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生物技術(shù)實(shí)踐,選修1,專(zhuān)題1 微生物的利用,一、微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) 1．培養(yǎng)基 (1)概念：人們按照微生物對(duì)①__________的不同需求，配制出供其②__________的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),生長(zhǎng)繁殖,(2)成分：盡管培養(yǎng)基的配方各不相同，但其基本成分都包括③____________ 、④____________ 、⑤____________和⑥__________。還需滿足不同微生物對(duì)⑦_(dá)_______、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及⑧__________的要求。 (3)培養(yǎng)基配制的程序：計(jì)算→⑨__________→溶化→滅菌→倒平板。,水,碳源,氮源,無(wú)機(jī)鹽,pH,氧氣,稱(chēng)量,2．無(wú)菌技術(shù),溫和,內(nèi)部一部分,煮沸消毒法,巴氏消毒法,強(qiáng)烈,內(nèi)外所有,灼燒滅菌法,高壓蒸汽滅菌法,3．微生物培養(yǎng)的基本技術(shù) (1)純化大腸桿菌的原理：在培養(yǎng)基上將稀釋的細(xì)菌分散成單個(gè)菌落，會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的、具有?______________的子細(xì)胞群體，叫做?_______。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。 (2)微生物純化的培養(yǎng)方法(兩種接種方法)：,一定形態(tài)結(jié)構(gòu),菌落,平板劃線法,簡(jiǎn)單,單菌落易分離,復(fù)雜,4℃,甘油管藏,－20℃,脲酶,制備培養(yǎng)基,細(xì)菌的計(jì)數(shù),稀釋涂布平板,復(fù)合,C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,纖維素酶,葡萄糖,剛果紅染色法,透明圈,1．培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基 (1)培養(yǎng)基的配制原則 ①目的要明確：配制時(shí)應(yīng)根據(jù)微生物的種類(lèi)、培養(yǎng)目的等確定配制的培養(yǎng)基種類(lèi)。 ②營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。 ③pH要適宜：各種微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍不同，如細(xì)菌為6.5～7.5，放線菌為7.5～8.5，真菌為5.0～6.0，培養(yǎng)不同微生物所需pH不同。,微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用,(2)培養(yǎng)基的種類(lèi)與用途,①微生物最常用的碳源是糖類(lèi)，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。 ②對(duì)異養(yǎng)微生物來(lái)說(shuō)，含C、H、O、N的有機(jī)化合物既是碳源，又是氮源、能源。③有些培養(yǎng)基不需要添加特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，生物自己能合成，如大腸桿菌能合成某些維生素作為特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。,2．微生物培養(yǎng)的無(wú)菌技術(shù) 進(jìn)行無(wú)菌操作主要是為了防止外來(lái)雜菌的入侵，重點(diǎn)是消毒和滅菌。 (1)消毒和滅菌的區(qū)別,(2)無(wú)菌技術(shù)的操作要求 ①實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)操作空間、操作人員進(jìn)行消毒；對(duì)所用器具和培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。 ②實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)需在酒精燈火焰周?chē)臒o(wú)菌區(qū)操作，另外要避免已滅菌處理的材料再次污染。,用酒精消毒時(shí)，70%的酒精殺菌效果最好，原因是：濃度過(guò)高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固成一層保護(hù)膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過(guò)低，殺菌力減弱。,(3)三種常用滅菌方法的比較,3．大腸桿菌的純化以及菌種的保藏 (1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 ①步驟：計(jì)算―→稱(chēng)量―→溶化―→滅菌―→倒平板。 ②注意事項(xiàng)：a.倒平板的適宜溫度是50 ℃左右，溫度過(guò)高會(huì)燙手，過(guò)低培養(yǎng)基又會(huì)凝固；b.平板需倒置，這樣既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。,(2)純化大腸桿菌 ①原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌稀釋或分散成單個(gè)細(xì)胞，使其長(zhǎng)成單個(gè)菌落，這個(gè)菌落就是一個(gè)純化的細(xì)菌菌落。 ②方法：平板劃線法、稀釋涂布平板法。 平板劃線法是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面；稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)缓髮⒉煌♂尪鹊木悍謩e涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。,(3)菌種的保藏 ①臨時(shí)保藏：固體斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存，菌種易被污染或產(chǎn)生變異。 ②長(zhǎng)期保存：－20 ℃甘油管在冷凍箱中保藏。,解析 本題考查平板劃線操作方法。在每次劃線前后都要對(duì)接種環(huán)進(jìn)行滅菌，接種環(huán)的滅菌方法應(yīng)是在火焰上灼燒，接種時(shí)劃線操作是在火焰旁進(jìn)行。在5個(gè)區(qū)域中，只要有單個(gè)活細(xì)菌，通過(guò)培養(yǎng)即可獲得所需菌落。 答案 D,(2013·成都模擬)關(guān)于制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的敘述錯(cuò)誤的是( ) A．操作順序?yàn)橛?jì)算、稱(chēng)量、溶化、倒平板、滅菌 B．將稱(chēng)好的牛肉膏連同稱(chēng)量紙一同放入燒杯 C．等培養(yǎng)基冷卻至50℃左右進(jìn)行倒平板 D．待平板冷卻凝固5～10 min后將平板倒過(guò)來(lái)放置 【答案】A,【解析】操作順序?yàn)橄葴缇俚蛊桨?；牛肉膏?huì)黏附在稱(chēng)量紙上，應(yīng)該將稱(chēng)好的牛肉膏連同稱(chēng)量紙一同放入燒杯；培養(yǎng)基冷卻至50℃左右既沒(méi)有凝固，同時(shí)又不燙手，可以進(jìn)行倒平板；為了防止冷卻過(guò)程中培養(yǎng)皿蓋上凝集的水珠對(duì)平板的污染，培養(yǎng)基冷卻凝固后就要將平板倒過(guò)來(lái)放置。,1．測(cè)定微生物數(shù)量的方法 (1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 ①原理：利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量。 ②缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌。,特定微生物的數(shù)量的測(cè)定,(2)間接計(jì)數(shù)法(活菌計(jì)數(shù)法) ①方法：一般用稀釋涂布平板法，當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，就是來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。,②注意事項(xiàng) a．設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。 b．為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。 ③計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)＝(C/V)×M，其中C表示某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V表示涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)，M表示稀釋倍數(shù)。,(2)檢測(cè)天然水源中的細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌菌落數(shù)： 細(xì)菌總數(shù)通常是指1 g或1 mL檢測(cè)樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。大腸桿菌菌落數(shù)通常是指每100 g或100 mL檢測(cè)樣品中所含細(xì)菌的實(shí)際數(shù)值。 (3)檢測(cè)某種食品中的細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌菌落數(shù)： 一般說(shuō)來(lái)，大腸桿菌菌落總數(shù)越多，說(shuō)明食品的衛(wèi)生質(zhì)量越差。 (4)土壤中分解尿素細(xì)菌的計(jì)數(shù) 某些細(xì)菌中含有尿素分解酶，能將培養(yǎng)基中的尿素分解成氨，該物質(zhì)的水溶液會(huì)使酚酞指示劑呈現(xiàn)紅色。,3．制備系列稀釋液的方法 將1 g土樣放入99 mL無(wú)菌水中，制成102倍的稀釋液，用1 mL無(wú)菌移液管吸取上述濃度的溶液0.5 mL，移入裝有4.5 mL無(wú)菌水的試管中，即配制成103倍的稀釋液，用同樣的方法可以配制成104、105、106倍的稀釋液。將待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋的目的是使微生物細(xì)胞分散開(kāi)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近真實(shí)值。,(2013·江蘇模擬)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是( ) A．涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230 B．涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238 C．涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250，取平均值233,解析 在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性，所以A、B項(xiàng)不正確。C項(xiàng)雖涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另外兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，此時(shí)，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來(lái)求平均值 答案 D,(2013·廣東深圳一模)某學(xué)者欲研究被石油污染過(guò)的土壤中細(xì)菌數(shù)量，并從中篩選出能分解石油的細(xì)菌。下列操作錯(cuò)誤的是( ) A．利用平板劃線法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù) B．用以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選 C．采用稀釋涂布平板法分離菌種 D．稱(chēng)取和稀釋土壤時(shí)應(yīng)在火焰旁 【答案】A 【解析】平板劃法能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分離純化，但不能對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋涂布平板法可以分離菌種還可進(jìn)行計(jì)數(shù)，A項(xiàng)錯(cuò)誤。,1．分離微生物的方法 從混合樣品中獲得某種微生物的方法通常有兩種： (1)利用該分離對(duì)象對(duì)某一營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有“嗜好”的原理，專(zhuān)門(mén)在培養(yǎng)基中加入該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使它成為一種加富培養(yǎng)基。 (2)利用該分離對(duì)象對(duì)某種抑菌物質(zhì)的抗性，在混合培養(yǎng)物中加入該抑制物，經(jīng)培養(yǎng)后，原來(lái)占優(yōu)勢(shì)的微生物生長(zhǎng)受抑制，而分離對(duì)象卻可乘機(jī)大大增殖，在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)。,培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇分析,2．選擇培養(yǎng)基及應(yīng)用實(shí)例 (1)選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)需要的微生物的生長(zhǎng)，目的是從眾多微生物中分離所需要的微生物。 (2)選擇培養(yǎng)基應(yīng)用實(shí)例： ①培養(yǎng)基中加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。 ②培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。,③培養(yǎng)基中缺乏氮源時(shí)，可以分離固氮微生物，因?yàn)榉枪痰⑸锊荒茉诖伺囵B(yǎng)基上生存。 ④當(dāng)培養(yǎng)基的某種營(yíng)養(yǎng)成分為特定化學(xué)成分時(shí)，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時(shí)，可以抑制不能利用石油的微生物的生長(zhǎng)，使能夠利用石油的微生物生存，達(dá)到分離能消除石油污染的微生物的目的。 ⑤改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達(dá)到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)只能得到耐高溫的微生物。,(2015屆揚(yáng)州中學(xué)高三月考)科研人員從被石油污染的土壤中分離獲得能降解石油成分“多環(huán)芳烴菲”的菌株Q，步驟如下圖所示，下列相關(guān)的敘述中，錯(cuò)誤的是( ),,A．步驟①～③中，培養(yǎng)液中需加入多環(huán)芳烴菲作為唯一碳源 B．步驟①～③中，將錐形瓶放在搖床上充分振蕩，使菌株與培養(yǎng)液充分接觸 C．步驟④是利用平板劃線法純化菌株Q，圖中所示接種環(huán)最少灼燒2次 D．步驟④中每一區(qū)域可重復(fù)畫(huà)幾次，但1區(qū)和5區(qū)不能出現(xiàn)交叉,解析 要想分離出能降解石油成分“多環(huán)芳烴菲”的菌株Q，所用培養(yǎng)液中需加入多環(huán)芳烴菲行為唯一碳源，A正確；培養(yǎng)過(guò)程中，將錐形瓶充分振蕩，目的是使菌株與培養(yǎng)液充分接觸，B正確；接種環(huán)在每次接種前和接種結(jié)束后都通過(guò)灼燒來(lái)滅菌，所以完成步驟④共需灼燒接種環(huán)6次，C錯(cuò)誤；純化菌株Q過(guò)程中，由于線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，所以在做第二次以及其后的劃線操作時(shí)，總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線，1區(qū)和5區(qū)不能交叉，D正確。 答案 C,(2015屆廣州檢測(cè))欲從土壤中分離出能分解尿素的細(xì)菌，下列實(shí)驗(yàn)操作中不正確的是( ) A．將土壤用無(wú)菌水進(jìn)行一系列的梯度稀釋 B．同一濃度的土壤稀釋液應(yīng)至少涂布三個(gè)平板 C．可將未接種的培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)作為對(duì)照 D．用加入剛果紅指示劑的培養(yǎng)基可篩選出分解尿素的細(xì)菌 【答案】D,【解析】為了獲得單個(gè)菌落，應(yīng)將土壤用無(wú)菌水進(jìn)行一系列的梯度稀釋?zhuān)珹正確；為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，同一濃度的土壤稀釋液至少要涂布3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，然后計(jì)算平均值，B正確；加入剛果紅的培養(yǎng)基用來(lái)篩選纖維素分解菌，D錯(cuò)誤。,