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白血病分子生物學,白血病分子生物學,白血病的分子機制 白血病的分子檢測 白血病分子檢測的臨床應用,白血病的分子機制,基因(gene)：合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。 癌基因(oncogene)：細胞或病毒中存在的，能誘導正常細胞轉化并使之獲得新生物特征的基因。 癌基因活化的方式： 點突變 染色體重排 基因擴增 抑癌基因(tumor suppressor genes)：指一類基因，其產(chǎn)物對細胞生長增殖起負調控的作用，并能潛在抑制細胞的惡變。,白血病的分子機制,,白血病的分子機制,增殖過度 分化阻斷 凋亡受抑,“二次打擊”學說,D.Gary Gilliland Best Practice 16:409-417,白血病的分子檢測,Southern blot Northern blot Western blot FISH PCR 測序 芯片,白血病的分子檢測,PCR反應原理,N = N0 x (1+E)n N：擴增子數(shù)量 N0：起始模板數(shù)量 E：擴增效率 n：循環(huán)數(shù),白血病的分子檢測,PCR理論方程,白血病的分子檢測,PCR方法優(yōu)點 快速 靈敏 特異 PCR方法缺點 假陽性 假陰性,白血病的分子檢測,PCR：僅適用于染色體斷裂點叢集于相對小的范圍內（<2kb），如T-ALL中SIL-TAL1。 RT-PCR：可用于染色體斷裂點跨越很大的區(qū)域的融合基因。 巢式RT-PCR：可顯著提高反應的特異性，增加擴增效率。 RQ-PCR：可定量擴增產(chǎn)物。,白血病的分子檢測,RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 熒光標記擴增產(chǎn)物 熒光標記引物 特異性熒光標記探針 TaqMan探針、分子信標、雜交雙探針 熒光染料直接結合擴增產(chǎn)物 SYBR Green I與DNA雙鏈結合 動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化,TaqMan探針法,特異性高 多重基因定量 成本較高,SYBR Green I 法,成本低 最適合初步篩查 熔解曲線功能 無法多重檢測 無模板特異性 靈敏度低,白血病的分子檢測,CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長（穿過閾值線）時的循環(huán)次數(shù) CT值與起始模板量成反比,白血病的分子檢測,RQ-PCR的檢測系統(tǒng)： 該系統(tǒng)內置了96孔PCR儀，且在每個反應孔上均有一個監(jiān)測探頭用于檢測PCR反應管中的熒光強度。平均每8-12秒就檢測一次，以達到實時檢測的目的。 系統(tǒng)中的電腦系統(tǒng)同時不斷地分析來自檢測系統(tǒng)的信息，不斷計算每個反應管中的熒光強度，并最終得到CT值。 該系統(tǒng)可以根據(jù)標準品的CT值和拷貝數(shù)自動繪制標準曲線，并計算未知樣品中的目的基因拷貝數(shù)。,白血病的分子檢測,RQ-PCR方法優(yōu)點： 靈敏而特異 起點定量 閉管化學（污染的風險低） 沒有PCR后處理（無需走膠，拍照等） 高度自動化 定性：單數(shù)據(jù)點測定 定量：多數(shù)據(jù)點測定 能做基因分型及SNP鑒定,RQ-PCR的操作流程,從細胞或組織中抽提DNA或RNA,用PCR或RT-PCR擴增特異片段,將PCR產(chǎn)物克隆到合適的載體上,純化，定量和系列稀釋質粒DNA或RNA,體外轉錄成RNA片段（僅用于RNA樣品）,構建標準曲線（CT υ lgcopy）,樣品的定量檢測,校正樣品基因拷貝數(shù),,,,,,,,白血病分子檢測的臨床應用,白血病的分子生物學檢查對白血病診斷分型及預后判斷有以下幾方面意義： 補充MIC檢查的不足 發(fā)現(xiàn)新的亞型 監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（MRD） 為研究白血病的發(fā)病機制打下基礎,白血病分子檢測的臨床應用,PCR方法檢測MRD常用的分子標志,AML1-ETO,t(8;21)(q22;q22) 6~8%原發(fā)性AML，在M2中的陽性率為20~40%，在M2b中陽性率為90% 少見于M4和M1，極少見于MDS和骨髓增生綜合癥 AML1-ETO+白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化至較成熟的嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且對化療反應較敏感 AML1-ETO+患者對大劑量阿糖胞苷治療效果好，具有較高的緩解率，無病生存期長，預后較其他AML亞型（M3除外）好,AML1-ETO,對初發(fā)患者進行t(8;21)和AML1-ETO融合基因的檢測對其預后判斷及治療方案的制定相當重要 AML1-ETO定性結果不能用于評價患者MRD情況 RQ-PCR能實時反映體內AML1-ETO水平。連續(xù)定量AML1-ETO轉錄本水平可判定有高復發(fā)風險的患者，以便及早治療干預以防血液學復發(fā),,AML1- 陰性 ETO+,C-KIT基因突變,C-KIT為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一 AML1-ETO可誘導性表達的轉基因小鼠，并不導致白血病發(fā)生 C-KIT突變可見于伴inv(16)的M4以及伴t(8;21)的M2患者 26/54例(48.1%) M2b患者中檢測到C-KIT基因突變 57例不伴t(8;21)的其他類型血液腫瘤患者均未檢測到C-KIT基因突變 以上結果提示C-KIT突變與M2b密切相關(R=0.94, P<0.01),C-KIT基因突變,C-KIT基因結構,JM,,C-KIT基因突變,外周血白細胞計數(shù),C-KIT基因突變,生存曲線,PML-RARα,t(15;17)(q22;q21) 98%M3患者 繼t(15;17)之后，又先后發(fā)現(xiàn)4種M3特異的累及RARα的變異性染色體易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及dup(17)(q21.3;q23)，分別產(chǎn)生PLZF-RARα，NPM-RARα，NuMA-RARα和STAT5b-RARα融合基因 臨床上，具有PLZF-RARα或STAT5b-RARα融合基因患者對ATRA治療不敏感，其余三種染色體易位患者經(jīng)ATRA治療可獲完全緩解,PML-RARα,APL累及的RARα基因及其伙伴基因結構示意圖,,PML-RARα,由于PML基因斷裂點不同產(chǎn)生3種不同的PML-RARα異構體 約55%的M3患者為L型，40%為S型，5%為V型，且每位患者只表達一種PML-RARα融合蛋白 形態(tài)學上S型白血病細胞常為低分化的并且這些患者可見繼發(fā)細胞遺傳學異常，V型APL患者的白血病細胞體外對ATRA的敏感度低,PML-RARα,RT-PCR檢測PML-RARα是敏感且特異的APL診斷方法，還能用于治療后MRD監(jiān)測。PML-RARα陽性提示的分子復發(fā)常早于臨床復發(fā)3-6個月，為臨床采取進一步治療措施提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在發(fā)病、治療、緩解、復發(fā)整個過程的白血病細胞負荷，在MRD監(jiān)測中比RT-PCR具有更高價值,,,L+ 陰性 S+,FLT3基因突變,Fms-related tyrosine kinase 3 FLT3為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFRβ和c-KIT）成員之一，該類受體因在造血過程中造血細胞的增殖和存活中發(fā)揮重要調控作用 綜合國外各研究報道， FLT3-ITD和D835突變在AML中陽性率分別為24%(385/1585)和7%(30/429)，總陽性率超過30%，使其成為AML中最普遍發(fā)生突變的靶基因 許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變還與臨床預后密切相關，尤對60歲以下的AML患者，F(xiàn)LT3突變患者預后較差，且可獨立于核型之外,FLT3基因突變,,FLT3基因突變,FLT3基因主要突變類型,FLT3基因突變,mut-FLT3信號通路,FLT3基因突變,外周血白細胞計數(shù),CBFβ-MYH11,inv(16)(p13;q22)及t(16;16)(p13;q22) 主要見于M4Eo，10%不伴異常嗜酸細胞M4，少見于M2 CBFβ-MYH11融合蛋白通過干擾核心結合因子（core binding factor,CBF）的轉錄激活作用而致病 具有CBFβ-MYH11的患者對化療敏感，預后較好，故提高檢測率尤具臨床意義,CBFβ-MYH11,CBFβ-MYH11具有多種變異型，其中最常見的為A型，占80% RT-PCR檢測CBFβ-MYH11進行MRD監(jiān)測顯示，大部分患者在完全緩解時PCR轉陰，但仍有小部分長期存活者PCR仍為陽性 最新研究采用RQ-PCR檢測CBFβ-MYH11轉錄本水平來評價M4Eo患者MRD情況，預示復發(fā),,,,NPM基因突變,Nucleophosmin，為核-漿穿梭蛋白，調控p53-ARF通路 見于~50%核型正常的AML患者，而在伴低危/高危核型患者中極少見 主要見于M4/M5中 第12號外顯子的插入/缺失 伴此突變患者WBC計數(shù)高 目前，此突變的預后價值各研究組報道不一，尚待進一步證實,DEK-CAN,t(6;9)(p23;q34) 主要見于M2或M4，也見于M1，MDS-RAEB 伴DEK-CAN的患者年齡一般較輕，且預后較差 此類患者進行分子監(jiān)測有助于判斷患者預后，調整治療方案,,N-RAS基因突變,為RAS基因家族成員之一，染色體定位于1p32.2。具有GTP/GDP結合和GTPase活性，調控正常細胞的生長 此基因突變存在于11-30%AML 突變熱點位于codon12,13和61 在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突變率較高，而在t(15;17)中低 伴此突變患者外周血WBC計數(shù)低 該突變預后意義尚不明,WT-1基因高表達,Wilms tumor 1 是無特異分子異常的急性白血病患者理想的MRD檢測指標 伴此基因高表達者預后差，且表達程度與預后相關,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11) 15~30%成人ALL及3~5%兒童ALL 9號染色體的斷裂點與CML相同，但22號染色體斷裂點具有異質性 此融合蛋白p190刺激細胞增殖的能力比p210要強。在轉基因試驗中觀察到p190誘發(fā)的白血病具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點 BCR-ABL+ALL患者預后差，5年存活率<20%，因此這些患者在緩解后需進行骨髓移植治療,BCR-ABL,對于自體或異體移植ALL患者，移植前后BCR-ABL的有無以及BCR-ABL的轉錄本類型與預后有關,,e1a2+ 陰性,E2A-PBX1,t(1;19)(q23;p13) 5~6%兒童ALL和3%成人ALL 此類患者具有高的白細胞計數(shù)，高的血清乳酸脫氫酶及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，預后差，平均無病生存期（DFS）僅6個月，3年DFS為20%，需給予這些患者強化治療才能獲得較好的預后 核型和E2A-PBX1檢測對此類患者的診斷和治療方案的選擇至關重要 E2A-PBX1的預后價值需更多的臨床研究證實,,,TEL-AML1,t(12;21)(p13;q22) 25%兒童ALL，是兒童ALL中最常見的分子異常 目前為止尚未在T-ALL，AML或NHL中發(fā)現(xiàn)t(12;21)，在嬰兒白血病中極少報道，在成人白血病患者中頻率很低（<2%） 此類患者發(fā)病年齡?。?歲~10歲），WBC計數(shù)低（<50 000/L），免疫表型為前B-ALL 此類患者對治療反應佳，完全緩解時間長，預后好,TEL-AML1,由于12p和21q末端在常規(guī)顯帶中很相似，因此常規(guī)細胞遺傳學方法檢出率僅0.05%，需應用FISH或RT-PCR方法提高檢測陽性率 TEL基因重排是獨立預后因素，RT-PCR檢測TEL-AML1融合基因能將低危險度與高危險度的ALL患者區(qū)分開來。因此早期檢測TEL-AML1融合基因對臨床預后，確定合適的治療方案都有重要意義,,,MLL相關融合基因,累及MLL基因的分子異常見于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可見于治療相關白血病，尤接受topoisomerase II抑制劑治療的患者 MLL基因涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關。最常見的有： t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9融合基因 AML t(11;19)(p13;q23) MLL-ENL融合基因 AML及ALL,MLL相關融合基因,至今，MLL相關融合蛋白的致病性還不清楚，推測其可能具有雙重作用： ——融合蛋白可能獲得新的功能，促使細胞轉化 ——MLL發(fā)生斷裂后，缺失鋅指結構域的MLL不能與DNA結合，失去其轉錄活化功能，使受MLL調節(jié)的靶基因（HOX基因）表達異常，也影響造血細胞的發(fā)育,MLL-AF4,t(4;11)(q21;q23) t(4;11)的發(fā)生率在不同年齡段是不同的，在嬰兒ALL中最多見，為50~70%，而在兒童和成人中較低，分別為2%和3~6% 此類患者發(fā)病年齡低（通常<2歲），白細胞計數(shù)高，常伴有內臟巨大并累及中樞神經(jīng)系統(tǒng) 此類患者病情兇險，預后差?；颊邔藴手委煼桨负芸赡軣o效，需給予強化治療。目前應用高劑量Ara-C治療，使這些患者預后有所提高,MLL-AF4,對≤2歲的嬰幼兒急性白血病患者應常規(guī)進行MLL-AF4融合基因的檢測以篩選出高?；颊撸o予強化治療提高生存率 RT-PCR可在所有t(4;11)患者初發(fā)時檢測到MLL-AF4融合基因。由于該融合基因累及的2個基因的斷裂點變異性較大，因此PCR應包括所有斷裂點以免產(chǎn)生假陰性結果,,,TAL1基因重排,t(1;14)(p32;q11)，TAL1-TCRδ融合基因 3%T-ALL 易位使TAL1基因與TCRδ位點并置，其5′端正常轉錄調節(jié)被TCRδ 5′部分所取代，而后者在T細胞中有高表達,TAL1基因重排,1p32缺失，SIL-TAL1融合基因 16~26%T-ALL 該重組僅見于T-ALL，是T-ALL的一個有用的克隆標志 缺失部分可能為TAL1基因的調控序列，使TAL1基因表達失控，導致與染色體易位相似的表型 常規(guī)遺傳學方法檢測不到這一異常，而SIL-TAL1融合處特異的序列能作為這類患者特異的分子標志用于PCR檢測,,,TAL1基因重排,TAL1異常僅見于T-ALL，尚未見于B-ALL，AML和T細胞NHL，是兒童T-ALL中最常見非隨機遺傳缺陷，是監(jiān)測大多數(shù)T-ALL的侯選基因 伴TAL1異常的患者血象表現(xiàn)為高白細胞計數(shù)，高血紅蛋白含量，免疫表型為CD2+/CD10– 盡管在治療反應上，有TAL1重排患者和無TAL1重排患者無顯著差異，但伴TAL1重排患者4年無事件生存率（EFS）高于不伴TAL1重排的患者，分別為59±11%和44±7%，提示伴TAL1重排患者預后較好,HOX11基因異常表達,t(10;14)(q24;q11) ，t(7;10)(q34;q24) 7%的T-ALL 易位使HOX11基因受控于TCRδ和TCRβ基因調控序列，導致其異常表達 另有部分HOX11高表達患者核型正常 伴有此種異常的患者對聯(lián)合化療反應好，預后也較其他T-ALL患者要好，完全緩解率為100%，平均無病生存期為46個月，3年無病生存率為75%,HOX11L2基因異常表達,t(5;14)(q35;q32) 20%的兒童T-ALL 易位使HOX11L2基因處于CTIP2調控元件的控制下，而CTIP2基因在T淋巴細胞分化時高度表達 在隨訪患者中檢測到高水平HOX11L2說明白血病細胞的存在，強烈預示復發(fā)，而完全緩解患者HOX11L2表達水平迅速降低，并維持在一個低水平?？梢奌OX11L2的表達水平可作為MRD檢測的標志,NOTCH1基因突變,NOTCH1信號對CLP(common lymphoid progenitors)向T細胞定向以及前T細胞受體復合物組裝是必須的 35-50% T-ALL患者存在此基因突變 伴NOTCH1基因突變的成年T-ALL患者預后較差,NOTCH1基因突變,NOTCH1基因結構,,NOTCH1基因突變,生存曲線,,,BCR-ABL,t(9;22)(q34;q11) >90% CML患者 BCR-ABL融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激酶活性較正常ABL高，可能是BCR對ABL激酶活性調節(jié)區(qū)的作用所致 由于<5%CML患者為隱匿性Ph染色體，因此無Ph染色體CML患者還需使用更靈敏的分子檢測手段如FISH或RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因 RT-PCR還能區(qū)分e1-a2和b2-a2/b3-a2二種BCR-ABL轉錄本，從而區(qū)分ALL患者與CML急淋變患者，進而分別對兩種不同患者采用不同的治療方案,BCR-ABL,巢式RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因用于CML移植患者移植后MRD監(jiān)測?？稍诨颊哐簩W復發(fā)前的6~24個月骨髓檢測就呈陽性。 RQ-PCR還能動態(tài)觀察患者治療后BCR-ABL轉錄本水平變化情況，反映療效。,b3a2+ b2a2+ 陰性,GATA2基因突變,調控早期造血干細胞增殖分化的轉錄因子，維持造血干祖細胞的增殖和自我更新能力 CML急變患者中新發(fā)現(xiàn)GATA2基因突變， 而CML慢性期、加速期，AML（M1-M7），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及正常對照均未發(fā)現(xiàn)該突變，可見GATA2基因突變僅與CML急變相關，是CML疾病進展過程中的獲得性突變?？偘l(fā)生率為12.5%（5/40），且均造成CML急粒單變 GATA2基因突變與CML患者疾病進展和預后的關系有待進一步闡明,JAK2基因突變,Janus kinase 2 此基因突變主要見于MPD和MDS，另可存在于部分AML尤M2 突變?yōu)閂617F 突變去除了JAK2 JH2負性調控，導致該基因的持續(xù)活化，賦予細胞增殖存活優(yōu)勢 JAK2可成為靶向治療的靶點,MDS相關基因異常,Delta樣(Dlk)基因編碼Dlk蛋白在MDS明顯增高者55%，而AML僅10%，可能是MDS特異性基因，但作為診斷MDS的標志基因尚待進一步確定,MDS相關基因異常,RAS 此原癌基因超家族編碼鳥苷三磷酸水解酶(GTPase)調節(jié)細胞生長相關信號 ras癌基因的活化，尤其是N-ras的激活可在約35%的MDS患者中發(fā)生 FMS 為集落刺激因子1，控制單核-巨噬細胞生長、分化及功能 fms基因的突變可在16%的MDS患者中發(fā)現(xiàn) ras和fms突變主要見于粒-單細胞分化的疾病，即MDS中的CMML，患者生存期短，轉AML多,MDS相關基因異常,p53 在MDS時，p53突變較少見(<5%)，但在較為進展的病例中可高達15% p53突變意味著化療耐藥和生存期縮短，因而是一種有意義的預后指標 FLT3 10%MDS有FLT3點突變，加快進展為AML，但FLT3-ITD少見 AML1(RUNX1) 為MDS較常見的點突變，發(fā)生率25%，導致核心結合因子(CBF)亞單位正常功能缺失，易轉化AML,Ig/TCR基因重排,Ig/TCR基因重排檢測，對決定白血病的細胞來源系列乃至分化階段，有重大意義 在B系ALL中分別有95%，54%，55%和33%的患者有IgH，TCRδ，TCRγ和TCRβ基因重排，在T-ALL中相應的基因重排率分別為14%，68%，91%和89% 由于重排的多樣性，重排的Ig和TCR基因連結區(qū)序列在各淋巴(前體)細胞中是不同的，因而每位患者有其各自特異的Ig/TCR基因重排序列，這一特定的Ig/TCR基因重排序列可作為該惡性克隆的分子標志，在分子水平進行診斷分型，還可通過PCR檢測緩解期患者有無初發(fā)時的Ig/TCR基因重排來追蹤殘余白血病細胞，用于預后判斷,Ig/TCR基因重排,Ig的基因由Lκ，Lλ和H三個基因組組成，分別編碼Lκ鏈，Lλ鏈和H鏈。L和H基因又由編碼Ig分子的V區(qū)和C區(qū)基因構成。 B細胞分化： IgH重排 κ重排 IgH/κ表達 IgH重排 λ重排 IgH/λ表達 κ錯誤重排/缺失,,,,,Ig/TCR基因重排,TCR由兩條肽鏈組成，αβ鏈或γδ鏈，不論是哪一種肽鏈，其胞膜外區(qū)均包括兩部分，即V區(qū)和C區(qū)。相應的編碼基因為TCRA,TCRB, TCRG和TCRD。 T細胞分化： TCRD重排 TCRG重排 TCRγδ表達 TCRB重排 TCRA重排 TCRαβ表達 TCRD缺失,,,,,Ig/TCR基因重排,Ig/TCR基因多樣性的機制 組合造成的多樣性 ~2x106 Ig, ~3x106 TCRαβ, ~5x103TCRγδ 連接造成的多樣性 >1012 Ig和TCR 體細胞高頻突變造成的多樣性 僅限于成熟B淋巴細胞,Ig/TCR基因重排,V-D-J重排：IgH,TCRB,TCRD V-J重排：Lκ,Lλ,TCRA,TCRG,Ig/TCR基因重排,謝 謝！,