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,單克隆抗體與基因工程抗體的制備,第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 一、雜交瘤技術(shù) 二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存,第二節(jié) 單克隆抗體的制備 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 二、單克隆抗體的純化 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 四、單克隆抗體的特性,第三節(jié) 基因工程抗體制備 一、人源化抗體　 二、小分子抗體 三、抗體融合蛋白 四、雙特異性抗體 五、噬菌體抗體庫技術(shù),第四節(jié) 單克隆抗體的應用 一、檢驗醫(yī)學診斷試劑 二、蛋白質(zhì)的提純 三、小分子抗體的應用 四、抗體融合蛋白的應用 五、雙特異抗體的應用 六、抗體庫技術(shù)的應用和前景,思考題 小結(jié),第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理,雜交瘤技術(shù)原理： 聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細?胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤?細胞系 單克隆抗體生成：接種雜交瘤?細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體,抗體種類： 第一代抗體 多克隆抗體（polyclonal antibody) 第二代抗體 單克隆抗體（monoclonal antibody) 第三代抗體 基因工程抗體（genetic engineering antibody),B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體 骨髓瘤細胞：壽命長 雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體,流 程,一、雜交瘤技術(shù),不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK- 與提供淋巴細胞的動物品系相同,（一）小鼠骨髓瘤細胞,動 物： BALB/c小鼠 7～12周齡 20g～25g體重,（二）免疫脾細胞,細胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫,免疫小鼠,。,淋巴細胞,。,淋巴細胞發(fā)育,。,漿細胞,。,抗原接種,培養(yǎng)液： RPM1640培養(yǎng)液 DMEM培養(yǎng)液,（三）細胞融合,細胞融合劑： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細胞融合劑 作用機理：誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合 作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同,培養(yǎng)骨髓瘤細胞： 選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng) 細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊 避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞 注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中,免疫脾細胞的制備： 1×108的淋巴細胞 無菌手術(shù),飼養(yǎng)細胞： 細胞密度過低不利于細胞生長繁殖 常用小鼠腹腔細胞作飼養(yǎng)細胞 其中MQ還有清除死亡細胞的作用 飼養(yǎng)存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化,。,飼養(yǎng)細胞,骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3) 50% PEG 1min內(nèi)加完; 2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液,融合方法,,,,,,SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2～5 1ml 50%的PEG（無菌，預溫37℃）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用 根據(jù)細胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數(shù)為（0.5～1.5）×105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液,細胞融合,10～20天出現(xiàn)克隆 HAT篩選 挑克隆,融合細胞的早期培養(yǎng),HGPRT酶與TK酶： 次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶 胸腺嘧啶核苷激酶,（四）雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng),應用液： 8-雜氮鳥嘌呤 聚乙二醇,HAT培養(yǎng)基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA,HAT選擇作用： 淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷 骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻,SP2/O: HGPRT- ，TK-;　長命 脾細胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 雜交瘤細胞:HGPRT+ ，TK+; 長命,骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞,雜交瘤細胞： 長期生長繁殖 利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA 從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息 從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力,有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 軟瓊脂平板法(soft agar method),二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存,特點： 不需任何特殊設(shè)備 克隆出現(xiàn)效率高 實驗室常用方法 方法： 細胞懸液通過系列稀釋 每個培養(yǎng)孔含0.5～1個細胞,有限稀釋法,效率最高 價格昂貴,FACS,配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml) + 細胞凍存液(30%～40% 牛血清，50%～60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO ) “慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮? “快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇,雜交瘤細胞的凍存與復蘇,防止污染 避免染色體丟失 防止非分泌細胞的過度生長 防止細胞密度過高而死亡,細胞冷凍的意義,第二節(jié) 單克隆抗體的制備,經(jīng)過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。,一、單克隆抗體的產(chǎn)生,動物體內(nèi)誘生方法： 每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只 體外培養(yǎng)法： 中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)? 單抗含量不高，牛血清Ab難以去除,腹腔注射法,前5天進行,預先腹腔注射pristane （1～5）×106細胞 1～3w形成腹水,高滴度腹水,可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法 細胞、亞細胞結(jié)構(gòu)上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細胞）,二、 單克隆抗體的純化,ELISA,ELISA,多頭加樣槍,。,免疫熒光法,鹽析沉淀 親和層析 離子交換層析,McAb的純化,Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法 特異性測定：抗原類似物的交叉反應 效價測定：用腹水或培養(yǎng)液的稀釋度表示? 表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競?爭抑制法，相加指數(shù)法及微機集群分析 親和性測定：測定親和常數(shù)K 雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條 McAb靶抗原分子量：常用western blot,三、 單克隆抗體的性質(zhì)鑒定,四、單克隆抗體的特性,高度特異性 高度的均一性和可重復性 弱凝集反應和不呈現(xiàn)沉淀反應 對環(huán)境敏感性,（一）單克隆抗體的特性,優(yōu)點 ： 在體外“永久”地存活并傳代 用相對不純的抗原，獲得大量高度特異的、均一的抗體。適用于以標記抗體為特點的免疫學分析方法 可用于體內(nèi)的放射免疫顯像和免疫導向治療,（二）單克隆抗體的優(yōu)點與局限性,局限性 ： 固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應強度不如多克隆抗體 制備技術(shù)復雜、費時費工、價格較高,McAb PcAb 抗原要求 可以不純 純度高 得量 高 低 特異性 高 低 　　 穩(wěn)定 　　低 高 沉淀反應 無 有 成本 高 低,McAb與PcAb的比較,McAb and PcAb,第三節(jié) 基因工程抗體制備,基因工程抗體(Genetic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。,將小鼠Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體,一、人源化抗體,方法： 從雜交瘤細胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當表達載體，轉(zhuǎn)染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體 特點： 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力,（一）嵌合抗體,嵌合抗體,定義：指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體 意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療,（二）改型抗體,Fab：抗原結(jié)合片斷 Fv：可變區(qū)片段 ScFv：單鏈可變區(qū)片段 SdAb：單區(qū)抗體,二、小分子抗體,小分子抗體,其它生物活性蛋白融合,三、抗體融合蛋白,許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結(jié)合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯(lián)或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。,四、雙特異性抗體,分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。,化學交聯(lián)BsAb,將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應 (HAMA)，因此不適用于臨床。,細胞工程BsAb,多采用抗體分子片段,如Fab，F(xiàn)v或ScFv,經(jīng)基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優(yōu)越性,五、噬菌體抗體庫技術(shù),用PCR擴增人抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因 克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面 用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。 使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。 抗體庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合 人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人,（一）基本原理和程序,,,,噬菌體抗體庫,從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA； 應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過PCR技術(shù)擴增不同的Ig基因片段； 構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達的噬菌體抗體庫(surface display antibody library)常用載體； 表達載體轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。,構(gòu)建噬菌體抗體庫,模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆 建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNA 通用引物具有人的種屬普遍性 抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性,（二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點,避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 抗體庫的大容量 抗體庫極高的篩選效率 可獲得高親和力的人源化抗體 VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟的過程 所用的抗體基因又來自人體,第四節(jié) 單克隆抗體的應用,檢驗醫(yī)學診斷試劑 蛋白質(zhì)的提純 小分子抗體的應用 抗體融合蛋白的應用 雙特異抗體的應用 抗體庫技術(shù)的應用和前景,病原微生物抗原、抗體的檢測 腫瘤抗原的檢測 免疫細胞及其亞群的的檢測 激素測定 細胞因子的測定,一、檢驗醫(yī)學診斷試劑,病原體測定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形蟲,風疹病毒,巨細胞病毒 ，單純皰疹病毒,細胞表面CD測定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型,激素的測定： 內(nèi)分泌疾病的診斷,藥物測定(TDM)： 抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛,研究工作中的探針： 越來越多未知功能cDNA的克隆 對復雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加,免疫沉淀,二、蛋白質(zhì)的提純,單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質(zhì)（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制備成層析柱。當樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。,MACS,定義： 分子量較小但具有抗原結(jié)合功能的分子片段 優(yōu)點： 分子量小,穿透性強,抗原性低 不含F(xiàn)c段，不會與帶有Fc段受體的細胞結(jié)合，不良反應少 可在原核系統(tǒng)表達及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及時中和及清除毒素,三、小分子抗體的應用,應用： 用于腫瘤的導向治療 腫瘤的影像分布 基因治療 細胞內(nèi)抗體： 在細胞內(nèi)表達 特異性識別某一基因產(chǎn)物 可干擾該基因產(chǎn)物的生物活性 研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,腫瘤的體內(nèi)顯像診斷 單鏈抗體排除速度快，穿透力強，在腫瘤組織中的分布指數(shù)較完整抗體分子高 放射顯像時，放射性核素排除較快，對身體危害程度小，顯像的本底較低 理想的顯像定位診斷載體 病毒的診斷和抗病毒感染 血液性疾病的診斷 白血病的免疫診斷及分型,四、抗體融合蛋白的應用,在體外免疫檢測中的應用 自身紅細胞凝集試驗 快速檢測HBV和HIV病原體等 避免化學交聯(lián)減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感度 用雙特異抗體作為二抗，檢測限達1ng/ml,五、雙特異抗體的應用,在體內(nèi)腫瘤放射免疫顯像診斷中的應用 方法： 雙特異抗體的一只臂結(jié)合靶抗原，一只臂結(jié)合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結(jié)合，利用二次導向系統(tǒng)顯示 特點： 更高的的靈敏度和清晰度,在體內(nèi)免疫治療中的應用 抗體分子可與放射性核素、細胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結(jié)合靶分子后可提供重要輔助功能 雙功能抗體可有效針對低水平的腫瘤相關(guān)抗原，并將細胞毒物質(zhì)輸送到腫瘤細胞 抗體還可與攜帶藥物的脂質(zhì)體、各種PEG偶聯(lián)，從而增強體內(nèi)運輸和藥代動力學,六、抗體庫技術(shù)的應用和前景,在腫瘤體外診斷中的應用 在腫瘤診斷中的應用 在腫瘤治療中的應用,1．雜交瘤技術(shù)是如何問世的？其基本原理是什么？ 2．什么是單克隆抗體？其特性和局限性如何？與多克隆抗 體有何異同？ 3．雜交瘤細胞的克隆方法有哪些？ 4．細胞株凍融的原則是什么？ 5．大量制備單克隆抗體的方法有哪些，各有哪些優(yōu)缺點？ 6．單克隆抗體的性質(zhì)鑒定的方法有哪些？ 7．敘述單克隆抗體的制備流程和應用。 8．敘述基因工程抗體的概念和優(yōu)點。 9．基因工程抗體的種類和應用。 10．抗體庫技術(shù)的原理和特性有哪些？,思考題,小結(jié),雜交瘤單克隆抗體制備技術(shù)的原理是利用聚乙二醇作為細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細?胞與具有在體外不斷繁殖能力的小鼠骨髓瘤細胞融為一?體，在HAT選擇性培養(yǎng)基的作用下，只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經(jīng)過反復的免疫學檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)（克隆化）,最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體,又能不斷繁殖的雜交瘤?細胞系，將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，在其產(chǎn)生的腹水中即可得到高效價的單克隆抗體。,20世紀80年代誕生了應用DNA重組及蛋白工程技術(shù)對編碼抗體基因按不同需要進行改造和裝配，經(jīng)導入適當?shù)氖荏w細胞后重新表達的抗體，稱為基因工程抗體，它具有如下優(yōu)點：①通過基因工程技術(shù)的改造，可以降低甚至消除人體對抗體的排斥反應；②基因工程抗體的分子量較小，可以部分降低抗體的鼠源性，更有利于穿透血管壁，進入病灶的核心部位；③根據(jù)治療的需要，制備新型抗體；④可以采用原核細胞、真核細胞和植物等多種表達形式，大量表達抗體分子，大大降低了生產(chǎn)成本。,