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1、第 十 四 章Biochip Technology 醫(yī) 學(xué) 分 子 生 物 學(xué) 實 驗 技 術(shù) 藥 立 波 主 編 第 一 節(jié) 概 述 一 、 生 物 芯 片 的 概 念 二 、 DNA芯 片一 、 基 因 表 達(dá) 譜 研 究一 、 原 位 合 成 DNA芯 片 制 作 二 、 DNA微 陣 列 芯 片 制 作一 、 待 測 樣 品 的 準(zhǔn) 備 二 、 分 子 雜 交 反 應(yīng) 三 、 檢 測 分 析第 二 節(jié) 生 物 芯 片 的 制 作 第 三 節(jié) DNA芯 片 使 用 的 基 本 流 程 第 四 節(jié) 蛋 白 質(zhì) 芯 片第 五 節(jié) 生 物 芯 片 的 基 本 操 作 和 流 程二 、 DNA測

2、 序 三 、 基 因 突 變 檢 測四 、 基 因 診 斷 五 、 蛋 白 質(zhì) 芯 片 的 應(yīng) 用 六 、 藥 物 研 發(fā) 2021年 6月 1日 22時 10分 2 生 物 芯 片 (biochip) 技 術(shù) 是 20世 紀(jì) 90年 代 初 期 由分 子 生 物 學(xué) 、 微 電 子 學(xué) 、 物 理 學(xué) 、 化 學(xué) 和 計 算 機 科 學(xué)等 多 學(xué) 科 交 叉 融 合 而 發(fā) 展 起 來 的 高 新 技 術(shù) ， 因 既 具 有重 大 的 學(xué) 術(shù) 價 值 ， 又 具 有 明 顯 的 產(chǎn) 業(yè) 化 前 景 ， 被 評 為1998年 度 世 界 十 大 科 技 進(jìn) 展 之 一 。 生 物 芯 片是繼大

3、規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義的科學(xué)技術(shù)革命。 生 物 芯 片 將 會 改 變 生 命 科 學(xué) 的 研 究 方 式 ， 革 新 醫(yī)學(xué) 診 斷 和 治 療 ， 極 大 地 提 高 人 口 素 質(zhì) 和 健 康 水 平 。 薩 瑟 恩 提 出 的 核 酸 雜 交 理 論 ， 即 標(biāo) 記 的 核 酸 分 子能 夠 與 被 固 化 的 與 之 互 補 配 對 的 核 酸 分 子 雜 交 。（ Edwin Mellor Southern） Southern雜 交 可 以 被 看 作 是 生 物 芯 片 的 雛 形 。2021年 6月 1日 22時 10分 5 桑 格 和 吉 爾 伯 特 發(fā) 明 了

4、現(xiàn) 在 廣 泛 使 用 的 DNA測 序 方法 ， 并 由 此 在 1980年 獲 得 了 諾 貝 爾 獎 。（ Frederick Sanger ） （ Walter Gilbert） 生 物 芯 片 這 個 概 念 首 先 是 由 Fred Sanger和 Walter Gilbert提 出 的 ； 解 決 了 傳 統(tǒng) 核 酸 印 跡 雜 交 技 術(shù) 復(fù) 雜 、自 動 化 程 度 低 、 低 通 量 等 不 足 。2021年 6月 1日 22時 10分 6 1989， Stephen Fodor(斯 蒂 文 弗 爾 多 ) 發(fā) 明 了高 密 度 生 物 芯 片 和 芯 片 閱 讀 器 ，

5、為 生 物 芯 片 產(chǎn) 業(yè) 開 創(chuàng)及 發(fā) 展 奠 定 了 良 好 的 基 礎(chǔ) 。 1992， Affymatrix公 司 Fodor小 組 運 用 半 導(dǎo) 體 照相 平 板 技 術(shù) ， 對 原 位 合 成 制 備 的 DNA芯 片 作 了 首 次 報道 ， 這 是 世 界 上 第 一 塊 基 因 芯 片 。2021年 6月 1日 22時 10分 7 1995， Stanford大 學(xué) 的 P.Brown實 驗 室 發(fā) 明 了 第一 塊 以 玻 璃 為 載 體 的 基 因 微 矩 陣 芯 片 ； 將 cDNA密 集點 樣 在 玻 璃 片 上 ， 進(jìn) 行 基 因 表 達(dá) 譜 研 究 和 SNP分

6、析 。2021年 6月 1日 22時 10分 8 指 通 過 微 電 子 和 微 加 工 技 術(shù) ， 將 大 量 已 知 序 列 的核 酸 或 蛋 白 片 段 等 ， 有 序 地 組 合 在 1CM2大 小 固 相 介 質(zhì)表 面 而 構(gòu) 成 的 集 成 分 析 系 統(tǒng) 。 可 與 標(biāo) 記 的 核 酸 或 蛋 白分 子 特 異 結(jié) 合 ， 實 現(xiàn) 對 核 酸 、 蛋 白 等 生 物 組 分 的 快 速 、高 效 、 敏 感 的 處 理 與 分 析 。 狹 義 的 生 物 芯 片 包 括 基 因 芯 片 、 蛋 白 質(zhì) 芯 片 、 細(xì)胞 芯 片 和 組 織 芯 片 等 。 廣 義 的 生 物 芯

7、片 還 包 括 用 于 研 制 生 物 計 算 機 的 生物 芯 片 、 將 健 康 細(xì) 胞 與 電 子 集 成 電 路 結(jié) 合 起 來 的 仿 生芯 片 、 縮 微 化 的 實 驗 室 即 芯 片 實 驗 室 。 2021年 6月 1日 22時 10分 9 生 物 分 子 間 的 相 互 特 異 識 別 作 用 （ 如 : DNA分子 之 間 、 蛋 白 分 子 之 間 、 DNA與 蛋 白 分 子 之 間 以 及自 組 裝 單 分 子 膜 之 間 等 ） 高 通 量 、 高 集 成 、 并 行 化 、 微 型 化 、 自 動 化 、連 續(xù) 化 2021年 6月 1日 22時 10分 10

8、根 據(jù) 芯 片 的 用 途 可 分 為 兩 大 類 2021年 6月 1日 22時 10分 11 又 被 稱 為 基 因 芯 片 (gene chips)、 DNA陣 列(DNA array)、 cDNA芯 片 (cDNA chips)、 寡 核 苷 酸陣 列 (oligonucleotide array)等 。 DNA芯 片 是 指 在 固 相 支 持 物 上 寡 核 苷 酸或 者 直 接 將 大 量 預(yù) 先 合 成 的 DNA探 針 以 顯 微 打 印 的 方式 有 序 地 固 化 于 支 持 物 表 面 ； 使 用 時 與 標(biāo) 記 的 樣 品 雜 交 ， 通 過 對 雜 交 信 號 的檢

9、 測 分 析 從 而 得 出 樣 品 的 遺 傳 信 息 。 2021年 6月 1日 22時 10分 12 1. 玻 片 型 這 種 芯 片 的 點 陣 是 通 過 原 位 合 成 技術(shù) 制 作 的 ， 點 陣 密 度 很 高 ， 所 以 必 須 借 助 于 特 殊 的儀 器 對 測 定 結(jié) 果 進(jìn) 行 解 讀 和 分 析 。 2021年 6月 1日 22時 10分 13 有 此 類產(chǎn) 品 研 制能 力 的 公司 不 多 ,如Affimetrix公 司 。 2. 薄 膜 型 如 聚 丙 烯 膜 、 硝 酸 纖 維 素 膜 、 尼 龍膜 等 。 這 種 類 型 “ 芯 片 ” 的 點 陣 是 通

10、 過 “ 點 膜 ” 形式 制 作 的 ， 并 通 過 一 定 的 方 法 使 探 針 能 夠 牢 固 地 結(jié)合 于 其 上 ， 整 個 過 程 類 似 于 斑 點 雜 交 技 術(shù) （ 如 Clone Tech公 司 ） 。 2021年 6月 1日 22時 10分 14 3. 微 板 型 這 種 芯 片 實 質(zhì) 上 是 一 種 具 有 高 密度 、 小 容 量 測 試 孔 的 小 型 酶 聯(lián) 免 疫 檢 測 板 （ 如 PE公 司 等 ） 。 2021年 6月 1日 22時 10分 15 4.集 成 電 路 型 將 雜 交 技 術(shù) 與 微 電 子 技 術(shù) 結(jié)合 于 一 體 ， 通 過 電 子

11、裝 置 檢 測 或 控 制 DNA等 生 物大 分 子 的 作 用 過 程 （ 如 Nanogen公 司 ） 2021年 6月 1日 22時 10分 16 原 位 合 成 芯 片 DNA微 陣 列研 發(fā) 小 組 Affymatrix公 司 Fodor研究 組 斯 坦 福 大 學(xué) Brown實 驗 室制 作 方 式 原 位 化 學(xué) 合 成 收 集 探 針 ， 顯 微 打 印探 針 類 型 寡 核 苷 酸 cDNA、 基 因 片 段 、 寡 核 苷酸 、 RNA等探 針 長 度 短 ， 小 于 50 nt 較 長 ， 100500 nt 或 更 長最 高 集 成 度 1040 萬 點 陣 /cm2

12、 110 萬 點 陣 /cm2專 利 保 護(hù) 專 利 控 制 嚴(yán) 格 無 專 利 控 制 2021年 6月 1日 22時 10分 17 顯 微 光 蝕 刻 技 術(shù)(光 引 導(dǎo) 原 位 合 成 )分 子 印 章 法分 子 印 章 法針 式 點 樣噴 墨 點 樣壓 電 打 印 法 2021年 6月 1日 22時 10分 18 經(jīng) 化 學(xué) 處 理 , 連 接 光 敏保 護(hù) 基 (X), 選 用 保 護(hù) 非 聚 合 部 位 ；2. 用 激 光 點 光 源 照 射 聚 合 部 位 ,去 除 光 敏 保 護(hù) 基(X), 暴 露3. 加 入 單 核 苷 酸 (如 dTMP)的 亞 磷 酰 胺 活 化 端 與

13、發(fā) 生 化 學(xué) 偶 聯(lián) ,光 敏 保 護(hù) 非 活 化 端 ；4. 更 換 掩 模 (M2)， 激 光 點 光 源 照 射 下 一 個 位 點 ；5. 脫 保 護(hù) ， 偶 聯(lián) 第 二 個 核 苷 酸 (如 dCMP)；6. 重 復(fù) 上 述 步 驟 ， 直 至 合 成 完 所 需 探 針 2021年 6月 1日 22時 10分 19 ( peptide nucleic acid , PNA) 是 一 類 以 氨 基 酸 替 代 糖 -磷 酸 主 鏈 的 DNA類 似 物 ，骨 架 由 重 復(fù) 的 N-甘 氨 酸 通 過 酰 胺 鍵 相 連 構(gòu) 成 ， 堿 基 則通 過 甲 叉 碳 酰 基 與 骨

14、架 相 連 。 PNA分 子 內(nèi) 不 會 形 成 二 級 、 三 級 結(jié) 構(gòu) ； DNA與 PNA雜 交 不 需 要 鹽 離 子 。 2021年 6月 1日 22時 10分 21 2021年 6月 1日 22時 10分 22 分 為 實 性 材 料 和 膜 性 材 料 兩 類 ：最 常 用 的 玻 片 預(yù) 處 理 方 法 ： 實 性 材 料 有 硅 芯 片 、 玻 片 和 瓷 片 等 ； 膜 性 材 料 有聚 丙 烯 膜 、 尼 龍 膜 和 硝 酸 纖 維 膜 。 2021年 6月 1日 22時 10分 23 采 用 多 聚 賴 氨 酸 包 被 ， 氨 基 硅 烷 化 ， 醛 基 化 等 方法

15、 ， 使 其 表 面 衍 生 出 氨 基 或 醛 基 。 將 合 成 用 探 針 溶 液 放 入 打 印 墨 盒 內(nèi) ， 由 電 腦 依 據(jù)預(yù) 定 的 程 序 在 xyz方 向 自 動 控 制 打 印 噴 頭 在 芯 片 支 持物 上 移 動 ， 并 將 特 定 的 探 針 試 劑 噴 印 到 特 定 位 點 。 噴 印 上 去 的 試 劑 即 以 固 相 合 成 原 理 與 該 處 支 持 物發(fā) 生 偶 聯(lián) 反 應(yīng) 。 2021年 6月 1日 22時 10分 24 1)玻 璃 片 基 的 處 理 ： 使 玻 璃 表 面 獲 得 羥 基 、 醛 基 、氨 基 等 活 性 基 團(tuán) ；優(yōu) 點 ：

16、成 本 低 ， 操 作 簡 單 ， 密 度 高 (幾 十 萬 點 cm 2)， 轉(zhuǎn) 移 過 程 中 探 針 溶 液 損 失 小 。缺 點 ： 定 量 準(zhǔn) 確 性 、 重 現(xiàn) 性 不 好 。2)點 樣 針 沾 取 探 針 溶 液 ；3)點 樣 針 把 探 針 點 到 玻 片 表 面 ， 讓 探 針 末 端 的 化 學(xué)集 團(tuán) 與 玻 片 表 面 的 集 團(tuán) 形 成 共 價 鍵 。 2021年 6月 1日 22時 10分 25 2202芯 片 點 樣 儀 生 產(chǎn) 商 ： Bio-Rad；性 能 介 紹 ： 分 辨 率 ： 1.25um(x， y軸 )和 0.25um(Z軸 )。 重 復(fù) 性 ： 3u

17、m； 球 面 精 確 性 ： l0um。一 次 制 成 芯 片 數(shù) ： 126塊 芯 片 ， 每 塊 玻 片 點 樣 量 82,000個 點 。2021年 6月 1日 22時 10分 26 氨 基 修 飾 的 玻 片 ， 可 以 一 定 能 量 的 紫 外 線 進(jìn) 行 照射 ， 使 DNA探 針 中 的 胸 腺 嘧 啶 殘 基 ， 與 支 持 物 上 帶 正電 的 氨 基 形 成 共 價 鍵 而 固 定 在 玻 片 表 面 ； 醛 基 修 飾 的 玻 片 ， 可 使 氨 基 末 端 修 飾 探 針 的 氨 基 ，與 玻 片 上 的 醛 基 形 成 Schiff堿 ， 使 DNA探 針 固 定

18、在 玻片 表 面 。 2021年 6月 1日 22時 10分 27 2021年 6月 1日 22時 10分 28 2021年 6月 1日 22時 10分 29 2021年 6月 1日 22時 10分 30 (入 射 )激 光 束 發(fā) 射 光濾 鏡 檢 測 透 鏡 檢 測 器共 聚 焦針 孔熒 光 束光 束 分 離 器 (分 光 鏡 )物 鏡 支 持 物由 樣 品 發(fā) 射 的 熒 光圖 14-4 共 聚 焦 掃 描 示 意 圖反 光 鏡樣 品 放 大 器數(shù) 模 轉(zhuǎn)換 器計 算 機 2021年 6月 1日 22時 10分 31 2021年 6月 1日 22時 10分 32 基 因 芯 片 技 術(shù)

19、基 因 芯 片 技 術(shù) 主 要包 括 四 個 主 要 步 驟 ： 芯 片制 備 、 樣 品 制 備 、 雜 交 反應(yīng) 和 信 號 檢 測 以 及 結(jié) 果 分析 (圖 13-4)。 基因芯片技術(shù)主要步驟 2021年 6月 1日 22時 10分 33 將 高 度 密 集 排 列 的 蛋 白 分 子 作 為 探 針 點 陣 固 定 在 固相 支 持 物 上 ， 加 入 待 測 蛋 白 樣 品 反 應(yīng) 時 ， 可 捕 獲 樣 品 中的 靶 蛋 白 ， 再 經(jīng) 檢 測 系 統(tǒng) 對 靶 蛋 白 進(jìn) 行 定 性 和 定 量 分 析的 一 種 技 術(shù) 。 基 本 原 理 ：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能

20、特異性的相互識別和相互結(jié)合。 2021年 6月 1日 22時 10分 34 最 常 用 的 探 針 ：抗體 檢 測 方 法 ：標(biāo)記檢測法、直接檢測法 4.1.2.蛋白質(zhì)芯片的載體常選擇膜性材料，如 尼龍膜、 NC膜、聚偏氟乙烯膜等。3.蛋白質(zhì)芯片的載體的處理方法與核酸 芯片載體 相似。2021年 6月 1日 22時 10分 35 1.待 檢 測 樣 品 抗 原 從 體 液 、 組 織 細(xì) 胞 , 或 從 cDNA表 達(dá) 文 庫 中 提 取 多 肽 和 蛋 白 質(zhì) 。2.若 作 蛋 白 質(zhì) 組 學(xué) 研 究 ， 應(yīng) 同 時 制 備 正 常 與 病 變 組 織 的 蛋 白 質(zhì) 樣 品 。3.蛋 白

21、質(zhì) 樣 品 的 標(biāo) 記 ： 采 用 熒 光 素 (Cy3、 Cy5)、 放 射 性 同 位 素 等 ， 也 可 用 酶 標(biāo) 法 標(biāo) 記 。 2021年 6月 1日 22時 10分 36 1. Ag + Ab H + R Ag-Ab H-R 2. 等 等 。 2021年 6月 1日 22時 10分 37 2021年 6月 1日 22時 10分 38 2021年 6月 1日 22時 10分 39 cDNA2021年 6月 1日 22時 10分 40 2021年 6月 1日 22時 10分 41 離 心2021年 6月 1日 22時 10分 42 編 輯 打 印 程 序 、 探 針 打 印紫 外 線

22、 照 射 (使 探 針 與 玻 片 交 聯(lián) 結(jié) 合 )80 烘 干 固 定 、 室 溫 避 光 保 存 NaOH乙 醇 浸 泡 振 蕩 至 少 2 hr； 雙 蒸 水 反 復(fù) 漂 洗 。溶 液 浸 泡 振 蕩 15 min1 hr； 雙蒸 水 反 復(fù) 漂 洗 ； 離 心 、 45 干 燥 。2021年 6月 1日 22時 10分 43 2021年 6月 1日 22時 10分 44 2021年 6月 1日 22時 10分 45 2021年 6月 1日 22時 10分 46 2021年 6月 1日 22時 10分 47 2021年 6月 1日 22時 10分 48 2021年 6月 1日 22時

23、10分 49 2021年 6月 1日 22時 10分 50 綠每 個 探 針 3個 點 的 陽 性 雜 交 信 號 均 一 性 及 3次 實驗 的 重 復(fù) 性 均 較 好 。均 無 信 號 或 很 弱 ,圖 (1)和 圖 (2)中 倒 1行 第 13-18個 點 及 第 7-12個 點 圖 (1)和 圖 (2)中 倒 1行 第 1-6個 熒 光 點 分 別 代 表GAPDH的 Cy3和 Cy5信 號 強 度 ， 且 Cy3/Cy5 =1.0 (以 色 )， 見 圖 14-6中 的 (2)所 示 表 明 ： 探 針 是 特 異 的 ， 結(jié) 果 是 可 靠 的 。 2021年 6月 1日 22時

24、10分 51 紅 色 表 示 上 調(diào) ； 黃 色 表 示 不 變 ； 綠 色 表 示 下 調(diào)2021年 6月 1日 22時 10分 52 用 基 因 芯 片 檢 測 基 因 表 達(dá) 譜 的 過 程2021年 6月 1日 22時 10分 53 2021年 6月 1日 22時 10分 54 2021年 6月 1日 22時 10分 55 . . . . . . .2021年 6月 1日 22時 10分 56 寡 核 苷 酸 探 針 設(shè) 計 、 合 成 ， 在 其 末 端 加 上 1015個 堿 基 的 polyT作 為 連 接 分 子 臂 ， 分 子 臂 末 端 進(jìn) 行 氨基 修 飾 ， 如 加 上

25、 氨 基 臂 PO4(CH2)6NH2。 玻 片 通 常 先 采 用 氨 基 硅 烷 (3-氨 丙 基 三 甲 氧 基 硅烷 等 )處 理 ， 再 以 1,4-苯 二 異 硫 氰 酸 鹽 處 理 ， 使 氨 基轉(zhuǎn) 化 為 具 有 可 與 氨 基 反 應(yīng) 交 聯(lián) 的 異 硫 氰 酸 基 。 將 加 有 polyT分 子 臂 和 氨 基 臂 PO4(CH2)6NH2的寡 核 苷 酸 探 針 在 處 理 后 的 玻 片 上 點 樣 、 反 應(yīng) 而 牢 固地 結(jié) 合 在 玻 片 表 面 。 2021年 6月 1日 22時 10分 57 .GCAAACGAGTCAAAACTCC .TTTGCTCAGTT

26、TTCATTTGCTCCGTTTTCATTTGCTCCGTTTTCATTTGCTCCGTTTTCATTGCTCACTTTTCAGTTGCTCAATTTTCAGTTGCTCATTTTTCAGTTGCTCAGTTTTCAG靶 分 子探 針 TGCA T T T G C T C C G T T T T C ATGCA T T T G C T C C G T T T T C AT-G 2021年 6月 1日 22時 10分 58. 特 點 ：2021年 6月 1日 22時 10分 59 2021年 6月 1日 22時 10分 60 蛋 白 質(zhì) 表 達(dá) 譜 研 究 尋 找 藥 物作尋 找 依 據(jù)標(biāo) 志 性 蛋 白 質(zhì) 分 子 藥 物 療 效 、毒 副 作 用 評 價 2021年 6月 1日 22時 10分 61 2021年 6月 1日 22時 10分 62 2.簡 述 基 因 芯 片 、 蛋 白 質(zhì) 芯 片 各 自 在 生 物 醫(yī)學(xué) 中 的 應(yīng) 用 主 要 有 哪 些 ？思 考 題 ： 3.簡 述 采 用 DNA芯 片 作 基 因 差 異 表 達(dá) 譜 分 析 的基 本 過 程 ； 在 圖 像 重 疊 分 析 中 為 何 出 現(xiàn) 紅 、 黃 、綠 3種 顏 色 ， 各 表 明 什 么 ？ 1.簡 述 生 物 芯 片 的 基 本 原 理 和 特 征 ？