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1、核 酸 和 蛋 白 質(zhì) 分 析 技 術(shù) 第 一 節(jié) 核 酸 分 析 技 術(shù)n 講 述 內(nèi) 容 ： 1、 核 酸 電 泳 2、 雜 交 技 術(shù) 3、 PCR技 術(shù) 4、 基 因 芯 片 一 、 核 酸 電 泳 n （ 一 ） DNA的 凝 膠 電 泳n 凝 膠 電 泳 是 分 子 克 隆 的 中 心 技 術(shù) 之 一 。 1. 瓊脂糖凝膠用于分離大于2001000bp的片段; 操作簡單、快速，且分離范圍廣，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝膠用于分離5500bp的片段; 效果好、分辨率極高，相差1bp的DNA片斷就能分開，能容納相對(duì)大量的DNA 用于核苷酸多態(tài)性的分析 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 的 基

2、 本 過 程n 材 料 ： 電 泳 緩 沖 液 （ 常 用 TAE或 TBE） 、 電 泳 級(jí) 瓊 脂 糖 、 溴 化 乙 錠 溶液 （ 核 酸 顯 示 劑 ） 、 加 樣 緩 沖 液 （ 保 證 核 酸 不 在 加 樣 孔 中 擴(kuò) 散 和 用 于 電 泳時(shí) 間 的 指 示 系 統(tǒng) ） 、 水 平 凝 膠 電 泳 裝 置 及 制 膠 系 統(tǒng) 、 直 流 電 源 系 統(tǒng) 。 n基本過程：制膠 放入電泳槽中并加入電泳緩沖液 取出梳子 將適量的核酸樣品和上樣緩沖液混合并上樣于加樣孔中 一定電壓條件下電泳 合適的時(shí)間后停止電泳 取出凝膠進(jìn)行溴化乙錠染色 凝膠成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并照相保存結(jié)果 n 注

3、意 ： 溴 化 乙 錠 具 有 致 癌 性 ， 操 作 時(shí) 要 帶 手 套 不 同 濃 度 瓊 脂 糖 的 凝 膠 分 離 范 圍瓊 脂 糖 濃 度 （ ， W/ V ) DNA分 子 的 有 效 分 離 范 圍 （ kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2 影響DNA在凝膠中遷移速率的因素： n 1 DNA分 子 的 大 小n 2 構(gòu) 象n 3 凝 膠 濃 度n 4 電 壓n 5 緩 沖 液 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 細(xì) 胞 凋 亡 過 程 中 DNA Ladder的 形 成 PCR產(chǎn) 物 的 瓊 脂 糖 電 泳 聚 丙 烯

4、 凝 膠 電 泳 的 銀 染 結(jié) 果 分 析 特 殊 的 凝 膠 電 泳n倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳（FIGE）：用于分離分子量102000kb的DNA分子；n鉗位均勻電場(chǎng)電泳（CHEF電泳）：可分離大于107bp的DNA分子 基本過程同DNA電泳一樣，但應(yīng)明確一點(diǎn)的是，因?yàn)镽NA分子對(duì)RNA酶的作用非常敏感，因此必須用對(duì)RNA酶有抑制作用DEPC水來配置所有溶液，所有與RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理以盡量減少RNA酶對(duì)樣品的降解；另外，因?yàn)镽NA分子有二、三級(jí)結(jié)構(gòu)可以影響其電泳結(jié)果，因此電泳時(shí)應(yīng)在變性劑存在下進(jìn)行，常用的變性劑為甲醛和戊二醛。 （ 二 ） RNA 電 泳 二 核 酸 雜 交 技 術(shù)

5、n （ 一 ） Southern Blotn 原 理 ：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。 Southern Blot 操 作 步 驟 ：DNA 瓊 脂 糖 電 泳 印 跡 轉(zhuǎn) 移 預(yù) 雜 交 雜 交

6、（ 變 性 探 針 ） 洗 膜 放 射 自 顯 影 或 顯 色 n原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。n用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 （ 二 ） Northern Blot 操 作 過 程 mRNA提 取 甲 醛 變 性 電 泳 印 跡 轉(zhuǎn) 移 預(yù) 雜 交 雜 交 （ 變 性 探 針 ） 洗 膜 放 射 自 顯 影 或 化 學(xué) 發(fā) 光 （ 三 ） 探 針 標(biāo) 記 技 術(shù)n 1 標(biāo) 記 物 ： 放 射 性 和 非 放 射 性 兩 種n 放 射 性 ： n 非 放 射 性

7、 ：生物素、地高辛素、熒光素 n 2、標(biāo)記方法 n （ 1）切口平移法 n （ 2） 隨 機(jī) 引 物 法n （ 3） 末 端 標(biāo) 記 法n （ 4） 單 鏈 DNA探 針 標(biāo) 記n （ 5）寡核苷酸探針標(biāo)記法 32P、35S和3H 三 PCR技 術(shù)n PCR (Polymerase chain reaction) 是用一對(duì)寡聚DNA作為引物，通過加溫變性退火DNA合成這一周期的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)2530個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106。 n Dr. Karry Mullis 1985年 發(fā) 明 ， 獲 1993年 度 諾 貝 爾 化 學(xué)獎(jiǎng) ；

8、目 的 : 用 于 擴(kuò) 增 位 于 兩 段 已 知 序 列 之 間 的 DNA區(qū) 段 。 （ 一 ） 原 理 ：雙 鏈 DNA通 過 高 溫 變 性 解 離 成 互 補(bǔ) 單 鏈 DNA 變 性 與 一 對(duì) 寡 核 苷 酸 引 物 （ 5， 3） 降 低 溫 度 退 火 DNA加 熱 變 性 +引 物 慢 慢 冷 卻 使 其 結(jié) 合 ， 形 象 地 稱 為 退 火 適 溫 延 伸 5/3引 物 形 成 新 鏈 變 成 4條 鏈 DNA 延 伸 第 二 輪 ： 變 性 退 火 延 伸 呈 指 數(shù) 增 長 理 論 值 ： 一 輪 一 倍 10輪 103=1000倍 20輪 106 30 輪 109

9、理 論 模 板 擴(kuò) 增 30輪 1ng-1g 實(shí) 際 模 板 擴(kuò) 增 30輪 1ng-10g n1 Taq DNA聚 合 酶 ：n 水 生 棲 熱 菌 (thermus aquaticus,Taq)的 DNA聚 合 酶n 53DNA聚 合 酶 活 性 ；n 無 35外 切 酶 活 性 ，n 35輪 0.25%錯(cuò) 配 ， 與 原 始 模 板 有 差 別 ；n 最 適 聚 合 酶 溫 度 72 ， 選 擇 72 延 伸n 半 衰 期 ： 92.5 130min n 95 40min n 97.5 56minn 變 性 溫 度 ： 95 使 其 在 整 個(gè) 擴(kuò) 增 循 環(huán) 中 保 持 足 夠 活 性

10、（ 二 ） 基 本 要 素 pfu DNA 聚 合 酶n 耐 熱n 53DNA聚 合 酶 活 性n 3 5外 切 酶 活 性n 精 確 度 ： pfu Taq 但 pfu擴(kuò) 增 效 率 通 常 比 Taq酶 略 差 n 文 獻(xiàn) 報(bào) 道 ： Taq+pfu 會(huì) 起 到 較 好 效 果n n 2 .引 物n 人 工 合 成 短 寡 核 苷 酸 20bp-25bp Tm=55 -60 ，n Tm值 要 相 近 ， 每 條 10-50pmol /100l n 設(shè) 計(jì) 原 則 ： （ 1） 靠 近 5上 游 Primer與 雙 鏈 DNA正 鏈 相 同n 3下 游 Primer與 雙 鏈 DNA正 鏈

11、互 補(bǔ) ， 與 負(fù) 鏈 相 同n 正 鏈 5 3 上 游 Primern 下 游 Primer 負(fù) 鏈 3 5 n 例 如 ：n IL-3正 鏈n 5GCTCCATGACCCAG- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3n 負(fù) 鏈 3CGCTAGAAAACTCAGGTT 5n 上 游 ： 與 其 相 同n 下 游 ： 先 寫 出 相 應(yīng) 負(fù) 鏈 3 5然 后 倒 過 來 5 3n 所 以 負(fù) 鏈 Primer： 5-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3 （ 2） Primer 本 身 不 要 出 現(xiàn) 內(nèi) 部 互 補(bǔ) 序 列 形 成 loop環(huán) ， 內(nèi) 部 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 如

12、： GGGTCGATTCCTACCCATGC（ 3） 注 意 減 少 Primer間 互 補(bǔ) 序 列 導(dǎo) 致 2個(gè) Primer形 成 dimer 一 般 不 要 超 過 3個(gè) 互 補(bǔ) bp 如 ： CCCATGC ATGGAGTC : : : : : : : : GGGTCTA TCAGTAAGC n n n 修 飾n 如 ： 32P、 生 物 素 、 熒 光 素 ， 不 影 響 其 效 果n 突 變 ：n AGCTCCATGACCCAG n 5CGCTCCATGACCCAG 3n 注 意 ： 絕 不 可 以 在 3端 進(jìn) 行 上 述 改 造n DNA聚 合 酶 是 5 3聚 合 ， 若 3

13、端 改 造 不 能 互 補(bǔ) 不 能 延 伸n （ 4） Primer 5未 端 可 修 飾 、 突 變 : n （ 5） primer 5 端 增 加 堿 基n n n 內(nèi) 切 酶 識(shí) 別 點(diǎn) ：n （ G） GAATTC GCTCCATGACCCAG n 保 護(hù) bpn 對(duì) PCR產(chǎn) 物 cloning有 很 大 好 處 n 便 于 內(nèi) 切 酶 消 化 ， 不 同 內(nèi) 切 酶 需 保 護(hù) bP數(shù) 量 不 同n EcoRI 1 BglII 2-3n XbaI 2-3 Hind 3n BamHI 2-3 PstI 4n XhoI 4 NotI 10n 如 果 所 用 保 護(hù) bp數(shù) 量 不 合

14、適 影 響 內(nèi) 切 酶 消 化 影 響 下 步 克 隆n 未 切 開 ， 連 接 不 上n ATG起 始 密 碼 TAA、 TAG、 TGA終 止 密 碼如 ：可 溶 性 受 體 的 表 達(dá) ， 無 膜 內(nèi) 區(qū) 、 穿 膜 區(qū) ， 只 有 膜 外區(qū) 。 3.模 板 ： 可 選 ： DNA mRNA 逆 轉(zhuǎn) 錄 cDNA DNA包 括 ： 質(zhì) 粒 噬 菌 體 染 色 體 DNA 較 小 較 大 目 的 gene是 單 拷 貝 變 性 較 易 變 性 較 難 非 常 大 ， 變 性 難 模 板 用 量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注 意 ： 防 止 交 叉 污

15、 染 4.dNTP：四 種 脫 氧 核 苷 酸 ， 基 本 原 料終 濃 度 ： 50M 注 意 ： 不 穩(wěn) 定 ， 保 存 時(shí) 間 長 會(huì) 失 效 5.Mg2+ TaqDNA聚 合 酶 作 用 時(shí) 需 要 Mg2+ 不 同 的 酶 需 不 同 Mg2+ Taq： 較 少 ， Mg2+ 對(duì) 反 應(yīng) 影 響 很 大 ， 0.5-1.5mM終 濃 度 pfu： Mg2+ 2-3mM， dNTP、 primer用 量 約 增 加 一 倍 外 界 影 響 ： EDTA鰲 合 Mg 2+ 選 較 低 濃 度 TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模 板 、 引 物 和 dNTP 的 磷 酸

16、 基 團(tuán) 均 可 與 Mg2+ 結(jié) 合 ， 降 低 Mg2+ 有 效 濃 度 。 如 果 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 或 效 率 不 理 想 ， 要 注 意 調(diào) 整 合 適 的 Mg2+濃 度 （ 1） 變 性 溫 度 ： 94-95 Templete： GC比 例 高 、 長 度 很 長 ， 則 變 性 T （ 2） 退 火 ： 溫 度 越 高 ， 擴(kuò) 增 特 異 性 越 好取 決 于 Tm值 ： Tm 退 火 T ； Tm 退 火 T若 Tm較 高 ， 可 使 退 火 和 延 伸 在 同 一 溫 度（ 3） 延 伸 ：500nt-1min 500nt 3min一 般 ： 40 60sec 6.溫 度

17、和 時(shí) 間 ： （ 三 ） PCR技 術(shù) 的 應(yīng) 用n 1. 基 因 檢 測(cè) ：n 2. 基 因 克 隆 化n 3. DNA突 變n 4. DNA序 列 分 析 四 、 基 因 芯 片n 利 用 核 酸 雜 交 的 原 理 ， 應(yīng) 用 于 DNA、 RNA的 研 究背 景 資 料 基 因 芯 片 （ ） 就 是 利 用 點(diǎn) 樣 機(jī) 等 機(jī) 械 裝 置 ， 在 玻 璃等 支 持 物 表 面 整 齊 地 點(diǎn) 上 高 密 度 的 、 成 千 上 萬 個(gè) “ 點(diǎn) ” ， 每 個(gè) “ 點(diǎn) ” 含 有可 與 一 種 基 因 雜 交 的 一 條 探 針 。 由 于 芯 片 上 有 序 地 排 列 著 探針

18、， 因 此 也 被 稱 為 微 陣 列 （ ） 。 在 芯 片 上 滴 加 樣 品后 ， 在 合 適 的 條 件 下 ， 樣 品 中 含 有 的 各 種 核 酸 片 段 （ 或 ）就 與 相 應(yīng) 的 探 針 雜 交 。 由 于 核 酸 片 段 上 已 標(biāo) 記 有 熒 光 素 ， 激 發(fā) 后 產(chǎn) 生 的 熒光 強(qiáng) 度 就 與 樣 品 中 所 含 有 的 相 應(yīng) 核 酸 片 段 的 量 成 正 比 ， 也 就 代 表 該 基 因 的表 達(dá) 量 。 經(jīng) 激 光 共 聚 焦 掃 描 儀 等 裝 置 掃 描 后 ， 所 獲 得 的 信 息 經(jīng) 專 用 軟 件 分 析 處 理 ， 即 可 獲 得 成 千

19、上 萬 種 基 因 的 表 達(dá) 情 況 。 正 因 為 這 種 特 點(diǎn) ， 基 因 芯片 技 術(shù) 已 成 為 當(dāng) 前 生 命 科 學(xué) 研 究 的 熱 點(diǎn) 之 一 。 操作流程 n（1）探針的設(shè)計(jì)、合成與芯片的制作（商品化產(chǎn)品）；n（2）靶基因樣品的制備；n 靶基因的制備：RT-PCR （設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）n 標(biāo)記方法：分別進(jìn)行熒光素標(biāo)記如：Cy3和Cy5n（3）生化雜交反應(yīng)；與常規(guī)的分子雜交過程基本相似n 封閉 預(yù)雜交 雜交 洗脫n（4）雜交信號(hào)的檢測(cè)與結(jié)果的分析 n 激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)收集熒光信號(hào)，計(jì)算機(jī)分析n 基 因 芯 片 的 應(yīng) 用n用于基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)、基因組分析和后基因組研究

20、 舉例：美國斯坦福大學(xué)Davis等用PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中得到了1046種cDNA片段，制成芯片，然后與熱處理的T淋巴細(xì)胞和未處理的T細(xì)胞種提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈cDNA片段雜交，經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)差異表達(dá)的基因，其中11個(gè)是被熱誘導(dǎo)的，6個(gè)是被熱抑制的。經(jīng)序列分析證實(shí)，其中3個(gè)是未報(bào)導(dǎo)的新基因。 第 二 節(jié) 蛋 白 質(zhì) 分 析 技 術(shù)n 講 述 內(nèi) 容 ：一、Western Blot 二、ELISA三、免疫熒光技術(shù)四、免疫組織化學(xué)技術(shù) 五、蛋 白 質(zhì) 與 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 的 研 究 技 術(shù) 一 Western Blotn 1 原 理 ：n

21、 將 通 過 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 分 離 的 蛋 白 質(zhì) 轉(zhuǎn) 移 到 硝 酸 纖維 素 或 PVDF膜 上 ， 然 后 與 能 特 異 性 識(shí) 別 待 檢 蛋 白 的 抗 體進(jìn) 行 反 應(yīng) ， 洗 滌 去 除 沒 有 結(jié) 合 的 特 異 性 抗 體 后 ， 加 入 標(biāo)記 的 、 能 識(shí) 別 特 異 性 抗 體 的 種 屬 特 異 性 抗 體 ， 反 應(yīng) 一 段時(shí) 間 后 再 次 洗 滌 去 除 非 特 異 性 結(jié) 合 的 標(biāo) 記 抗 體 ， 加 入 適合 標(biāo) 記 物 的 檢 測(cè) 試 劑 進(jìn) 行 顯 色 或 發(fā) 光 等 ， 觀 察 有 無 特 異性 蛋 白 條 帶 的 出 現(xiàn) ，

22、 也 可 通 過 條 帶 的 密 度 大 小 來 進(jìn) 行 特異 性 蛋 白 的 半 定 量 。 2 操 作 過 程n SDS-PAGE電 泳 轉(zhuǎn) 膜 （ PVDF或 硝 酸 纖 維 素 膜 ）n 封 閉 一 抗 洗 滌 酶 標(biāo) 二 抗 反 應(yīng)n 洗 滌 顯 色 或 化 學(xué) 發(fā) 光 顯 影 H ours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, c

23、ells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control 0h 4h 8h 16h Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cel

24、ls were treated with 10M gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDS-PAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-CX-Protein 3 注 意 的 問 題n （ 1） 蛋 白 質(zhì) 電 泳n 常 用 SDS-PAGE： 單 一 亞 基 組 成 的 蛋 白 質(zhì)n 非 變 性 PAGE： 多 個(gè) 不 同 亞 基 組 成 的 蛋 白 質(zhì)n Tris-Tric

25、ine膠 中 電 泳 ： 用 于 分 子 量 小 于 10kDa的 多 肽 和蛋 白 的 電 泳 ， 能 夠 獲 得 較 好 的 分 離 效 果 。聚 丙 烯 酰 胺 具 有 神 經(jīng) 毒 性 ， 操 作 時(shí) 要 戴 手 套 （ 2） 轉(zhuǎn) 膜n 戴 手 套 ， 避 免 用 手 接 觸 濾 紙 、 凝 膠 和 膜 ， 因 為 手 上 的 油 脂 會(huì)阻 斷 轉(zhuǎn) 印 。 濾 紙 和 膜 的 尺 寸 與 凝 膠 大 小 一 致n 以 適 量 的 轉(zhuǎn) 移 Buffer室 溫 平 衡 濾 紙 、 凝 膠 和 膜 15 30min，如 果 是 PVDF膜 ， 必 須 先 用 甲 醇 激 活 后 浸 泡 。n

26、方 向 正 確 ： 凝 膠 在 陰 極 ， 膜 在 陽 極n 排 去 濾 紙 、 膠 和 膜 間 的 氣 泡 。n 電 轉(zhuǎn) 時(shí) 間 ： 100V 1-2h,可 根 據(jù) 蛋 白 分 子 量 的 大 小 靈 活 選 擇 n 轉(zhuǎn) 移 結(jié) 束 后 ， 凝 膠 用 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 以 確 定 轉(zhuǎn) 移 效 率n 膜 用 麗 春 紅 染 色 觀 察 蛋 白 分 子 量 標(biāo) 準(zhǔn) 的 位 置 （ 3） 封 閉n 用 5 脫 脂 奶 粉 或 3 BSAn （ 含 0.1 Tween20 TBS或 PBS配 制 ）n 時(shí) 間 ： 室 溫 2h或 4C過 夜 （ 4） 顯 色 或 顯 影n 顯 色n 辣

27、根 過 氧 化 物 酶 ： 底 物 為 DABn 堿 性 磷 酸 酶 ： 底 物 為 BCIP/NBTn 化 學(xué) 發(fā) 光 顯 影n 最 常 用 。 辣 根 過 氧 化 物 酶 和 堿 性 磷 酸 酶 有 不 同 的 發(fā) 光 底 物 （ 商 品化 產(chǎn) 品 ） n 注 意 ： 化 學(xué) 發(fā) 光 前 將 膜 用 不 含 Tween20的 TBS或 PBS洗 滌 一 次n 曝 光 的 時(shí) 間 和 顯 影 的 時(shí) 間 根 據(jù) 實(shí) 際 情 況 而 定 （ 5） 膜 的 再 利 用n 化 學(xué) 發(fā) 光 后 的 硝 酸 纖 維 素 膜 用 Stripping Buffer洗 滌 后（ 洗 滌 Buffer: 62

28、.5mm pH6.7 的 Tris-HCI含 2 SDS和100mm的 2ME ） 用 不 同 的 一 抗 進(jìn) 行 雜 交 ， 檢 測(cè)其 它 蛋 白 的 表 達(dá) 情 況 。 一 張 膜 可 以 重 復(fù) 使 用 3 4次 。 n 堿 性 磷 酸 酶 顯 色 的 膜 不 能 再 進(jìn) 行 雜 交 n 1 原 理 ：n ELISA的 基 礎(chǔ) 是 抗 原 或 抗 體 的 固 相 化 及 抗 原 或 抗 體 的 酶 標(biāo) 記 。 結(jié)合 在 固 相 載 體 表 面 的 抗 原 或 抗 體 仍 保 持 其 免 疫 學(xué) 活 性 ， 酶 標(biāo) 記 的抗 原 或 抗 體 既 保 留 其 免 疫 學(xué) 活 性 ， 又 保

29、留 酶 的 活 性 。 在 測(cè) 定 時(shí) ，受 檢 標(biāo) 本 與 固 相 載 體 表 面 的 抗 原 或 抗 體 起 反 應(yīng) 。 再 加 入 酶 標(biāo) 記 的抗 原 或 抗 體 ， 也 通 過 反 應(yīng) 而 結(jié) 合 在 固 相 載 體 上 。 此 時(shí) 固 相 上 的 酶量 與 標(biāo) 本 中 受 檢 物 質(zhì) 的 量 呈 一 定 的 比 例 。 加 入 酶 反 應(yīng) 的 底 物 后 ，底 物 被 酶 催 化 成 為 有 色 產(chǎn) 物 ， 產(chǎn) 物 的 量 與 標(biāo) 本 中 受 檢 物 質(zhì) 的 量 直接 相 關(guān) ， 故 可 根 據(jù) 呈 色 的 深 淺 進(jìn) 行 定 性 或 定 量 分 析 。 測(cè) 定 方 法 具有 很

30、高 的 敏 感 度 （ pg-ng/ml水 平 ） ， 并 且 重 復(fù) 性 好 。 二 、 ELISA ELISA 常 用 的 酶 和 底 物n 辣 根 過 氧 化 物 酶 ， 底 物 為 OPD, 深 桔 黃 色 ， 檢 測(cè) 波 長 492nmn TMB， 藍(lán) 綠 色 ， 檢 測(cè) 波 長 450nm 堿 性 磷 酸 酶 ， 底 物 為 PNPP（ 對(duì) 消 基 苯 磷 酸 酯 ） , 黃 色 檢 測(cè) 波 長 405nm ELISA各 步 驟 的 反 應(yīng) 時(shí) 間 包 被 ： 24 36h， 蛋 白 濃 度 為 1 5ug/ml 封 閉 ： 37C 2h 或 4C過 夜 （ 3 BSA） 樣 本

31、反 應(yīng) 時(shí) 間 ： 37C 45min-1h 酶 標(biāo) 抗 體 反 應(yīng) 時(shí) 間 ： 37C 45min-1h 顯 色 時(shí) 間 ： 15min(避 光 ） 設(shè) 對(duì) 照 可 以 一 次 包 被 多 塊 板 ， 凍 存 備 用 2 類 型（ 1） 間 接 法 測(cè) 抗 體間 接 法 是 檢 測(cè) 抗 體 常 用 的 方 法 。 其 原 理 為 利 用 酶 標(biāo) 記 的 抗抗 體 ， 檢 測(cè) 與 固 相 抗 原 結(jié) 合 的 受 檢 抗 體 ， 故 稱 為 間 接 法 。常 用 于 臨 床 血 清 中 自 身 抗 體 的 檢 測(cè) ， 以 及 雜 交 瘤 上 清 特 異 性抗 體 的 篩 選 。 如 血 清 中

32、PDCD5自 身 抗 體 的 檢 測(cè) 。方 法 ： 抗 原 包 被 封 閉 待 檢 抗 體 洗 滌 酶 標(biāo) 二 抗 洗 滌 顯 色 反 應(yīng) 終 止 反 應(yīng) ELISA Reader檢 測(cè) OD值 (2) 雙 抗 體 夾 心 法 測(cè) 抗 原n 是 檢 測(cè) 抗 原 最 常 用 的 方 法 。 只 要 獲 得 針 對(duì) 受 檢 抗 原 的 特 異 性 抗 體 ， 就 可 用 于 包 被固 相 載 體 和 制 備 酶 結(jié) 合 物 。 常 用 的 組 合 ： 單 克 隆 抗 體 多 克 隆 抗 體 單 克 隆 抗 體 單 克 隆 抗 體 后 一 組 合 是 兩 種 單 克 隆 抗 體 針 對(duì) 抗 原 上

33、不 同 的 相 距 較遠(yuǎn) 的 兩 個(gè) 抗 原 決 定 簇 ， 分 別 用 于 包 被 固 相 載 體 和 制 備酶 結(jié) 合 物 。 用 途 ： 測(cè) 定 二 價(jià) 或 二 價(jià) 以 上 的 大 分 子 抗 原 ， 但 不 適 用 于 測(cè) 定 半 抗 原 及 小 分 子 單 價(jià) 抗 原 ， 因 其 不 能 形 成 兩 位 點(diǎn) 夾 心 。 例 如 各 種 細(xì) 胞 因 子 的 檢 測(cè) 。 n 雙 抗 體 夾 心 法 測(cè) 抗 原 的 方 法 ： 捕 獲 抗 體 包 被 封 閉 （ 3 BSA） 待 測(cè) 抗 原 洗 滌 （ 含 0.1 Tween的 PBS) 酶 標(biāo) 單 抗 或 多 抗 洗 滌 顯 色 檢 測(cè)

34、 (3)競 爭 法 測(cè) 抗 原n 1） 抗 體 固 相 測(cè) 抗 原 小 分 子 抗 原 或 半 抗 原 因 缺 乏 可 作 夾 心 法的 兩 個(gè) 以 上 的 位 點(diǎn) ， 因 此 不 能 用 雙 抗 體 夾 心 法 進(jìn) 行 測(cè) 定 ， 可 以 采用 競 爭 法 模 式 。n 其 原 理 是 標(biāo) 本 中 的 抗 原 和 一 定 量 的 酶 標(biāo) 抗 原 競 爭 與 固 相 抗 體 結(jié) 合 。標(biāo) 本 中 抗 原 量 含 量 愈 多 ， 結(jié) 合 在 固 相 上 的 酶 標(biāo) 抗 原 愈 少 ， 最 后 的顯 色 也 愈 淺 。 n 方 法 ： 抗 體 包 被 封 閉 同 時(shí) 加 入 待 測(cè) 抗 原 和 酶

35、 標(biāo) 抗 原n 洗 滌 酶 底 物 顯 色 ELISA reader檢 測(cè) n 2） 抗 原 固 相 測(cè) 抗 原其 原 理 是 標(biāo) 本 中 的 抗 原 和 固 相 抗 原 與 一 定 量 的 抗 體 競 爭 結(jié) 合 。標(biāo) 本 中 抗 原 含 量 愈 多 ， 結(jié) 合 在 固 相 上 的 抗 體 愈 少 ， 最 后 的 顯色 也 愈 淺 。方 法 : a: 抗 原 包 被 96孔 板 ； b:封 閉 ; c: 待 測(cè) 抗 原 與 抗 體 反 應(yīng) 一 定 時(shí) 間 ； d: 加 入 96孔 板 e: 洗 滌 f： 加 入 酶 標(biāo) 二 抗 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測(cè)如 臨 床 血 清 樣 本

36、 的 檢 測(cè) 以 及 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 上 清 的 檢 測(cè) （ 4） IgM抗 體 的 檢 測(cè)1） 間 接 法 ： 間 接 法 ELISA一 般 僅 適 用 于 檢 測(cè) 總 抗 體 或 IgG抗 體 。 如 用 抗 原包 被 的 間 接 法 直 接 測(cè) 定 血 清 中 的 IgM抗 體 ， 因 標(biāo) 本 中 一 般 同 時(shí) 存在 較 高 濃 度 的 IgG抗 體 ， 后 者 將 競 爭 結(jié) 合 固 相 抗 原 而 使 一 部 分 IgM抗 體 不 能 結(jié) 合 到 固 相 上 ， 將 出 現(xiàn) 假 陰 性 結(jié) 果 。 因 此 ， 如 果 用 抗IgM作 為 二 抗 ， 間 接 測(cè) 定 IgM抗 體 ，

37、 必 須 先 將 標(biāo) 本 用 A蛋 白 或 抗IgG抗 體 處 理 ， 以 除 去 IgG的 干 擾 。方 法 a: 抗 原 包 被 96孔 酶 標(biāo) 板 ； b:封 閉 ; c: 待 測(cè) 血 清 與 A蛋 白 反 應(yīng) 一 定 時(shí) 間 后 離 心 d: 吸 取 上 清 液 加 入 96孔 酶 標(biāo) 板 e: 洗 滌 f： 加 入 酶 標(biāo) 抗 IgM的 抗 體 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測(cè) 2） 捕 獲 包 被 法 （ 夾 心 法 ）先 用 抗 人 IgM抗 體 包 被 ELISA板 ， 以 捕 獲 血 清 標(biāo) 本 中 的 IgM（ 包 括 針對(duì) 抗 原 特 異 性 的 IgM和 非 特

38、異 性 的 IgM)。 然 后 加 入 相 應(yīng) 抗 原 ， 繼 而加 入 針 對(duì) 抗 原 特 異 的 酶 標(biāo) 抗 體 ， 再 與 底 物 作 用 ， 顏 色 的 深 淺 即 與 標(biāo)本 中 的 IgM含 量 成 正 相 關(guān) 。方 法 ： a: 抗 人 IgM抗 體 包 被 96孔 酶 標(biāo) 板 ； b:封 閉 ; c: 加 入 待 測(cè) 血 清 ； d: 洗 滌 96孔 酶 標(biāo) 板 e: 加 入 相 應(yīng) 抗 原 f： 加 入 抗 原 特 異 的 酶 標(biāo) 抗 體 g： 洗 滌 h： 顯 色 和 檢 測(cè) （ 5） ABS-ELISA技 術(shù) （ Avidin Biotin system-ELISA原 理親

39、 和 素 是 一 種 分 子 量 是 60， 000的 堿 性 蛋 白 ， 由 四 個(gè) 相 同 亞 基 組 成 ，每 個(gè) 亞 基 有 一 個(gè) 生 物 素 分 子 結(jié) 合 點(diǎn) 。 兩 者 均 可 與 抗 體 等 大 分 子 生 物 活性 物 質(zhì) 相 偶 聯(lián) ， 又 可 被 酶 類 等 多 種 材 料 所 標(biāo) 記 ， 成 為 一 種 生 物 反 應(yīng) 放大 系 統(tǒng) 。 生 物 素 化 抗 體 可 捕 獲 多 個(gè) 親 和 素 ， 后 者 再 與 酶 結(jié) 合 ， 加 入 底物 后 ， 產(chǎn) 生 顏 色 反 應(yīng) 。 這 一 系 統(tǒng) 可 以 大 大 提 高 ELISA的 靈 敏 度 。操 作 過 程 ：抗 原

40、 包 被 封 閉 待 檢 標(biāo) 本 生 物 素 化 抗 體 洗 滌 酶 標(biāo) 記 親 和 素 洗 滌 加 底 物 顯 色 和 檢測(cè) 三 免 疫 熒 光 技 術(shù) n 利 用 某 些 熒 光 素 ， 如 FITC、 R-PE等 通 過化 學(xué) 反 應(yīng) 與 抗 體 或 其 它 蛋 白 結(jié) 合 制 備 成熒 光 探 針 ， 然 后 與 被 測(cè) 抗 原 或 配 體 發(fā) 生特 異 性 結(jié) 合 ， 形 成 的 熒 光 復(fù) 合 物 在 一 定波 長 光 的 激 發(fā) 下 可 產(chǎn) 生 熒 光 ， 因 此 利 用熒 光 顯 微 鏡 或 流 式 細(xì) 胞 儀 可 檢 測(cè) 未 知 抗原 或 相 應(yīng) 配 體 。 （ 一 ） 細(xì)

41、胞 膜 蛋 白 分 子 的 檢 測(cè)n 原 理 ：n 細(xì) 胞 膜 表 面 的 抗 原 或 受 體 可 特 異 地 與 相 應(yīng) 的 抗體 或 配 體 結(jié) 合 ， 將 針 對(duì) 細(xì) 胞 表 面 抗 原 的 抗 體 或配 體 用 不 同 的 熒 光 素 標(biāo) 記 ， 根 據(jù) 不 同 熒 光 物 質(zhì)的 最 大 激 發(fā) 和 發(fā) 射 波 長 的 不 同 ， 即 可 準(zhǔn) 確 定 量每 種 熒 光 物 質(zhì) 的 強(qiáng) 度 ， 從 而 推 出 相 應(yīng) 細(xì) 胞 表 面抗 原 表 達(dá) 量 n 1 直 接 法 ： 細(xì) 胞 熒 光 素 標(biāo) 記 的 抗 CD分 子 的 抗 體 4C反 應(yīng) 30-60min 熒 光 顯 微 鏡 觀

42、察 或 流 式 細(xì) 胞 計(jì) 分 析 。n 2 間 接 法 ： 細(xì) 胞 抗 CD分 子 的 抗 體 4C 反 應(yīng) 30-60min 熒 光 素 標(biāo) 記 的 二 抗 4C 反 應(yīng) 30-60min 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細(xì)胞 計(jì) 分 析懸 浮 細(xì) 胞 ： 用 PBS洗 二 次 后 再 做 染 色貼 壁 細(xì) 胞 ： 先 用 胰 酶 消 化 成 懸 浮 細(xì) 胞 再 染 色1 細(xì) 胞 膜 CD分 子 的 檢 測(cè) 2 Annexin V檢 測(cè) 技 術(shù) (檢 測(cè) 細(xì) 胞 凋 亡 的 一 個(gè) 常 規(guī) 指 標(biāo) )n 磷 脂 酰 絲 氨 酸 （ Phosphatidylserine, PS） 正

43、 常 位 于 細(xì) 胞 膜的 內(nèi) 側(cè) ， 但 在 細(xì) 胞 凋 亡 的 早 期 ， PS可 從 細(xì) 胞 膜 的 內(nèi) 側(cè) 翻 轉(zhuǎn)到 細(xì) 胞 膜 的 表 面 ， 暴 露 在 細(xì) 胞 外 環(huán) 境 中 。 Annexin-V是 一種 分 子 量 為 3536KD的 Ca2+依 賴 性 磷 脂 結(jié) 合 蛋 白 ， 能 與PS高 親 和 力 特 異 性 結(jié) 合 。 將 Annexin-V進(jìn) 行 熒 光 素 （ FITC、PE） 或 biotin標(biāo) 記 ， 以 標(biāo) 記 了 的 Annexin-V作 為 熒 光 探 針 ，利 用 流 式 細(xì) 胞 儀 或 熒 光 顯 微 鏡 可 檢 測(cè) 細(xì) 胞 凋 亡 的 發(fā) 生

44、。 原 理 樣 本 處 理 和 染 色 方 法 1 懸 浮 細(xì) 胞 的 染 色 ： 將 正 常 培 養(yǎng) 和 誘 導(dǎo) 凋 亡 的 懸 浮 細(xì) 胞（ 0.51 106） 用 PBS洗 2次 ， 加 入 100ul Binding Buffer和 FITC標(biāo) 記 的 Annexin-V（ 20ug/ml） 10ul， 室 溫 避 光 30min， 再 加 入PI（ 50ug/ml） 5ul， 避 光 反 應(yīng) 5min后 ， 加 入 400ul Binding Buffer， 立 即 用 FACScan進(jìn) 行 流 式 細(xì) 胞 術(shù) 定 量 檢 測(cè) （ 一 般 不 超過 1h） ， 同 時(shí) 以 不 加 A

45、nnexinV-FITC及 PI的 一 管 作 為 陰 性 對(duì) 照 。 2 貼 壁 培 養(yǎng) 的 細(xì) 胞 染 色 ： 先 用 0.25%的 胰 酶 消 化 ， 洗 滌 、染 色 和 分 析 同 懸 浮 細(xì) 胞 。 3 爬 片 細(xì) 胞 染 色 ： 同 上 ， 最 后 用 熒 光 顯 微 鏡 和 共 聚 焦 激 光掃 描 顯 微 鏡 進(jìn) 行 觀 察 。 （ 二 ） 細(xì) 胞 內(nèi) 蛋 白 分 子 的 檢 測(cè)細(xì) 胞 內(nèi) 細(xì) 胞 因 子 的 檢 測(cè) 、 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 TFAR19的 檢 測(cè) 等 。操 作 過 程 ：（ 1） 直 接 法 ： 細(xì) 胞 3 多 聚 甲 醛 固 定 和 滲 透 化 封 閉

46、 熒 光 素 標(biāo) 記 的 抗 體 洗 滌 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細(xì) 胞 計(jì) 分 析 （ 2） 間 接 法 ： 細(xì) 胞 3 多 聚 甲 醛 固 定 和 滲 透 化 封 閉 針 對(duì) 蛋 白 的 特 異 抗 體 洗 滌 熒 光 素 標(biāo) 記 的 二 抗 洗 滌 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 或 流 式 細(xì) 胞 計(jì) 分 析 凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 TFAR19蛋 白 的 表 達(dá) 和 細(xì) 胞 定位 分 析 n TFAR19（ PDCD5） 是 由 本 研 究 室 在 國 際 上 首 先 報(bào) 導(dǎo) 的 一 個(gè) 擁 有 自己 知 識(shí) 產(chǎn) 權(quán) 的 人 類 新 基 因 ， 前 期 的 功 能 研 究

47、 表 明 ， 它 是 促 進(jìn) 細(xì) 胞 凋亡 的 增 強(qiáng) 劑 。 利 用 熒 光 素 （ FITC） 標(biāo) 記 的 TFAR19單 克 隆 抗 體 為 探針 ， 對(duì) 細(xì) 胞 凋 亡 過 程 中 TFAR19蛋 白 的 表 達(dá) 水 平 及 定 位 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 凋亡 早 期 TFAR19表 達(dá) 水 平 增 高 并 出 現(xiàn) 快 速 核 轉(zhuǎn) 位 現(xiàn) 象 。 同 時(shí) 我 們 發(fā) 現(xiàn) ，凋 亡 早 期 TFAR19蛋 白 的 核 轉(zhuǎn) 位 早 于 磷 脂 酰 絲 氨 酸 （ PS） 外 翻 和 細(xì)胞 核 DNA的 片 段 化 ， 提 示 TFAR19蛋 白 的 核 轉(zhuǎn) 位 是 細(xì) 胞 凋 亡 更 早 期

48、 發(fā)生 的 事 件 之 一 。 進(jìn) 一 步 的 研 究 證 明 ， 凋 亡 早 期 TFAR19的 核 轉(zhuǎn) 位 具 有普 遍 意 義 ， 不 同 細(xì) 胞 凋 亡 早 期 均 出 現(xiàn) TFAR19高 表 達(dá) 和 核 轉(zhuǎn) 位 。 這 為研 究 細(xì) 胞 凋 亡 早 期 所 發(fā) 生 的 事 件 ， 提 供 了 一 種 新 的 技 術(shù) 和 指 標(biāo) 。 n 1 懸 浮 細(xì) 胞 的 染 色 ： （ 1） 收 獲 正 常 和 誘 導(dǎo) 凋 亡 的 細(xì) 胞 （ 0.51 106） ， PBS洗 2次 ， （ 2） 3%多 聚 甲 醛 冰 浴 10min， PBS洗 2次 ， 1000rpm10min。 （ 3）

49、加 入 PBS-T溶 液 ， 37 C孵 育 15min， PBS洗 2次 ，n （ 4） 加 入 200ml胎 牛 血 清 ， 室 溫 反 應(yīng) 30min。 （ 5） 加 入 FITC標(biāo) 記 的 TFAR19單 抗 ， 4 C反 應(yīng) 30min （ 6） 熒 光 細(xì) 胞 洗 液 洗 2次 ， 熒 光 顯 微 鏡 及 共 聚 焦 激 光 顯 微 鏡 下 觀 察TFAR19在 細(xì) 胞 中 的 定 位 。 同 時(shí) 用 流 式 細(xì) 胞 計(jì) 定 量 檢 測(cè) TFAR19蛋 白 的 平 均 熒光 強(qiáng) 度 。 2： 貼 壁 細(xì) 胞 的 原 位 染 色 （ 1） 貼 壁 生 長 的 對(duì) 數(shù) 期 細(xì) 胞 鋪

50、在 24孔 或 6孔 板 中 （ 內(nèi) 有 潔 凈 蓋 玻 片 ） ，讓 其 爬 片 生 長 ， 待 長 到 50%80%滿 時(shí) ， 凋 亡 誘 導(dǎo) 劑 處 理 細(xì) 胞 。 （ 2） 將 不 同 時(shí) 間 點(diǎn) 處 理 的 細(xì) 胞 進(jìn) 行 免 疫 熒 光 染 色 ， 染 色 步 驟 同 上 。 （ 3） 將 染 色 的 爬 片 細(xì) 胞 放 于 一 張 滴 有 少 量 甘 油 （ 5ul） 的 載 玻 片 上 ，熒 光 顯 微 鏡 或 共 聚 焦 激 光 掃 描 顯 微 鏡 觀 察 TFAR19在 細(xì) 胞 中 的 定 位 。 n原理：n是指酶標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的成

51、色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定性、定位和定量測(cè)定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙的結(jié)合起來，借助顯微鏡（包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡等）的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等），并可在原位顯示相應(yīng)的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物。四 免 疫 組 織 化 學(xué) 技 術(shù) 免 疫 組 化 染 色 技 術(shù) 的 分 類n 免 疫 熒 光 法 （ Immunofluorescence technique）n 免 疫 酶 法 （ Immunoperoxidase technique）n 免 疫 金 銀 法 （ （ Immunogold techni

52、que）n ABC法 （ Avidin-Biotin Complex） 五 蛋 白 質(zhì) 與 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 的 研 究 技 術(shù) 1 GST融 合 蛋 白 進(jìn) 行 Pulldow實(shí) 驗(yàn) （ 1） 原 理 細(xì) 菌 表 達(dá) 的 谷 胱 甘 肽 s 轉(zhuǎn) 移 酶 （ GST） 融 合 蛋 白 主 要 用于 蛋 白 的 親 和 純 化 ， 也 可 以 將 GST融 合 蛋 白 作 為 探 針 ， 與溶 液 中 的 特 異 性 搭 檔 蛋 白 結(jié) 合 ， 然 后 根 據(jù) 谷 胱 甘 肽 瓊 脂糖 球 珠 能 夠 沉 淀 GST融 合 蛋 白 的 能 力 來 確 定 相 互 作 用 的 蛋白 。

53、一 般 在 得 到 目 標(biāo) 蛋 白 的 抗 體 前 ， 或 發(fā) 現(xiàn) 抗 體 干 擾 蛋白 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 之 間 的 相 互 作 用 時(shí) ， 可 以 啟 用 GST沉 降 技 術(shù) 。該 方 法 只 是 用 于 確 定 體 外 的 相 互 作 用 。 兩 種 應(yīng) 用 ： 1） 確 定 融 合 （ 或 探 針 ） 蛋 白 與 未 知 （ 或 靶 ） 蛋 白 間 的 新 的 相 互 作 用 2） 證 實(shí) 探 針 蛋 白 與 已 知 蛋 白 質(zhì) 間 可 疑 的 相 互 作 用 （ 2） 方 法 ： 1） GST融 合 蛋 白 先 與 下 列 蛋 白 溶 液 之 一 孵 育 （ a, 單 一 明 確 的

54、 重 組蛋 白 ； b， 細(xì) 胞 裂 解 蛋 白 混 合 液 ； c, 體 外 翻 譯 cDNA表 達(dá) 得 到 的 未知 蛋 白 ） 2） 混 合 液 與 谷 胱 甘 肽 瓊 脂 糖 球 珠 反 應(yīng) 4C 2h 3） 離 心 棄 上 清 4） 沉 淀 加 入 2 蛋 白 Loading Buffer煮 沸 ， 離 心 5） 取 上 清 進(jìn) 行 SDS-PAGE電 泳 ， 6） 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 觀 察 特 異 沉 降 的 蛋 白 帶 ， 進(jìn) 一 步 做 質(zhì) 譜 分 析 確 定 沉 降 的 蛋 白 ； 電 泳 后 的 膠 也 可 以 做 Western Blot來 確 定 沉 降 的蛋

55、 白 中 是 否 有 目 的 蛋 白 該 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 立 GST對(duì) 照 ， 反 應(yīng) 均 在 4C進(jìn) 行 GST-Pulldown Assay 2 免 疫 共 沉 淀n （ 1） 原 理n 當(dāng) 細(xì) 胞 在 非 變 性 條 件 下 被 裂 解 時(shí) ， 完 整 細(xì) 胞 內(nèi) 存 在 的許 多 蛋 白 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 間 的 相 互 作 用 被 保 留 了 下 來 。 如果 用 蛋 白 質(zhì) X的 抗 體 免 疫 沉 淀 X， 那 么 與 X在 體 內(nèi) 結(jié) 合 的蛋 白 質(zhì) Y也 能 沉 淀 下 來 。 這 種 方 法 常 用 于 測(cè) 定 兩 種 目 標(biāo)蛋 白 質(zhì) 是 否 在 體 內(nèi) 結(jié) 合 ， 也 可

56、用 于 確 定 一 種 特 定 蛋 白質(zhì) 的 新 的 作 用 搭 檔 n 缺 點(diǎn) ： 可 能 檢 測(cè) 不 到 低 親 和 力 和 瞬 間 的 蛋 白 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 免 疫 共 沉 淀 檢 測(cè) 蛋 白 質(zhì) 的 原 理 和 常 見 問 題 （ 2） 方 法n 1) 收 獲 培 養(yǎng) 的 細(xì) 胞 （ 1 107 1 108） 冷 PBS洗 滌 2次n 2） 細(xì) 胞 裂 解 液 裂 解 細(xì) 胞 ， 冰 浴 30minn 3) 12000rpm 離 心 30minn 4） 收 集 上 清 并 加 入 適 量 抗 體 ， 4C搖 動(dòng) 1hn 5） 加 入 ProteinG-Sepharos

57、e懸 液 ， 4C搖 動(dòng) 1hn 6） 細(xì) 胞 裂 解 液 洗 滌 ProteinG-Sepharose混 合 液n 7） 離 心 棄 上 清 n 8） 沉 淀 加 2 蛋 白 Loading Buffer煮 沸 5 10minn 9） 離 心 ， 上 清 液 跑 SDS-PAGE 膠n 10） 考 馬 氏 亮 蘭 染 色 、 銀 染n Western Blot 質(zhì) 譜 分 析 （ 3） 注 意 的 問 題n 1） 細(xì) 胞 裂 解n 采 用 溫 和 的 裂 解 條 件 ， 不 能 破 壞 細(xì) 胞 內(nèi) 存 在 的 所 有 蛋 白 質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 ， 多 采 用 非 離 子 變 性

58、 劑 （ NP40或 Triton X-100)。 每 種 細(xì) 胞 的裂 解 條 件 是 不 一 樣 的 ， 通 過 經(jīng) 驗(yàn) 確 定 。 不 能 用 高 濃 度 的 變 性 劑 （ 0.2 SDS)， 細(xì) 胞 裂 解 液 中 要 加 各 種 酶 抑 制劑 ， 如 商 品 化 的 cocktailer。 n 2） 使 用 明 確 的 抗 體 ， 可 以 將 幾 種 抗 體 共 同 使 用n 3） 使 用 對(duì) 照 抗 體 ： 單 克 隆 抗 體 ： 正 常 小 鼠 的 IgG或 另 一 類 單 抗 兔 多 克 隆 抗 體 ： 正 常 兔 IgGn n（1）原理：n將編碼某一蛋白X的DNA序列與DN

59、A結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個(gè)雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個(gè)雜交體，當(dāng)兩個(gè)雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞（此酵母細(xì)胞上游有DNA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨(dú)不能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測(cè)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。 3 酵母雙雜交系統(tǒng) 雙雙雙雜雜雜交交交系系系統(tǒng)統(tǒng)統(tǒng)的的的原原原理理理 LacZGal4激 活 域Gal4結(jié) 合 域Gal4結(jié) 合 域 LacZLacZGal4激 活 域 LacZGal4激 活 域Gal4結(jié) 合

60、域XYXY 1）已知蛋白之間相互作用的檢測(cè)：2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對(duì)其中某一個(gè)蛋白質(zhì)作缺失或定點(diǎn)突變，再用此系統(tǒng)檢測(cè)是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BD基因構(gòu)建成“誘餌”表達(dá)質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNA文庫與AD基因構(gòu)建成“獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNA序列，并推測(cè)其蛋白質(zhì)序列。 用 途 4 蛋 白 質(zhì) 芯 片n 其 制 作 原 理 類 似 于 基 因 芯 片 ， 所 不 同 的 是 ， 蛋 白 、 多肽 芯 片 所 用 的 樣 品 是 提 純 的 蛋 白 、 多 肽 。 其

61、檢 測(cè) 的 原理 類 似 于 抗 原 、 抗 體 檢 測(cè) 的 ELISA法 。 如 采 用 雙 抗 夾 心的 形 式 ， 可 通 過 機(jī) 械 點(diǎn) 涂 的 方 法 ， 將 多 種 不 同 的 單 克隆 抗 體 點(diǎn) 樣 固 定 在 固 相 介 質(zhì) 表 面 ， 如 PVDF膜 上 ， 制 備成 抗 體 蛋 白 芯 片 ， 與 制 備 的 多 種 抗 原 樣 本 雜 交 、 結(jié) 合 ，芯 片 上 的 抗 體 捕 獲 相 應(yīng) 的 抗 原 ， 然 后 再 與 標(biāo) 記 的 多 種不 同 的 抗 體 雜 交 ， 由 于 抗 原 具 有 多 價(jià) 結(jié) 合 表 位 而 結(jié) 合標(biāo) 記 抗 體 ， 根 據(jù) 雜 交 信 號(hào) 的 有 無 、 多 少 而 進(jìn) 行 定 性 、定 量 的 分 析 。