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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,免疫組織化學(xué),Immunohistochemistry,2021/10/10,1,概念：,免疫組織化學(xué),(Immunohistochemistry,IHC),是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來檢測組織和細胞中某種化學(xué)成分的一門技術(shù),是傳統(tǒng)的免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，也叫原位免疫學(xué)（,In situ immunology,）。,特點或優(yōu)點：,（,1,）特異性強、靈敏度高；,（,2,）可定性、定位、定量觀察；,（,3,）將形態(tài)學(xué)改變與功能和代謝變化結(jié),合起來；,免

2、疫組化概述,2021/10/10,2,IHC,不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括,LM,和,EM,水平）能對組織和細胞進行仔細、客觀觀察的優(yōu)點（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復(fù)染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)反應(yīng)只能定性和定量（離體、液相），而不能定位的缺點。,IHC,則可在原位和固相對染色結(jié)果進行觀察。目前,IHC,的定位可精確到亞微結(jié)構(gòu)水平。,隨著,IHC,技術(shù)的發(fā)展和圖象分析技術(shù)的發(fā)展，,IHC,已進入多標記（雙標記）和定量研究的階段，使,IHC,在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。,IHC,與核酸分子雜交相結(jié)合形成的原位雜交技術(shù)（,in situ hybridization,，,I

3、SH,）,既特異性強、靈敏，又具定位、可視的特點。,2021/10/10,3,IHC,技術(shù)源于免疫熒光術(shù)（,immunofluorescence,IF,），從,1941,年,1950,年,Coons,等用了,10,年首創(chuàng)了,熒光素標記抗體技術(shù),檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙,球菌,，六、七十年代,IF,在科研中占據(jù)著主導(dǎo)地位,1968,年中根一穗（,Nakane,）等創(chuàng)建了,酶標抗體技,術(shù),（,immunoperoxidase,，,IPO,）,鐵蛋白標記,Ab,技術(shù),;,1974,年,Stemberger,改良上述技術(shù)，建立,辣根過氧,化物酶抗體過氧化物酶,（,PAP,）技術(shù)，使免疫,細胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)

4、用,；,一、,IHC,的發(fā)展簡史,2021/10/10,4,80,年代,Hsu,等建立了,ABC,法,之后，免疫金,銀染色,法、半抗原標記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。,90,年代 分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細,胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展；,2000,年 各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組,化技術(shù)成為當今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功 能代謝綜合,研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)各個,學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技,術(shù)之一；,國內(nèi)起步晚，從,70s,開始。,2021/10/10,5,（一）方法學(xué),1.,從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應(yīng)（免疫反應(yīng)）親和反應(yīng)。新的親和物質(zhì)對有：,生物素與卵白素,（,bi

5、otin&avidin),，葡萄球菌,A,蛋白（,SPA,）與,IgG,，凝集素與受體，激素與受體。這些親和對親和力強，且可與多種標記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結(jié)合，由此產(chǎn)生了親和組織化學(xué)（,affinity histochemistry,），,這些方法,特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如,EM,）。,2.,從單一顯示某種物質(zhì)（單標記）顯示多種物質(zhì)（雙標記）。,3.,從,LMEM,（超微結(jié)構(gòu)）：免疫電鏡、膠體金法、金銀法。,4.,從定性定量，圖象分析（,IA,）、流式細胞術(shù)（,FCM,）。,5.IHC,與,ISH,相結(jié)合，可在不同水平檢測,DNA,、,mRN

6、A,、,protein,。,6.,原位,PCR+IHC,可在組織原位通過擴增檢測微量目的,DNA,。,7.,趨于標準化、自動化。,二、,IHC,的現(xiàn)狀和發(fā)展前景,2021/10/10,6,（二）技術(shù)分類,1.,根據(jù)染色方式分成：貼片染色,漂浮染色,2.,根據(jù),Ag-Ab,結(jié)合方式分成：,直接法,間接法,多層法,3.,按標記物的性質(zhì)分成：,免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）,免疫酶技術(shù)（酶標抗體法、橋法、,PAD,法、,ABC,法）,免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色,法、蛋白,A,金法）,2021/10/10,7,（三）標記物,1.,必要性：組織細胞內(nèi),Ag-Ab,結(jié)合反應(yīng)一般是不可,見的，若在鏡

7、下檢測，則必須具有可視性標記物。,2.,常用標記物,熒光素,：最常用的是異硫一氰酸熒光素（,Fluorescein isothiocyanate,，,FITC,）,-,熒光顯,微鏡下呈綠色熒光,;,四乙基羅達明（,rhodamine,RB200,）,-,熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光,酶,：辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶。,生物素,：（,Biotin,）,鐵蛋白金,等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。,其他：如同位素（因涉及污染和防護難一般不用）,2021/10/10,8,（,四,）,IHC,的應(yīng)用,1.,只要是形態(tài)科學(xué)均可采用:包括病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物學(xué)、病原微生物的檢測（病毒、細菌、寄生蟲等）、皮膚病學(xué)、器官

8、移植等。,2.,可用于多種材料：,A.,各種組織（冰凍組織、,formalin,固定組織、石蠟包埋組織兼可）；,B.,各種細胞(穿刺、體液、涂片、血細胞、培養(yǎng)細胞等）。,3.,用于診斷：腫瘤病理學(xué)等（大中醫(yī)院）。,4.,用于科研：臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，尤其是形態(tài)學(xué)專業(yè)研究生常用,IHC,，,或,IHC+,分生技術(shù),；,最近幾年，分子生物學(xué)研究異常活躍，但最終還要歸到形態(tài)上來，用免疫組織化學(xué)方法對所研究的大分子進行定位，進而深入研究其功能。,2021/10/10,9,（一）標本的收集與處理,IHC,染色成功與否及其質(zhì)量如何，除染色方法本身外，對材料的處理也至關(guān)重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片

9、等。,目的：保存好,Ag,的數(shù)量及活性、保持組織細胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。,材料的來源：人體及實驗動物；細胞和組織；新鮮的及固定的。,1,、組織標本的取材與儲存,來源：活檢取材、手術(shù)切除、實驗動物組織等。,要求：要快、要?。?110.4cm,），避免擠壓。,處理：冰凍即用或保存；固定即用或保存。,三、樣品的準備、處理,2021/10/10,10,2,、細胞標本的取材與儲存,來源：血細胞、穿刺細胞、體液細胞等。,處理：細胞多時直接涂片、干燥、固定、染色；,細胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；,對于體外培養(yǎng)細胞：,貼壁生長,細胞（內(nèi)皮,C,、纖,維,C,、神經(jīng),C,等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；,懸浮生

10、長,細胞,需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。,2021/10/10,11,（二）固定（,fixation,）,1,、固定的含義,固定是指以某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類（變性）、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)保持在組織細胞原位，避免,Ag,溶解、擴散、丟失；保持組織細胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。,根據(jù),Ag,對固定劑的耐受性，可將其分為：,不穩(wěn)定,Ag,（如細胞表面,Ag,，不耐甲醛，宜用丙酮）、,半穩(wěn)定,Ag,及穩(wěn)定,Ag,，后二者多為蛋白、肽類、酶類物質(zhì)。,固定有時間性，太短達不到固定目的，太長交聯(lián)過度，封閉,Ag,。,2021/10/10,12,2,、常用固定劑及其用途,1.10%,的,formalin,（

11、,4%,的甲醛,formaldehyde,）：以,pH7.4,的,PBS,配制，,優(yōu)點,：穿透力強、固定快、組織收縮小；,適于,固定蛋白、肽類、酶、糖。,IHC,常用,4%,多聚甲醛,polyformaldehyde,灌注固定及后固定，,時間,46 h,。,2.2.5%,的戊二醛，同上。也可用,2%,戊二醛與,2%,多聚甲醛混合液固定，尤對,超微結(jié)構(gòu),保存好。醛類固定劑的缺點是易封閉抗原，必要時需抗原修復(fù)。,3.70%,的酒精（乙醇），,優(yōu)點,：固定蛋白好，,缺點,：組織收縮嚴重；,時間,：,2h,。,4.70%,丙酮，,優(yōu)點,：滲透快；,缺點,：對形態(tài)保存不好；,用于,對冰凍切片和細胞涂片的

12、固定；,時間,：,10min,。,5.,混合固定液：,Bouin,液：,40%PF250ml,、冰醋酸,50ml,、飽和苦味酸,250ml,；還有,PLP,固定液，較適合免疫組化。,6.,四氧化鋨（,OsO,4,鋨酸）：常用,PBS,配制,1%,鋨酸溶液后固定,1h,，用于免疫組化及電鏡觀察。,有強烈刺激，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作,。,2021/10/10,13,（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片,前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動切片不需此步驟。,切片可分為：,石蠟切片,：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,57m,；,冰凍切片,：浸糖，,20%30%,蔗糖,4,o,C,過夜，減少冰,晶；,OCT,包埋

13、；液氮速凍，減輕組織破,壞。病理切片要薄，,57 m,；腦片通常,3050 m,厚。,振動切片,：不需做任何包埋，固定后的組織可直接,用振動切片機做各種厚度的切片，并在,染色后可進一步制作電鏡標本觀察。,2021/10/10,14,（四）防脫片劑,（,1,）,蛋白甘油，蛋清與甘油,1,：,1,攪拌、過濾、防腐；,（,2,）,1%,的鉻礬明膠涂片；,（,3,）,0.1%,的多聚賴氨酸涂片，晾干備用。,配制時用塑料,瓶而不能用玻璃瓶,；,（,4,）,購買商品化的進口,硅化玻片,；,（,5,）,APES,（氨丙基三乙氧基硅烷），,1,：,50,丙酮稀釋，,浸片,2030,秒，晾干備用；,貼片時要一步

14、到位。,2021/10/10,15,（五）抗原修復(fù),近年興起的新技術(shù)。目的：,暴露被交聯(lián)封閉的,Ag,。主要適用于經(jīng)長期,formalin,固定的標本、石蠟包埋標本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：,（,1,）,微波加熱,切片煮沸,1020min,，室溫自然冷卻，所用溶液有：飽和,NaCL,溶液；,10mMpH 6.0,的枸櫞酸鈉緩沖液；,4M,的尿素等；,pH8.0TBS;,（,2,）高壓鍋處理,將切片放入,10mM,、,pH 6.0,的枸櫞酸鈉緩沖液容器中，置鍋內(nèi)加蓋噴氣,310min,，自然冷卻。,（,3,）酶消化處理,：常用,0.1%,的胰蛋白酶（含,0.1%CaCL,2,，,pH 7

15、.8,）,37,。,C 10min,?；?0.4%,胃蛋白酶,37,。,C 30min;,2021/10/10,16,（一）基本染色方法,熒光素標記抗體：,FITC,、,直接法,TRITC,等,標記抗體法,酶標記抗體：,HRP,、,AP,等,熒光素標記抗體,間接法,酶標記抗體（三步法）,非標記抗體法：,酶橋法、,PAP,法,、,APAAP,法,;,親和組化法：,ABC,法,、,LAB,法、,LsAB,法、,BRAB,法,;,雙重標記：,阻斷法（酸洗,抗）、非阻斷法（連續(xù)染）,四、,免疫組織化學(xué)技術(shù),2021/10/10,17,1,直接法,熒光素直接標記特異性抗體（一抗）上，標記抗體與抗原結(jié)合（

16、在切片上）熒光顯微鏡下觀察檢測抗原。,優(yōu)點,：簡單，時間短，,特異性強。,缺點,：靈敏度低，所,需抗體量大,（不經(jīng)濟）。,應(yīng)用,：基本不用了！,2021/10/10,18,2,間接法,熒光素標記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動物的,IgG,抗體）。,顯色后鏡檢,特點：,1,、敏感性較直接法高,3-4,倍，但,特異性較低,；,2,、不必標記每種一抗，只需標記某一種動物的二抗；,3,、一抗可高度稀釋，節(jié)省一抗，且可用,PBS,代替一抗做空白對照。,2021/10/10,19,3,非標記,Ab,橋法：,“橋法”是酶標記抗體的改進，經(jīng)過三次抗體，其二抗為未標記橋抗體。,（,1,）單橋法,2021/10/10,20,(2),雙橋法,在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，,可增大染色強度。,特別提示：注意動物種屬關(guān)系,特點：,敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結(jié)合的酶不易洗去，背景染色重,。,2021/10/10,21,4,過氧化物酶,抗過氧化物酶法（,Peroxidase anti-,peroxidase method,，簡稱,PAP,法）,是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”，先與第一抗體結(jié)合