《細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《細(xì)胞融合和體細(xì)胞雜交（40頁珍藏版）》請?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第 五 章 細(xì) 胞 融 合 與 體 細(xì) 胞 雜 交 遠(yuǎn) 源 雜 交 遠(yuǎn) 緣 雜 交 ： 不 同 種 屬 之 間 ， 或 是 地 理 上 遠(yuǎn) 緣 的 種內(nèi) 亞 種 之 間 個(gè) 體 的 交 配 稱 為 遠(yuǎn) 緣 雜 交 。 由 于 種 屬 間 存 在 著 種 種 隔 離 機(jī) 制 ， 致 使 遠(yuǎn) 緣 雜 交常 表 現(xiàn) 不 親 和 或 獲 得 的 遠(yuǎn) 緣 雜 種 表 現(xiàn) 不 育 。 不 親 和 性 ： 在 有 性 生 殖 過 程 中 ， 由 于 個(gè) 體 細(xì) 胞 或 組織 水 平 上 的 不 協(xié) 調(diào) 而 使 受 精 或 接 合 不 能 正 常 進(jìn) 行 ，或 是 受 精 后 不 能 產(chǎn) 生 后 代 的 現(xiàn)

2、象 。 雙 親 個(gè) 體 間 基 因 型 的 不 協(xié) 調(diào) 或 是 染 色 體 組 非 同 源 性在 生 殖 生 理 表 型 上 的 一 種 反 映 。 不 親 和 性 是 穩(wěn) 定 物種 的 重 要 機(jī) 理 。 種 間 不 親 和 性 ： 異 種 、 異 屬 生 物 個(gè) 體 之 間 的 生 殖 不親 和 現(xiàn) 象 常 由 染 色 體 組 的 不 同 所 造 成 。 一 般 地 說 ，越 是 遠(yuǎn) 緣 則 不 親 和 性 越 高 ， 直 到 完 全 不 能 受 精 。 第六章 細(xì)胞雜交（融合）技術(shù) 一 、 定 義1， 細(xì) 胞 融 合 (cell fusion)廣 義 ： 凡 是 將 兩 個(gè) 細(xì) 胞 或

3、原 生 質(zhì) 體 融 合 成 一 個(gè) 細(xì) 胞的 過 程 。 包 括 體 細(xì) 胞 、 性 細(xì) 胞 的 融 合 和 自 發(fā) 融 合 。 就植 物 而 言 ， 又 稱 為 原 生 質(zhì) 體 融 合 (protoplast fusion)。將 不 同 的 體 細(xì) 胞 融 合 在 一 起 ， 通 過 對 雜 種 細(xì)胞 的 篩 選 ， 培 養(yǎng) ， 期 望 得 到 體 細(xì) 胞 雜 種 的 一 種 手 段 。所 以 又 稱 為 體 細(xì) 胞 雜 交 (somatic hybridazation)。細(xì) 胞 融 合 =原 生 質(zhì) 體 融 合 =體 細(xì) 胞 雜 交 體 細(xì) 胞 雜 交 與 有 性 雜 交 的 異 同比 較

4、 內(nèi) 容 體 細(xì) 胞 雜 交 有 性 雜 交時(shí) 間 無 季 節(jié) 限 制 花 期 限 制 ， 特 別 是母 本 的 花 期親 緣 關(guān) 系 一 定 程 度 上 可 以 克服 有 性 /嫁 接 不 親和 性 受 親 和 性 影 響結(jié) 果 細(xì) 胞 核 、 細(xì) 胞 質(zhì) 均可 以 重 組 、 倍 性 增加 雙 受 精 ， 一 般 無 細(xì)胞 質(zhì) 重 組 ， 倍 性 不改 變 第 二 節(jié) 體 細(xì) 胞 雜 交 步 驟 ：1 原 生 質(zhì) 體 的 制 備2 原 生 質(zhì) 體 的 融 合3 雜 種 細(xì) 胞 選 擇4 雜 種 細(xì) 胞 培 養(yǎng)5 由 愈 傷 組 織 再 生 植 株6 雜 種 植 株 的 鑒 定 原 生 質(zhì)

5、體 融 合自 發(fā) 融 合 自 然 界 中 ： 受 精 、 雙 受 精 、 花 粉 母 細(xì) 胞 融 合 等 。 在 原 生 質(zhì) 體 制 備 和 培 養(yǎng) 過 程 中 ： 細(xì) 胞 壁 被 分 解后 ， 原 生 質(zhì) 體 的 胞 間 連 絲 發(fā) 生 膨 大 ， 相 鄰 細(xì) 胞的 原 生 質(zhì) 和 細(xì) 胞 器 通 過 胞 間 連 絲 流 到 一 起 ， 形成 融 合 。 此 現(xiàn) 象 在 同 種 或 同 品 種 植 物 間 發(fā) 生 ,但頻 率 極 低 。 誘 導(dǎo) 融 合 ： 通 過 誘 導(dǎo) 劑 的 作 用 ， 使 兩 個(gè) 遠(yuǎn) 緣的 原 生 質(zhì) 體 產(chǎn) 生 融 合 的 方 法 ， 是 細(xì) 胞 融 合 中常 用

6、的 手 段 細(xì) 胞 融 合 的 方 法聚 乙 二 醇 PEG）化 學(xué) 方 法 電 脈 沖物 理 方 法 生 物 方 法仙 臺 病 毒(Sendai virus)NaNO3處 理高 PH-高 濃 度 Ga2+ NaNO3處 理 1909年 ， Kuster在 一 個(gè) 發(fā) 生 了 質(zhì) 壁 分 離 的 表 皮 細(xì) 胞中 ， 低 滲 NaNO3溶 液 可 以 引 起 2個(gè) 亞 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 缺 點(diǎn) ： 異 核 體 形 成 頻 率 不 高 ， 對 細(xì) 胞 毒 害 大 ， 融 合率 低 (0.1%)， 重 復(fù) 難 。 高 PH-高 濃 度 鈣 離 子 處 理 1973年 ， Keller

7、和 Melchers， 用 強(qiáng) 堿 性 (pH10.5)的高 濃 度 鈣 離 子 （ 50mmol.L-1)溶 液 在 37 下 處 理 約30min， 兩 個(gè) 品 系 的 煙 草 葉 肉 原 生 質(zhì) 體 很 容 易 融 合 。 但 對 于 有 些 原 生 質(zhì) 體 系 統(tǒng) ， 這 樣 高 的 PH值 是 有 毒 的 。 PEG(聚 乙 二 醇 )處 理 PEG的 作 用 機(jī) 理 ： 由 于 PEG分 子 具 有 輕 微 的負(fù) 極 性 ， 故 可 以 與 具 有 正 極 性 基 團(tuán) 的 水 、 蛋白 質(zhì) 和 碳 水 化 合 物 等 形 成 H鍵 ， 從 而 在 原 生 質(zhì)體 之 間 形 成 分

8、子 橋 ， 其 結(jié) 果 是 使 原 生 質(zhì) 體 發(fā)生 粘 連 進(jìn) 而 促 使 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 。 另 外 ， PEG能 增 加 類 脂 膜 的 流 動(dòng) 性 ， 也 使原 生 質(zhì) 體 的 核 、 細(xì) 胞 器 發(fā) 生 融 合 成 為 可 能 。 PEG融 合 所 需 試 劑 融 合 液 ： pH 5.6CaCl2 8-10mmolKH2PO4 0.7mmol甘 露 醇 或 山 梨 醇 0.5-1.0mol 誘 導(dǎo) 液 ： 融 合 液 PEG 20 45 PEG作 為 融 合 劑 的 優(yōu) 點(diǎn) : 異 核 體 形 成 的 頻 率 高 ， 可 重 復(fù) 性 強(qiáng) 。缺 點(diǎn) ： 有 一 定 毒 性

9、 ， 容 易 形 成 多 個(gè) 細(xì) 胞 的 融 合 體 ；分 裂 頻 率 低 。 電 融 合 電 場 來 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 彼 此 連 接 成 串 ， 再 施 加 瞬 間強(qiáng) 脈 沖 促 使 質(zhì) 膜 發(fā) 生 可 逆 性 電 擊 穿 ， 促 進(jìn) 細(xì) 胞融 合 的 技 術(shù) 。 原 理 ： 在 直 流 電 脈 沖 的 刺 激 下 ， 原 生 質(zhì) 體 質(zhì) 膜表 面 的 電 荷 發(fā) 生 改 變 ， 使 異 種 細(xì) 胞 或 原 生 質(zhì) 體粘 合 并 發(fā) 生 質(zhì) 膜 瞬 間 破 裂 ， 進(jìn) 而 連 接 ， 直 到 閉合 成 完 整 的 膜 形 成 融 合 體 。 優(yōu) 點(diǎn) ： 融 合 率 高 、 重 復(fù) 性 與 可

10、 控 制 性 強(qiáng) 。 缺 點(diǎn) ： 可 能 會(huì) 造 成 不 可 恢 復(fù) 的 細(xì) 胞 損 傷 。 細(xì) 胞 電 融 合 儀 生 物 法 病 毒 誘 導(dǎo) 細(xì) 胞 融 合 ： 研 究 最 早 的 細(xì) 胞 融 合 誘 導(dǎo) 方 法 。主 要 是 由 于 病 毒 會(huì) 與 宿 主 細(xì) 胞 膜 直 接 融 合 ， 同 時(shí) 進(jìn)入 兩 個(gè) 細(xì) 胞 就 會(huì) 打 破 兩 個(gè) 細(xì) 胞 膜 的 隔 閡 ， 引 發(fā) 細(xì) 胞質(zhì) 的 交 流 ， 進(jìn) 而 達(dá) 到 細(xì) 胞 融 合 的 目 的 。 缺 點(diǎn) ： 要 提 前 大 量 培 養(yǎng) 病 毒 ， 并 且 滅 活 后 才 能 作 為融 合 劑 使 用 ， 操 作 繁 瑣 ， 而 且 一

11、 旦 滅 活 不 充 分 的 話 ，病 毒 還 可 能 感 染 親 本 細(xì) 胞 。 因 此 ， 目 前 已 經(jīng) 很 少 使用 病 毒 誘 導(dǎo) 法 進(jìn) 行 細(xì) 胞 融 合 。 （ 1） 足 夠 量 的 病 毒 顆 粒 附著 在 細(xì) 胞 膜 上 起 搭 橋 作 用 ，使 細(xì) 胞 聚 集 在 一 起 。 （ 2） 通 過 病 毒 與 原 生 質(zhì) 體或 細(xì) 胞 膜 的 作 用 使 兩 個(gè) 細(xì)胞 膜 間 互 相 滲 透 ， 胞 質(zhì) 互相 融 合 。 粘 結(jié) 部 位 質(zhì) 膜 被破 壞 ， 不 同 細(xì) 胞 間 形 成 通道 ， 細(xì) 胞 質(zhì) 流 通 并 融 合（ 病 毒 也 隨 之 進(jìn) 入 細(xì) 胞質(zhì) ） 。

12、（ 3） 有 絲 分 裂 ， 細(xì) 胞 核 融合 ， 形 成 雜 種 細(xì) 胞 。 原 生 質(zhì) 體 的 融 合 過 程 異 種 原 生 質(zhì) 體 先 經(jīng) 膜 融 合 形 成 共 同 的質(zhì) 膜 ， 然 后 經(jīng) 胞 質(zhì) 融 合 ， 產(chǎn) 生 細(xì) 胞 壁 ， 最后 是 核 融 合 。 細(xì) 胞 核 的 融 合 是 異 種 原 生 質(zhì)體 融 合 的 關(guān) 鍵 。融 合 體 只 有 成 為 單 核 細(xì) 胞 后 才 能 繼 續(xù) 生 長 ，才 能 合 成 DNA、 RNA， 四 異 核 體 的 核 融 合 取 決 于 二 親 本 原 生 質(zhì) 體 發(fā) 育 周 期 的 同 步 程 度 和 系 統(tǒng) 發(fā)育 關(guān) 系 的 遠(yuǎn) 近

13、以 及 培 養(yǎng) 基 對 二 親 本 原 生 質(zhì) 體 的 有 利 程 度1 異 核 體 的 核 融 合 和 染 色 體 的 行 為 一 般 是 在 兩 親 本 核 同 步 分 裂 過 程 中 發(fā) 生 的 。 第 一 次有 絲 分 裂 ； 這 就 要 求 兩 個(gè) 核 必 須 同 步 分 裂 ， 如 果 兩個(gè) 核 所 處 時(shí) 期 不 同 ， 一 個(gè) 開 始 合 成 DNA， 另 一 個(gè) 還處 于 合 成 的 中 途 或 已 完 成 了 復(fù) 制 ， 它 們 之 間 就 會(huì) 相互 影 響 ， 導(dǎo) 致 最 終 不 能 進(jìn) 行 細(xì) 胞 分 裂 。2 親 緣 關(guān) 系 對 融 合 體 發(fā) 育 的 影 響種 內(nèi)

14、和 親 和 的 種 間 ：不 親 和 屬 間 、 科 間 ： 核 融 合 失 敗 ， 染 色 體 丟 失 、 重 排 或 形 成 嵌 合 體 。即 使 屬 間 能 發(fā) 育 成 植 株 ， 也 是 不 育 的 。海 藻 +胡 蘿 卜 ， 在 第 一 次 分 裂 后 ， 一 親 本 核 即 退化 。 Hela+胡 蘿 卜 ， 胡 蘿 卜 核 退 化 。 細(xì) 胞 融 合 是 一 個(gè) 隨 機(jī) 的 物 理 過 程 ， 經(jīng) 融 合 后細(xì) 胞 將 以 多 種 形 式 出 現(xiàn) ， 需 要 通 過 培 養(yǎng) 和 篩選 ， 除 去 不 需 要 的 細(xì) 胞 ， 分 離 出 需 要 的 雜 種細(xì) 胞 ， 從 而 解 決

15、 融 合 細(xì) 胞 的 選 擇 問 題 。問 題 ： A與 B融 合 過 程 中 ， 有 哪 些 形 式 的 細(xì) 胞 嗎 ？ 選 擇 融 合 體 或 雜 種 細(xì) 胞1.互 補(bǔ) 選 擇 法2.機(jī) 械 分 離 雜 種 細(xì) 胞 法3. 雙 熒 光 標(biāo) 記 選 擇 法 異 硫 氰 酸 熒 光 素 （ FITC） ： 綠 色異 硫 氰 酸 羅 丹 明 （ RITC） ： 紅 色雙 熒 光 標(biāo) 記 選 擇 法 體 細(xì) 胞 雜 種 植 株 的 鑒 定 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 細(xì) 胞 學(xué) 觀 察 分 子 標(biāo) 記 同 工 酶 分 析 形 態(tài) 標(biāo) 記 形 態(tài) 標(biāo) 記 即 植 物 的 外 部 特 征 ， 如 花 的 形

16、狀 及 顏色 、 耐 逆 性 以 及 對 病 的 抗 性 等 。 形 態(tài) 標(biāo) 記 簡 單直 觀 ， 但 是 標(biāo) 記 少 、 多 態(tài) 性 差 、 易 受 環(huán) 境 條 件和 其 它 修 飾 基 因 的 影 響 ， 并 且 許 多 性 狀 為 數(shù) 量性 狀 ， 由 幾 個(gè) 位 點(diǎn) 控 制 ， 表 現(xiàn) 為 一 個(gè) 范 圍 ， 而不 是 簡 單 的 性 狀 差 異 。 細(xì) 胞 學(xué) 標(biāo) 記 細(xì) 胞 標(biāo) 記 主 要 包 括 染 色 體 核 型 (染 色 體數(shù) 目 、 大 小 、 隨 體 、 著 絲 點(diǎn) 位 置 等 )和 帶型 (C帶 、 N帶 、 G帶 等 )。 細(xì) 胞 學(xué) 標(biāo) 記 位 點(diǎn)較 少 ， 而 且

17、 對 于 親 緣 關(guān) 系 較 近 的 物 種 ，由 于 細(xì) 胞 學(xué) 標(biāo) 記 差 別 不 明 顯 ， 所 以 很 難根 據(jù) 細(xì) 胞 學(xué) 特 征 來 區(qū) 分 。 熒 光 原 位 雜 交 （ FISH）優(yōu) 點(diǎn) 是 可 以 顯 示 在 體 細(xì) 胞 雜 種 中 哪 條 染 色 體 來 源 于 這個(gè) 親 本 ， 哪 條 染 色 體 來 源 于 另 一 個(gè) 親 本 ， 因 而 更 準(zhǔn)確 、 直 觀 。 分 子 生 物 學(xué) 標(biāo) 記 植 物 的 分 子 標(biāo) 記 主 要 有 RAPD、 RFLP、 AFLP、 SSR、 ISSR、 EST等 。 體 細(xì) 胞 雜 交 育 種 的 意 義 1 克 服 有 性 不 親 和 性 ， 實(shí) 現(xiàn) 遠(yuǎn) 源 遺 傳 重 組 ， 創(chuàng) 造 新 的物 種 或 品 系 。 細(xì) 胞 融 合 產(chǎn) 生 的 后 代 種 內(nèi) （ 穩(wěn) 定 ） 種 間 （ 穩(wěn) 定 或 不 穩(wěn) 定 ） 屬 間 （ 不 穩(wěn) 定 ） ， 番 茄 +土 豆 = Potamato 科 間 （ 不 穩(wěn) 定 ， 無 植 株 ） ， 門 間 （ 不 穩(wěn) 定 ， 無 植 株 ） 問 題 ： 與 基 因 工 程 改 造 相 比 有 什 么 優(yōu) 點(diǎn) ？思 考 題 人 們 可 以 隨 心 所 欲 地 將 各 個(gè) 物 種 細(xì) 胞 融合 形 成 新 的 生 命 形 式 嗎 ？