 物 抗 凝血 液 因 子 VIII 促 進(jìn) 凝 血顆 粒 細(xì) 胞 -巨 噬 細(xì) 胞 集 落 剌 激 因 子 剌 激 白 細(xì) 胞 生 成促 紅 細(xì) 胞 生 成 素 剌 激 紅 細(xì) 胞 生 成生 長(zhǎng) 因 子 (b

39、FGF, EGF) 刺 激 細(xì) 胞 生 長(zhǎng) 與 分 化生 長(zhǎng) 素 治 療 侏 儒 癥胰 島 素 治 療 糖 尿 病干 擾 素 ( 1b, 2a, 2b, ) 抗 病 毒 感 染 及 某 些 腫 瘤白 細(xì) 胞 介 素 激 活 、 剌 激 各 類 白 細(xì) 胞超 氧 化 物 歧 化 酶 抗 組 織 損 傷單 克 隆 抗 體 利 用 其 結(jié) 合 特 異 性 進(jìn) 行 診 斷 試 驗(yàn) 、 腫 瘤 導(dǎo) 向 治 療乙 肝 疫 苗 (CHO, 酵 母 ) 預(yù) 防 乙 肝口 服 重 組 B亞 單 位 菌 體 霍 亂 菌 苗 預(yù) 防 霍 亂 重 組 DNA醫(yī) 藥 產(chǎn) 品 優(yōu) 點(diǎn) : 2021年 5月 4日 21時(shí)

40、01分 87 培 養(yǎng) 簡(jiǎn) 單 、 迅 速 、 經(jīng) 濟(jì) 而 又 適 合 大 規(guī) 模 生 產(chǎn) 。 缺 點(diǎn) : 外 源 真 核 基 因 不 能 帶 有 5端 非 編 碼 區(qū) 和 內(nèi) 含 子 結(jié) 構(gòu) ， 必 須 用 cDNA或 化 學(xué) 合 成 基 因 ； 外 源 基 因 必 須 置 于 原 核 細(xì) 胞 的 強(qiáng) 啟 動(dòng) 子 和 SD序 列 等 元 件 控 制 下 ； 重 組 載 體 必 須 形 成 ； 外 源 基 因 轉(zhuǎn) 錄 生 成 的 mRNA必 須 相 對(duì) 穩(wěn) 定 并 能 被 有 效 翻 譯 ， 所 表 達(dá) 的 蛋 白 質(zhì) 產(chǎn) 物 穩(wěn) 定 且 對(duì) 宿 主 菌 不 能 有 毒 害 作 用 。 2021

41、年 5月 4日 21時(shí) 01分 88 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 89 外 源 目 的 基 因 不 與 其 他 基 因 融 合 ， 直 接 從 起 始 密 碼 AUG開 始 在 原 核 調(diào) 控 元 件 控 制 下 表 達(dá) 蛋 白 質(zhì) 。 蛋 白 質(zhì) 致 密地 集 聚 在 細(xì) 胞 內(nèi) 水 不 溶 性 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 90 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 91 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 92 大 多 是 穿 梭 載 體 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 93 病 毒 感 染 （ 天 然 方 法 ） 載 體 轉(zhuǎn) 染 （ 化 學(xué) 或 物

42、理 方 法 ） 新 霉 素 抗 性 選 擇 系 統(tǒng) 胸 苷 激 酶 基 因 HAT選 擇 系 統(tǒng) 二 氫 葉 酸 還 原 酶 基 因 選 擇 系 統(tǒng) 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 94 常 用 的 瞬 時(shí) 表 達(dá) 宿 主 是 來(lái) 源 于 非 洲 綠 猴 腎 CV-1細(xì) 胞 的 COS細(xì) 胞 。 常 用 的 穩(wěn) 定 表 達(dá) 宿 主 細(xì) 胞 是 來(lái) 源 于 中 國(guó) 倉(cāng) 鼠 卵巢 的 CHO細(xì) 胞 。 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 95 2021年 5月 4日 21時(shí) 01分 96 第 七 節(jié)重 組 DNA技 術(shù) 的 應(yīng) 用Application of recombinant D

43、NA technique 自 習(xí) 重 組 DNA技 術(shù) 的 主 要 應(yīng) 用 (1) 克 隆 目 的 基 因 ， 研 究 疾 病 相 關(guān) 基 因 的 結(jié) 構(gòu) 與功 能 ， 表 達(dá) 具 有 生 物 學(xué) 活 性 的 蛋 白 質(zhì) ； (2) 利 用 定 點(diǎn) 突 變 技 術(shù) ， 研 究 蛋 白 質(zhì) 的 結(jié) 構(gòu) 與 功能 ， 或 對(duì) 蛋 白 質(zhì) 進(jìn) 行 結(jié) 構(gòu) 改 造 ； (4) 開 發(fā) 基 因 工 程 藥 物 與 疫 苗 用 于 疾 病 治 療 ； (3) 利 用 轉(zhuǎn) 基 因 技 術(shù) 和 基 因 剔 除 技 術(shù) 研 究 基 因 功能 ， 建 立 轉(zhuǎn) 基 因 動(dòng) 物 模 型 ； (5) 建 立 基 因 診 斷 、 鑒 定 與 基 因 治 療 的 新 方 法 。 學(xué) 習(xí) 要 求 1.掌 握 重 組 DNA 技 術(shù) 的 相 關(guān) 概 念 、 基 本 原 理 和 主要 步 驟 。 (ppt3) 5.熟 悉 重 組 體 導(dǎo) 入 受 體 細(xì) 胞 及 篩 選 方 法 。 (ppt74) 2.掌 握 限 制 性 內(nèi) 切 酶 概 念 及 作 用 特 點(diǎn) 。 (ppt9) 3.熟 悉 常 用 載 體 及 特 點(diǎn) 。 (ppt35) 4.熟 悉 目 的 基 因 獲 取 及 與 載 體 連 接 的 方 法 。 (ppt57) 6.了 解 基 因 克 隆 表 達(dá) 技 術(shù) ，。 (ppt86)