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一、基因工程的基本操作程序,目的基因的獲取 的構建 將 導入受體細胞 目的基因的 .,,,,基的因表達載體,目的基因,檢測與鑒定,二、目的基因的獲取 1．目的基因 主要是編碼蛋白質(zhì)的 ，也可以是一些具 有 的因子。 2．目的基因的獲取方法 (1)從基因文庫中獲取目的基因。 ①基因文庫 a．含義：將含有某種生物不同基因的許多 ，導入 的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不 同的基因，稱為基因文庫。,,,結構基因,調(diào)控作用,DNA片段,受體菌,(2)利用PCR技術擴增目的基因。 ①PCR含義：是一項在生物體外 的核酸合成技術，全稱是多聚酶鏈式反應。 ②PCR原理： 。 ③擴增過程 變性：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈 ↓ 復性： 與單鏈相應互補序列結合 ↓ 延伸：在 作用下延伸子鏈 (3)人工合成法：適于合成基因 ，且 已知的目的基因。,,,復制特定DNA片段,DNA雙鏈復制,引物,DNA聚合酶,較小,核苷酸序列,三、基因表達載體的構建——基因工程的核心 1．基因表達載體的功能 (1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以 給下一代。 (2)使目的基因能夠 和發(fā)揮作用。 2．基因表達載體的組成,,,遺傳,表達,四、將目的基因?qū)胧荏w細胞 1．轉化 目的基因進入 內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi) 和 。 的過程。 2．導入過程 (1)導入植物細胞,,,受體細胞,維持穩(wěn)定,表達,(3)導入微生物細胞 ①方法：用 處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為 )。 ②受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌細胞)。 ③原核生物的特點： 。,,,Ca2＋,感受態(tài)細胞,繁殖快，多為單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少等,五、目的基因的檢測與鑒定 1．分子水平的檢測(連線) 2．個體水平的鑒定 (1) 的接種實驗。 (2)對基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進行 。,,,抗蟲或抗病,活性比較,一、目的基因的獲取 閱讀教材P8～10，觀察分析圖1－6,1－8，探討下列問題： 1．獲取目的基因的方法有哪些？ 提示：有從基因文庫中獲取，PCR技術擴增和人工合成三種方法。 2．聯(lián)系DNA復制，比較PCR技術與DNA復制的不同點(填寫下表)。,提示：解旋酶 高溫 細胞內(nèi) 細胞核 細胞外 PCR擴增儀 解旋酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 溫和 二、基因表達載體的構建 閱讀教材P11，觀察分析圖1－10，探討下列問題： 1．基因工程的核心是哪一步操作？其目的是什么？ 提示：基因表達載體的構建是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 2．如圖是基因表達載體模式圖，請回答下列問題：,(1)分別寫出①②③④⑤各代表什么。 提示：①啟動子，②終止子，③標記基因(抗生素抗性基因)，④復制原點，⑤目的基因(插入基因)。 (2)圖中①②③各有什么作用？ 提示：①啟動子：一段有特殊結構的DNA片段，位于基因首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，負責驅(qū)動目的基因轉錄出mRNA。②終止子：起終止轉錄的作用。③標記基因(抗生素抗性基因)：作用是檢測受體細胞中是否有目的基因，并將含有目的基因的細胞篩選出來。 (3)啟動子和終止子與起始密碼子和終止密碼子是一回事嗎？ 提示：不是一回事，啟動子和終止子位于DNA上，是基因表達必需的部分。而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結束。,3．嘗試利用流程圖表示如何構建基因表達載體。 提示：,,,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞 閱讀教材P11～13內(nèi)容，探究下列問題： 1．將目的基因?qū)氩煌N類生物所選用的方法是否相同？常選用的受體細胞是什么？ 提示：不相同。常選用的受體細胞及導入方法如下表：,,,2.根據(jù)圖示簡述目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別嗎？ 提示：圖中②會使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達，原因是在進行細胞減數(shù)分裂時，細胞核上的DNA經(jīng)復制后平均分配到兩個子細胞中，保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性，而①細胞減數(shù)分裂時，細胞質(zhì)是不均分的，子細胞不一定含有目的基因。,,,四、目的基因的檢測與鑒定 閱讀教材P13～15有關內(nèi)容，仔細觀察分析圖1－14、1－15， 自主完成以下問題： 1．如何檢測目的基因在真核生物中穩(wěn)定遺傳？ 提示：采用DNA分子雜交技術。 2．什么是基因探針？如何檢測目的基因是否開始發(fā)揮功能？ 提示：基因探針是用放射性同位素標記的目的基因的DNA片段。 從轉基因生物中提取mRNA，用標記的目的基因作探針，與mRNA雜交，如果顯示出雜交帶，則表明目的基因轉錄出了mRNA，意味著目的基因開始發(fā)揮功能。,,,3．檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)的方法是什么？其原理是什么？ 提示：抗原—抗體雜交法。原理是抗原能與相應抗體特異性結合。 4．舉例說明進行個體生物學水平的鑒定方法有哪些？ 提示：如做抗蟲或抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進行活性比較，以確定轉基因產(chǎn)品的功能活性是否與天然產(chǎn)品相同等。,(浙江高考)天然的玫瑰沒有藍色花，這是由于缺少控 制藍色色素合成的基因B，而開藍色花的矮牽牛中存在序列已知的基因B，現(xiàn)用基因工程技術培育藍玫瑰，下列操作正確的是( ) A．提取矮牽牛藍色花的mRNA，經(jīng)過逆轉錄獲得互補的DNA，再 擴增基因B B．利用限制性核酸內(nèi)切酶從開藍色花矮牽牛的基因文庫中獲 取基因B C．利用DNA聚合酶將基因B與質(zhì)粒連接后導入玫瑰細胞 D．將基因B直接導入大腸桿菌，然后感染并轉入玫瑰細胞,,,【研析】本題通過特定的實例主要考查基因工程的相關概念及操作要領。具體解題過程如下：,,,[審]——提取信息,信息a：由A項“提取矮牽牛藍色花的mRNA”可知獲取目的基因的方法為逆轉錄。 信息b：由B項的“基因文庫”可知目的基因可直接提取，無需再切割獲取。 信息c：由C項的“基因B與質(zhì)粒連接”可知連接工具為DNA連接酶。 信息d：由D項的“基因B直接導入”可知這種方法是錯誤的，因未構建基因表達載體。,[析]——解讀信息,解讀a：利用逆轉錄法可獲取目的基因，欲增加其數(shù)量可采取PCR擴增技術。 解讀c、d：DNA聚合酶的作用是連接單個的脫氧核苷酸，而DNA連接酶的作用是連接相對應的DNA片段；構建基因表達載體是基因工程技術的核心步驟，否則將造成基因工程操作失敗。,[答案] A,解答基因工程基本操作程序題目的一般步驟 ——三辨、三找、一析、一理 (1)三辨：分辨限制酶的種類及識別序列和切割位點。在切割目的基因和載體時，一般用同一種限制酶切割，也可用不同的限制酶切割，但兩種限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端中堿基要互補配對。 (2)三找：找出標記基因、目的基因及其插入位點。一般來說，質(zhì)粒中至少有一個標記基因，如抗生素抗性基因。明確目的基因的插入位點是在標記基因內(nèi)部還是在標記基因之外。,,,(3)一析：分析目的基因插入質(zhì)粒后是否破壞了標記基因。如果質(zhì)粒中有一個標記基因，插入后一般不破壞標記基因；如果質(zhì)粒中有兩個標記基因，則需看標記基因中是否有插入位點，如果某一標記基因中有插入位點，則目的基因插入質(zhì)粒后該標記基因被破壞。 (4)一理：理清判斷目的基因是否導入受體細胞的方法。一般用含有某種抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體菌，如果有兩種抗生素抗性基因，還需判斷用哪一種抗生素來檢測。,農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了廣泛的運用。下面是農(nóng)桿菌轉化法的示意圖，試回答下列問題：,,,(1)一般情況下農(nóng)桿菌不能感染的植物是________，利用農(nóng)桿菌自然條件下感染植物的特點，能實現(xiàn)______________________。 具體原理是農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中存在T－DNA片段，它具有可轉移到受體細胞并整合到受體細胞的________上的特點，因此只要將攜帶外源基因的DNA片段插入到________(部位)內(nèi)部即可。 (2)根據(jù)T－DNA這一轉移特點，猜測該DNA片段上可能含有控制____________________(酶)合成的基因。 (3)圖中c過程中，能促進農(nóng)桿菌移向植物細胞的物質(zhì)是________類化合物。 (4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法除了農(nóng)桿菌轉化法之外，還可采取的方法是______________________。(至少寫出兩種),,,[解析] (1)一般農(nóng)桿菌不能感染的植物是單子葉植物，可感染雙子葉植物和裸子植物，利用其感染性，可實現(xiàn)將目的基因?qū)胫参锛毎?。這里需要特別明確的是真正可轉移到受體細胞并整合到受體細胞的染色體上的是農(nóng)桿菌質(zhì)粒上的T－DNA片段，因此目的基因必須插入到該部位才能導入成功。(2)根據(jù)T－DNA這一轉移特點，可以推測出DNA片段上能控制合成DNA連接酶、限制酶才能實現(xiàn)與雙子葉植物細胞染色體DNA的整合。(3)植物細胞受傷后可產(chǎn)生酚類化合物，促進農(nóng)桿菌向植物細胞轉移。(4)植物基因工程中將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法除了農(nóng)桿菌轉化法之外，還有基因槍法和花粉管通道法。 [答案] (1)單子葉植物 將目的基因?qū)氲街参锛毎?染色體DNA T－DNA片段 (2)DNA連接酶、限制酶 (3)酚 (4)基因槍法、花粉管通道法,[網(wǎng)絡構建] 填充：①利用PCR擴增 ②從基因文庫中獲取 ③基因表達載體的構建 ④農(nóng)桿菌轉化法 ⑤目的基因的檢測與鑒定 ⑥DNA分子雜交 ⑦抗原—抗體雜交,———————[課堂歸納]—————————,[關鍵語句] 1．獲取目的基因的常用方法有：從基因文庫中獲取目的基因和利用PCR技術擴增目的基因。 2．基因表達載體的構建是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。 3．一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。 4．將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法。 5．培育轉基因動物時，受體細胞一般是受精卵，目的基因的導入方法常用顯微注射技術。 6．檢測目的基因是否導入和轉錄，常用分子雜交技術；檢測 是否翻譯，常用抗原—抗體雜交技術。,1．有關目的基因獲取的理解，不正確的是( ) A．目的基因可以從自然界中分離，也可以人工合成 B．目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的結構基因 C．基因文庫就是基因組文庫 D．cDNA文庫只含有某種生物的一部分基因 解析：基因文庫又分為基因組文庫和部分基因文庫。cDNA文庫是部分基因文庫。,[答案] C,2．哪些是基因表達載體的必需組成部分( ) ①啟動子 ②終止密碼子 ③標記基因 ④目的基因 ⑤終止子 A．①②③④ B．①③④⑤ C．①②④⑤ D．①②③⑤ 解析：啟動子位于基因表達載體的首端，有了它才能驅(qū)動基因轉錄出mRNA，最終獲得所需要的蛋白質(zhì)；終止子相當于一盞紅色信號燈，使轉錄在所需要的地方停止下來；標記基因是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來；目的基因是基因表達載體上必須具有的結構。,[答案] B,3．(重慶高考)如圖是利用基因工程培育抗蟲植物的示意圖。以下相關敘述，正確的是( ) A．②的構建需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶參與 B．③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒整合到④的染色體上 C．④的染色體上若含抗蟲基因，則⑤就表現(xiàn)出抗蟲性狀 D．⑤只要表現(xiàn)出抗蟲性狀就表明植株發(fā)生了可遺傳變異,解析：構建載體需要限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶，A錯誤；③侵染植物細胞后，重組Ti質(zhì)粒上的T－DNA整合到④的染色體上，B錯誤；染色體上含有目的基因，但目的基因也可能不能轉錄或者不能翻譯，或者表達的蛋白質(zhì)不具有生物活性，C錯誤；植株表現(xiàn)出抗蟲性狀，說明含有目的基因，屬于基因重組，為可遺傳變異，D正確。,[答案] D,4．PCR技術擴增DNA，需要的條件是( ) ①目的基因 ②引物 ③四種脫氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖體 A．①②③④ B．②③④⑤ C．①③④⑤ D．①②③⑥ 解析：PCR技術擴增DNA與體內(nèi)DNA復制一樣，需要模板、引物、原料、酶等條件。,[答案] A,5．為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用倍受關注。我國科學家應用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。,(1)獲得耐鹽基因后，構建重組DNA分子所用的限制酶作用于圖中的__________處，DNA連接酶作用于________處。(選填“a”或“b”) (2)將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉化法和________法。 (3)為了確定耐鹽轉基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的______________作探針進行分子雜交檢測，又要用________________方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。,解析：基因工程的工具酶——限制酶和DNA連接酶的作用是斷開或連接兩核苷酸之間的磷酸二酯鍵。將目的基因?qū)胫参锸荏w細胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法。目的基因的檢測與鑒定，常利用DNA分子雜交技術等作分子水平的檢測，有時還需進行個體生物學水平的鑒定。 答案：(1)a a (2)基因槍(花粉管通道) (3)目的基因 一定濃度鹽水澆灌(移栽到鹽堿地),