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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備,史須,北京大學(xué)人類疾病基因研究中心,基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué),基因組學(xué)：,蛋白質(zhì)組學(xué)：可視為分子生物學(xué)的大規(guī)模篩選技術(shù)，目的在于歸類細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的整體分布，鑒定并分析感興趣的個(gè)別蛋白，最終闡明它們的關(guān)系與功能。,上述兩種學(xué)科的研究內(nèi)容在互補(bǔ)的水平上研究了細(xì)胞的分子架構(gòu)，又都在各自的水平上提供了增強(qiáng)對方效應(yīng)的信息，因此二者存在有很強(qiáng)的且?guī)в邢到y(tǒng)性相互關(guān)系,。,Applications of,proteomics,Protein identification/characteriza

2、tion,Protein-protein interaction,Post-,translational,modifications,Subcellular,location,Elucidation of pathway,Target validation and toxicology,Drug discovery,蛋白質(zhì)組分析的首要要求,將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。,2-,DE,技術(shù)依然是大多數(shù)蛋白質(zhì)組研究中分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的首選技術(shù)。,生物學(xué)問題的提出,實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品的制備,蛋白樣品的,IEF,和,PAGE,電泳分

3、離,圖像掃描和初步分析,感興趣蛋白點(diǎn)的切取,胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化,質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析,質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對,新,蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn),其它實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證,蛋白信息的初步獲得,蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線,蛋白質(zhì)樣品的制備,雙向電泳,圖像分析,轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白,凝膠中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白質(zhì)質(zhì)量,N,端測序,肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù),肽,指紋圖,數(shù)據(jù)搜索,新的或已知蛋白,蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定,雙向電泳分析中的樣品制備,制備原則,：,應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。,防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。,防止在樣品制備過

4、程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。,完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。,盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。,可溶性樣品,固體組織樣品,細(xì)胞,不同樣品的基本處理方法,樣品的分級(jí)處理,通過采用亞細(xì)胞分級(jí)、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級(jí)抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。,樣品的溶解,是2-,DE,成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。,溶解的目標(biāo)：,1、,樣品中非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個(gè)多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使

5、2-,DE,中出現(xiàn)新的蛋白點(diǎn)，相應(yīng)的表示單個(gè)多肽的點(diǎn)的強(qiáng)度會(huì)下降）；,2、,溶解方法必須允許可能干擾2-,DE,分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；,3、,溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。,增加樣品溶解性的手段,變性劑：,通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。,表面活性劑：,經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑,SDS、,非離子去污劑,Triton X-100,和,NP-40、,兩性離子去污劑,CHAPS、OBG,等。其中,CHAP

6、S,和,SB3-10,最好。,還原劑：,在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的,DTT,或,-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（,TBP）,進(jìn)行還原。,起載體作用的兩性電解質(zhì)：,即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于,PI,點(diǎn)時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。,Carrier,ampholytes,的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時(shí)，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2（,w/v)。,濃度過高會(huì)使,IEF,的速度降低。另外，為了保證實(shí)驗(yàn)的精確性，在選擇不同

7、,pH,范圍的,IPG,膠條時(shí)，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的,pH,值與之相符合。,樣品液的準(zhǔn)備,標(biāo)準(zhǔn)液：,Reagent,Amount,8M urea,47,ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O,50,mM,DTT or,2mM TBP,385,mg or 500ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,2g,0.2%,carrier,ampholytes,See next table,0.0002%,bromophenol,blue,100,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To 50ml,IPG pH Range,Bio-,

8、Lyte Ampholyte,(stock),range,Bio-,Lyte Ampholyte,(stock),Conc.(w/v),Sample Solution Volume,Per 5ml,Sample Solution Volume,Per 50ml,3-10,3/10,40%,25,l,250,l,4-7,4/6,40%,12.5,l,125,l,5/7,40%,12.5,l,125,l,3-6,3/5,40%,25,l,250,l,4/6,40%,12.,l,125,l,5-8,5/8,40%,25,l,250,l,7-10,7/9,40%,12.5,l,125,l,8/10,2

9、0%,25,l,250,l,Suggested Bio-,lyte ampholyte,composition for IPG use,Reagent,Amount,7M urea,4.1,ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H,2,O,2,M,Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,4%CHAPS,200,mg,0.2%,carrier,ampholytes,See table,0.0002%,bromophenol,blue,10,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To 5ml,Mult

10、iple,chaotropic,agent solution preparation,Reagent,Amount,5M urea,2.9,ml of 8.5 stock or 1.5g urea in 3ml H,2,O,2,M,Thiourea,760mg,2mM TBP,50ul of 200mM TBP stock,2%CHAPS,100,mg,2%SB3-10,100mg,0.2%,carrier,ampholytes,See table,40,mM,Tris,24.2mg,0.0002%,bromophenol,blue,10,ul,of 0.1%stock,ddH,2,O,To

11、5ml,Multiple surfactant solution preparation,樣品中核酸的去除,對電泳的影響：,增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。,解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（,SCA）,同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。,亞蛋白質(zhì)組樣品的制備,用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點(diǎn)是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性。,順序抽提法：,根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力

12、的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。,第一步：用,Tris,堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；,第二步：把未溶解的,pellet,用標(biāo)準(zhǔn),IEF,樣品液溶解提取高疏水性蛋白；,第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個(gè)樣品的11%（,W/W）。,特殊樣品的制備,低豐度蛋白的分離：,盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級(jí)窄,pH,膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用,pH,梯度小于2個(gè),pH,單位的,IPG,膠進(jìn)行,窄,pH,范圍的分離。,強(qiáng)堿

13、性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊,pH,梯度的,IPG,膠條（如,pH312、4-12,或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性,IPG,膠（如,pH10-12）,的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性,IPG,膠（如,pH3-12、4-12）,等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。,極端分子量的蛋白質(zhì)：,小于8,kD,和大于200,kD,的蛋白在常規(guī),IPG-2D,上不易看到，這可能是在,Tris,/,glycine,緩沖液中，樣品和游離的,dodelcyl,sulfate ions,持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛

14、狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。,一維固,相,pH,梯度等電聚焦,（,IEF with IPG）：,IPG,膠的材料是,Immobilines,，,為擁有,CH2=CH-CO-NH-R,結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中,R,包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在,pH310,不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計(jì)算后，將適宜的,IPG,試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價(jià)聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成,pH,梯度。通過這種方式生成的,

15、IPG,不會(huì)發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的,IEF,分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。,IPG,膠條的重泡脹,泡脹的實(shí)質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入,IPG,內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的,IEF。,不同的加樣方法和加樣量會(huì)導(dǎo)致最終結(jié)果的差異：,Protean IEF cell、,IPGphor,等集成設(shè)備的使用：,20,mmol,/L DTT,墊片的使用：,溫度的選擇：,蛋白載樣量,影響,IPG,膠條對蛋白載樣量的因素包括：,待分析的蛋白點(diǎn)的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。,電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。,待研究蛋白的豐度：,樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了

16、解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。,IPG,膠條的,pH,范圍：,IPG,膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量,IPG Strip length,Analytical Load,(silver staining),Preparative Load,(,Coom,staining),7cm,10100,g/125,l,200500,ug,/125,l,11,cm,50200,g/185,l,2501000,ug,/185,l,17,cm,100300,g/300,l,13,mg/300,l,IPG IEF,中,pH,梯度的選擇,常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗(yàn)確定。,預(yù)分步收集,細(xì)胞漿,細(xì)胞核,細(xì)胞膜,核糖體及其他特定細(xì)胞成份,細(xì)胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄,pH,范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白,陣列那些亞細(xì)胞定位位置